一種小金色放線菌發(fā)酵生產(chǎn)春雷霉素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種小金色放線菌發(fā)酵生產(chǎn)春雷霉素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，本發(fā)明確認了小金色放線菌發(fā)酵生產(chǎn)春雷霉素的種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源和最佳配伍比例。特別是培養(yǎng)基中添加了油泥，降低了碳源棉籽油的使用量；發(fā)酵培養(yǎng)基中加入發(fā)酵豆腐干渣，降低了蠶蛹油的用量。利用本發(fā)明中提供的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵控制工藝，能夠提高春雷霉素發(fā)酵單位，降低發(fā)酵成本，并且最大限度的降低原輔料來源不受環(huán)境影響，保證其供應(yīng)充足，實現(xiàn)春雷霉素穩(wěn)定、高效的生產(chǎn)。
【專利說明】
一種小金色放線菌發(fā)酵生產(chǎn)春雷霉素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種小金色放線菌發(fā)酵生產(chǎn)春雷霉素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]春雷霉素是一種由鏈霉菌產(chǎn)生的弱堿性抗菌素，因其產(chǎn)生菌在培養(yǎng)基中分泌金黃色素，故命名為小金色鏈霉素。春雷霉素是農(nóng)醫(yī)兩用抗菌素。
[0003]目前，國內(nèi)春雷霉素的發(fā)酵生產(chǎn)采用三級發(fā)酵模式，該方式存在的主要問題有以下幾點:
I工業(yè)化大生產(chǎn)發(fā)酵水平較低，其發(fā)酵水平維持在10000-12000U/L左右。
[0004]2國內(nèi)缺少春雷霉素完整的發(fā)酵工藝文獻報道，并且相關(guān)的文獻報道以試驗為主，不能夠為大生產(chǎn)模式提供有效地技術(shù)支持。
[0005]3春雷霉素大生產(chǎn)發(fā)酵周期長，一般在170h左右，能耗高。
[0006]4春雷霉素發(fā)酵生產(chǎn)成本較高，產(chǎn)品缺乏市場競爭力。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的就在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種發(fā)酵工藝簡單，有效提高發(fā)酵單位，同時最大限度的降低原輔料對發(fā)酵單位的影響，降低生產(chǎn)成本，且原輔料來源不受環(huán)境影響，保證其供應(yīng)充足，實現(xiàn)春雷霉素穩(wěn)定、高效生產(chǎn)的小金色放線菌發(fā)酵生產(chǎn)春雷霉素的培養(yǎng)基。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供利用上述培養(yǎng)基生產(chǎn)春雷霉素的培養(yǎng)方法。
[0009]為實現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案為:
一種小金色放線菌發(fā)酵生產(chǎn)春雷霉素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，其特征在于包括一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述一級種子培養(yǎng)基的組成為:
棉籽油4?8ml/L、油泥3?7g/L、淀粉7?1]^凡、棉籽餅粉11?158凡、蠶蛹油4?8!111凡、玉米楽ll_15ml/L、硫酸錢0.4?0.8g/L、輕質(zhì)碳酸|丐1?5g/L;
所述二級種子培養(yǎng)基的組成為:
棉籽油7?12ml/L、油泥3?7g/L、淀粉11?15g/L、棉籽餅粉13?15g/L、花生餅粉11?15區(qū)凡、蠶蛹油6?10!111凡、玉米楽13-171111凡、硫酸錢0.5?0.98凡、輕質(zhì)碳酸|丐1?5區(qū)凡；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:
棉籽油9?13ml/L、油泥4?8g/L、淀粉13?17g/L、棉籽餅粉14?18g/L、花生餅粉15?19區(qū)/1^、蠶蛹油8?12!111凡、發(fā)酵豆腐干渣3-78凡、玉米楽16-201111/1^、硫酸錢0.6?]^凡、輕質(zhì)碳酸鈣2?6g/L、磷酸二氫鉀0.07?0.Ilg/L、硫酸鎂0.02?0.06g/L、硫酸鎳0.006?0.0lg/L、氯化鈉0.02?0.06g/L、聚醚改性硅油0.5?0.9ml/L、月桂醇聚氧乙烯醚0.01?0.05g/L0
[0010]所述油泥是指加工菜籽油時的沉淀物。
[0011]—種利用上述培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)春雷霉素的培養(yǎng)方法，其特征在于工藝步驟為:
O一級種子培養(yǎng):首先將一級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至20?25°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的小金色放線菌母瓶發(fā)酵液按照2?3L/m3的接種量接入一級種子培養(yǎng)基中進行一級種子培養(yǎng)，至菌體濃度28?32%、培養(yǎng)時間22?24h移種；
2)二級種子培養(yǎng):首先將二級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至20?25°C，并用無菌空氣保壓，將已經(jīng)培養(yǎng)好的一級種子培養(yǎng)基移入二級種子培養(yǎng)基中進行二級種子培養(yǎng)，至菌體濃度35?39%、培養(yǎng)時間20?22h時移入發(fā)酵培養(yǎng)基；
3)發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至20?25°C，并用無菌空氣保壓，然后將培養(yǎng)好的二級種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，至菌體濃度35?39%、發(fā)酵周期不超過160h，化學(xué)效價>15000u/ml終止發(fā)酵。
[0012]所述一級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為:氨基氮30?40mg/L、溶磷120?140ug/ml、脂肪6?8g/L;
所述二級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為:氨基氮40?50mg/L、溶磷100?120ug/ml、脂肪9?llg/L;
所述發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為:氨基氮50?60mg/L、溶磷30?50ug/ml、脂肪14?16g/L。
[0013]所述培養(yǎng)好的小金色放線菌母瓶發(fā)酵液質(zhì)量要求為:菌體濃度20?30%;鏡檢無雜菌。
[0014]所述一級種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量:20?40m3/h ；攬摔轉(zhuǎn)速 60 ?80r/ min。
[0015]所述二級種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.05MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量40?60m3/h;攬摔轉(zhuǎn)速 70 ?90r/min。
[0016]所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在6?7; b溫度:培養(yǎng)溫度27?28 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在110-120r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:200?300m3/h， h溶氧控制:
發(fā)酵前60h內(nèi)，不控制溶氧，
61?140h，溶氧控制在40%以上，
141?發(fā)酵結(jié)束:溶氧控制在30%以上。
[0017]在發(fā)酵過程中采用流加法進行補料，補料包括補菜籽油、補水、補硫酸銨、補蠶蛹油和pH控制，其中
a補菜籽油工藝控制:
發(fā)酵時間60?100h，當(dāng)脂肪含量低于5g/L時，補入菜籽油，控制發(fā)酵液中脂肪含量在5?7g/L， 發(fā)酵時間101?140h，當(dāng)脂肪含量低于2g/L時，補入菜籽油，控制發(fā)酵液中含量在2?3g/L；
b補水工藝控制:
發(fā)酵前60h不用進行補水，
發(fā)酵時間在61?100h，當(dāng)菌體濃度高于45%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在40?45%，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度，
發(fā)酵時間在1lh?發(fā)酵結(jié)束，當(dāng)菌體濃度高于40%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在35?40%，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度；c發(fā)酵過程pH控制工藝:
發(fā)酵前60h，pH不進行控制，
發(fā)酵時間在61?120h，若pH<6.0，采用流加法加入10?20%的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH至6?8，若pH> 8，采用流加法加入30%的硫酸溶液，調(diào)節(jié)pH至6?8，d補入蠶蛹油:
發(fā)酵前60h，氨基氮含量不進行控制，
發(fā)酵時間61h?100h，當(dāng)氨基氮含量低于30mg/L，補入已滅菌的蠶蛹油溶液，使氨基氮的含量控制在30?40mg/L，
發(fā)酵時間1lh至發(fā)酵結(jié)束，當(dāng)氨基氮含量低于5mg/L，補入已滅菌的蠶蛹油溶液，使氨基氮的含量控制在5?10mg/L;e補硫酸錢:
在發(fā)酵80h和120h時補入10%的硫酸銨溶液，其用量控制在發(fā)酵液體積的0.01?0.03% ο
[0018]本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢體現(xiàn)在:
I本發(fā)明確認了小金色放線菌發(fā)酵生產(chǎn)春雷霉素的種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源和最佳配伍比例。特別是培養(yǎng)基中添加了油泥，降低了碳源棉籽油的使用量;發(fā)酵培養(yǎng)基中加入發(fā)酵豆腐干渣，降低了蠶蛹油的用量。培養(yǎng)基中的碳源、氮源含有春雷霉素生物合成過程中所需的關(guān)鍵物質(zhì)，保證了春雷霉素的發(fā)酵技術(shù)效果。
[0019]2本發(fā)明對種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)的工藝進行了詳細的闡述，確認了春雷霉素最佳的發(fā)酵工藝和控制參數(shù)。通過本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)春雷霉素，其發(fā)酵單位達到15000u/ml以上，同國內(nèi)技術(shù)相比，發(fā)酵單位提高了20%以上;發(fā)酵周期控制在160h以內(nèi)，降低了發(fā)酵能耗。
[0020]3本發(fā)明適用于工業(yè)化規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)春雷霉素。
[0021 ]具體實施方法
下面用實例予以說明本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，實例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的范圍與核心內(nèi)容依據(jù)權(quán)利要求書加以確定。
[0022]下述實施例的菌種選用小金色放線菌:生產(chǎn)使用的菌種來源為母瓶發(fā)酵液。母瓶發(fā)酵液質(zhì)量要求為:菌體濃度20?30%;鏡檢無雜菌。
[0023]發(fā)酵豆腐干渣來源:寧夏金夏食品有限公司。發(fā)酵豆腐渣干為豆腐生產(chǎn)后的殘渣的發(fā)酵產(chǎn)物。目前，各種食品廠糟渣特別是豆腐渣含有豐富的營養(yǎng)，被處理之后利用具有很大的經(jīng)濟效益。發(fā)酵過程中分泌與合成的大量活菌、蛋白質(zhì)、氨基酸、各種生化酶、促生長因子等營養(yǎng)與激素類物質(zhì)。
[0024]所述油泥是指加工菜籽油時的沉淀物。
[0025]實施例1
一級種子培養(yǎng):一級種子培養(yǎng)基體積Im3。
[0026]一級種子培養(yǎng)基:
棉籽油4L、油泥3kg、淀粉7 kg、棉籽餅粉11kg、蠶蛹油4L、玉米楽11L、硫酸錢0.4 kg、輕質(zhì)碳酸I1Slkg。
[0027]一級種子培養(yǎng):首先將一級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至20 V，并用無菌空氣保壓，一級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮30mg/L、溶磷120ug/ml、脂肪6g/L。然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的小金色放線菌母瓶發(fā)酵液按照2/m3的接種量接入一級種子培養(yǎng)基中進行一級種子培養(yǎng)，一級種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量:20m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速60r/min ；至菌體濃度28%、培養(yǎng)時間22h移種。
[0028]二級種子培養(yǎng):二級種子培養(yǎng)基體積10m3。
[0029]二級種子培養(yǎng)基:
棉籽油70L、油泥30 kg、淀粉110 kg、棉籽餅粉130kg、花生餅粉110 kg、蠶蛹油60L、玉米楽130L、硫酸錢5 kg、輕質(zhì)碳酸I1^lOkg。
[0030]二級種子培養(yǎng):首先將二級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至20 V，并用無菌空氣保壓，二級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮40mg/L、溶磷100ug/ml、脂肪9g/L。二級種子培養(yǎng)條件:罐壓0.03?0.05MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量40m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速70r/min ；將已經(jīng)培養(yǎng)好的一級種子培養(yǎng)基移入二級種子培養(yǎng)基中進行二級種子培養(yǎng)，至菌體濃度35%、培養(yǎng)時間20h時移入發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0031 ]發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基體積100m3。
[0032]發(fā)酵培養(yǎng)基:
棉籽油900L、油泥400kg、淀粉1300kg、棉籽餅粉1400kg、花生餅粉1500 kg、蠶蛹油800L、發(fā)酵豆腐干渣300kg、玉米漿1600L、硫酸銨60kg、輕質(zhì)碳酸鈣200kg、磷酸二氫鉀7kg、硫酸鎂2kg、硫酸鎳0.6kg、氯化鈉2kg、聚醚改性硅油50L、月桂醇聚氧乙烯醚I kg。
[0033]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至20V，并用無菌空氣保壓，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮50mg/L、溶磷30ug/ml、脂肪14g/L。然后將培養(yǎng)好的二級種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0034]發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在6?7; b溫度:培養(yǎng)溫度27?28 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在110r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:200m3/h， h溶氧控制:
發(fā)酵前60h內(nèi)，不控制溶氧，
61?140h，溶氧控制在40%以上，
141?發(fā)酵結(jié)束:溶氧控制在30%以上
發(fā)酵結(jié)束，菌體濃度35%、發(fā)酵周期154h、化學(xué)效價15085u/ml。
[0035]實施例2
一級種子培養(yǎng):一級種子培養(yǎng)基體積Im3。
[0036]一級種子培養(yǎng)基:
棉籽油5L、油泥4kg、淀粉8kg、棉籽餅粉12kg、蠶蛹油5L、玉米楽12L、硫酸錢0.5kg、輕質(zhì)碳酸。
[0037]一級種子培養(yǎng):首先將一級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至21V，并用無菌空氣保壓，一級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮32mg/L、溶磷126ug/ml、脂肪6.5g/L。然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的小金色放線菌母瓶發(fā)酵液按照2.2/m3的接種量接入一級種子培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，一級種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29 V ；空氣流量:25m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速65r/min ；至菌體濃度29%、培養(yǎng)時間22.5h移種。
[0038]二級種子培養(yǎng):二級種子培養(yǎng)基體積10m3。
[0039]二級種子培養(yǎng)基:
棉籽油80L、油泥40 kg、淀粉120 kg、棉籽餅粉140kg、花生餅粉120 kg、蠶蛹油70L、玉米楽140L、硫酸錢6kg、輕質(zhì)碳酸I11^Okg。
[0040]二級種子培養(yǎng):首先將二級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至20 V，并用無菌空氣保壓，二級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮43mg/L、溶磷107ug/ml、脂肪9.6g/L。二級種子培養(yǎng)條件:罐壓0.03?0.05MPa ；罐溫28?29 °C ；空氣流量45m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速75r/min ；將已經(jīng)培養(yǎng)好的一級種子培養(yǎng)基移入二級種子培養(yǎng)基中進行二級種子培養(yǎng)，至菌體濃度36%、培養(yǎng)時間20.5h時移入發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0041 ]發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基體積10m3。
[0042]發(fā)酵培養(yǎng)基:
棉籽油1000L、油泥500kg、淀粉1400kg、棉籽餅粉1500kg、花生餅粉1600 kg、蠶蛹油900L、發(fā)酵豆腐干渣400 kg、玉米漿1700L、硫酸銨70kg、輕質(zhì)碳酸鈣300kg、磷酸二氫鉀8kg、硫酸鎂3kg、硫酸鎳0.7kg、氯化鈉3kg、聚醚改性硅油60L、月桂醇聚氧乙烯醚2kg。
[0043]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至21°C，并用無菌空氣保壓，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮52mg/L、溶磷36ug/ml、脂肪14.4g/L。然后將培養(yǎng)好的二級種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0044]發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在6?7; b溫度:培養(yǎng)溫度27?28 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在113r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:230m3/h， h溶氧控制:
發(fā)酵前60h內(nèi)，不控制溶氧，
61?140h，溶氧控制在40%以上，
141?發(fā)酵結(jié)束:溶氧控制在30%以上發(fā)酵結(jié)束，菌體濃度36%、發(fā)酵周期155h、化學(xué)效價15132u/ml。
[0045]實施例3
一級種子培養(yǎng):一級種子培養(yǎng)基體積Im3。
[0046]一級種子培養(yǎng)基:
棉籽油6L、油泥5kg、淀粉9kg、棉籽餅粉13kg、蠶蛹油6L、玉米楽13L、硫酸錢0.6kg、輕質(zhì)碳酸。
[0047]一級種子培養(yǎng):首先將一級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至22 V，并用無菌空氣保壓，一級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮351^/1、溶磷131呢/1111、脂肪7.18/匕然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的小金色放線菌母瓶發(fā)酵液按照2.5/m3的接種量接入一級種子培養(yǎng)基中進行一級種子培養(yǎng)，一級種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量:30m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速70r/min ；至菌體濃度30%、培養(yǎng)時間23h移種。
[0048]二級種子培養(yǎng):二級種子培養(yǎng)基體積10m3。
[0049]二級種子培養(yǎng)基:
棉籽油90L、油泥50 kg、淀粉130 kg、棉籽餅粉150kg、花生餅粉130 kg、蠶蛹油80L、玉米楽150L、硫酸錢7kg、輕質(zhì)碳酸|i530kg。
[0050]二級種子培養(yǎng):首先將二級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至22 V，并用無菌空氣保壓，二級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮45mg/L、溶磷lllug/ml、脂肪10g/L。二級種子培養(yǎng)條件:罐壓0.03?0.05MPa ；罐溫28?29 °C ；空氣流量50m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速80r/min ；將已經(jīng)培養(yǎng)好的一級種子培養(yǎng)基移入二級種子培養(yǎng)基中進行二級種子培養(yǎng)，至菌體濃度37%、培養(yǎng)時間21h時移入發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0051 ]發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基體積10m3。
[0052]發(fā)酵培養(yǎng)基:
棉籽油1100L、油泥600kg、淀粉1500kg、棉籽餅粉1600kg、花生餅粉1700 kg、蠶蛹油1000L、發(fā)酵豆腐干渣500 kg、玉米漿1800L、硫酸銨80kg、輕質(zhì)碳酸鈣400kg、磷酸二氫鉀9kg、硫酸鎂4kg、硫酸鎳0.8kg、氯化鈉4kg、聚醚改性娃油70L、月桂醇聚氧乙稀醚3kg。
[0053]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至22°C，并用無菌空氣保壓，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮551^/1、溶磷411^/1111、脂肪15.18/1。然后將培養(yǎng)好的二級種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0054]發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在6?7; b溫度:培養(yǎng)溫度27?28 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在113r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:250m3/h， h溶氧控制:
發(fā)酵前60h內(nèi)，不控制溶氧，
61?140h，溶氧控制在40%以上，
141?發(fā)酵結(jié)束:溶氧控制在30%以上發(fā)酵結(jié)束，菌體濃度37%、發(fā)酵周期156h、化學(xué)效價15216u/ml。
[0055]實施例4
一級種子培養(yǎng):一級種子培養(yǎng)基體積Im3。
[0056]一級種子培養(yǎng)基:
棉籽油7L、油泥6kg、淀粉10kg、棉籽餅粉14kg、蠶蛹油7L、玉米楽14L、硫酸錢0.7kg、輕質(zhì)碳酸I11Hkgc3
[0057]一級種子培養(yǎng):首先將一級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至24°C，并用無菌空氣保壓，一級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮37mg/L、溶磷136ug/ml、脂肪7.5g/L。然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的小金色放線菌母瓶發(fā)酵液按照2.7/m3的接種量接入一級種子培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，一級種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29 V ；空氣流量:35m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速75r/min ；至菌體濃度31%、培養(yǎng)時間23.5h移種。
[0058]二級種子培養(yǎng):二級種子培養(yǎng)基體積10m3。
[0059]二級種子培養(yǎng)基:
棉籽油100L、油泥60 kg、淀粉140 kg、棉籽餅粉160kg、花生餅粉140 kg、蠶蛹油90L、玉米楽160L、硫酸錢8kg、輕質(zhì)碳酸I11HOkgc
[0060]二級種子培養(yǎng):首先將二級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至24°C，并用無菌空氣保壓，二級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮47mg/L、溶磷116ug/ml、脂肪10.4g/L。二級種子培養(yǎng)條件:罐壓0.03?0.05MPa ；罐溫28?29 °C ；空氣流量55m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速85r/min ；將已經(jīng)培養(yǎng)好的一級種子培養(yǎng)基移入二級種子培養(yǎng)基中進行二級種子培養(yǎng)，至菌體濃度38%、培養(yǎng)時間21.5h時移入發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0061 ]發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基體積10m3。
[0062]發(fā)酵培養(yǎng)基:
棉籽油1200L、油泥700kg、淀粉1600kg、棉籽餅粉1700kg、花生餅粉1800 kg、蠶蛹油1100L、發(fā)酵豆腐干渣600 kg、玉米漿1900L、硫酸銨90kg、輕質(zhì)碳酸鈣500kg;磷酸二氫鉀
IOkg、硫酸鎂5kg、硫酸鎳0.9kg、氯化鈉5kg、聚醚改性娃油80L、月桂醇聚氧乙稀醚4kg。
[0063]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至24°C，并用無菌空氣保壓，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮57mg/L、溶磷46ug/ml、脂肪15.5g/L。然后將培養(yǎng)好的二級種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0064]發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在6?7; b溫度:培養(yǎng)溫度27?28 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在113r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:270m3/h， h溶氧控制:
發(fā)酵前60h內(nèi)，不控制溶氧，
61?140h，溶氧控制在40%以上，
141?發(fā)酵結(jié)束:溶氧控制在30%以上發(fā)酵結(jié)束，菌體濃度38%、發(fā)酵周期157h、化學(xué)效價15183u/ml。
[0065]實施例5
一級種子培養(yǎng):一級種子培養(yǎng)基體積Im3。
[0066]一級種子培養(yǎng)基:
棉籽油8L、油泥7kg、淀粉I lkg、棉籽餅粉15kg、蠶蛹油8L、玉米楽15L、硫酸錢0.8kg、輕質(zhì)碳酸Ii5kg。
[0067]一級種子培養(yǎng):首先將一級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至25 V，并用無菌空氣保壓，一級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮40mg/L、溶磷140ug/ml、脂肪8g/L。然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的小金色放線菌母瓶發(fā)酵液按照3/m3的接種量接入一級種子培養(yǎng)基中進行一級種子培養(yǎng)，一級種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量:40m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速80r/min ；至菌體濃度32%、培養(yǎng)時間24h移種。
[0068]二級種子培養(yǎng):二級種子培養(yǎng)基體積10m3。
[0069]二級種子培養(yǎng)基:
棉籽油110L、油泥70 kg、淀粉150 kg、棉籽餅粉170kg、花生餅粉150 kg、蠶蛹油100L、玉米楽170L、硫酸錢9kg、輕質(zhì)碳酸I3^Okg。
[0070]二級種子培養(yǎng):首先將二級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至25 V，并用無菌空氣保壓，二級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮50mg/L、溶磷120ug/ml、脂肪llg/L。二級種子培養(yǎng)條件:罐壓0.03?0.05MPa ；罐溫28?29 °C ；空氣流量60m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速90r/min ；將已經(jīng)培養(yǎng)好的一級種子培養(yǎng)基移入二級種子培養(yǎng)基中進行二級種子培養(yǎng)，至菌體濃度39%、培養(yǎng)時間22h時移入發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0071 ]發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基體積10m3。
[0072]發(fā)酵培養(yǎng)基:
棉籽油1300L、油泥800kg、淀粉1700kg、棉籽餅粉1800kg、花生餅粉1900 kg、蠶蛹油1200L、發(fā)酵豆腐干渣700 kg、玉米漿2000L、硫酸銨100kg、輕質(zhì)碳酸鈣600kg;磷酸二氫鉀
Ilkg、硫酸鎂6kg、硫酸鎳lkg、氯化鈉6kg、聚醚改性娃油90L、月桂醇聚氧乙稀醚5kg。
[0073]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至25°C，并用無菌空氣保壓，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮60mg/L、溶磷50ug/ml、脂肪20g/L。然后將培養(yǎng)好的二級種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0074]發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在6?7; b溫度:培養(yǎng)溫度27?28 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在113r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:300m3/h， h溶氧控制:
發(fā)酵前60h內(nèi)，不控制溶氧，
61?140h，溶氧控制在40%以上，
141?發(fā)酵結(jié)束:溶氧控制在30%以上
發(fā)酵結(jié)束，菌體濃度39%、發(fā)酵周期159h、化學(xué)效價15073u/ml。
[0075]上述實施例1-5的發(fā)酵過程中，根據(jù)檢測情況，采用流加法進行補料，補料包括補菜籽油、補水、補硫酸錢、補蠶蛹油和pH控制，其中
其中
a補菜籽油工藝控制:
發(fā)酵時間60?100h，當(dāng)脂肪含量低于5g/L時，補入菜籽油，控制發(fā)酵液中脂肪含量在5?7g/L，
發(fā)酵時間101?140h，當(dāng)脂肪含量低于2g/L時，補入菜籽油，控制發(fā)酵液中含量在2?3g/L；
b補水工藝控制:
發(fā)酵前60h不用進行補水，
發(fā)酵時間在61?100h，當(dāng)菌體濃度高于45%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在40?45%，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度，
發(fā)酵時間在1lh?發(fā)酵結(jié)束，當(dāng)菌體濃度高于40%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在35?40%，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度；c發(fā)酵過程pH控制工藝:
發(fā)酵前60h，pH不進行控制，
發(fā)酵時間在61?120h，若pH<6.0，采用流加法加入10?20%的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH至6?8，若pH> 8，采用流加法加入30%的硫酸溶液，調(diào)節(jié)pH至6?8，d補入蠶蛹油:
發(fā)酵前60h，氨基氮含量不進行控制，
發(fā)酵時間61h?100h，當(dāng)氨基氮含量低于30mg/L，補入已滅菌的蠶蛹油溶液，使氨基氮的含量控制在30?40mg/L，
發(fā)酵時間1lh至發(fā)酵結(jié)束，當(dāng)氨基氮含量低于5mg/L，補入已滅菌的蠶蛹油溶液，使氨基氮的含量控制在5?10mg/L;e補硫酸錢:
在發(fā)酵80h和120h時補入10%的硫酸銨溶液，其用量控制在發(fā)酵液體積的0.01?0.03% ο
[0076]對比實施例(培養(yǎng)工藝及控制參數(shù)依據(jù)實施例3)
一級種子培養(yǎng):一級種子培養(yǎng)基體積Im3。
[0077]一級種子培養(yǎng)基:
玉米油7L、玉米淀粉6kg、黃豆餅粉13kg、麥芽提取物6 kg、蛋白胨15kg、硫酸錢0.6kg、輕質(zhì)碳酸Ii3kg。
[0078]一級種子培養(yǎng):首先將一級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至22 V，并用無菌空氣保壓，一級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮42mg/L、溶磷154ug/ml、脂肪9.4g/L。然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的小金色放線菌母瓶發(fā)酵液按照2.5/m3的接種量接入一級種子培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，一級種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29 V ；空氣流量:30m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速70r/min ；至菌體濃度28%、培養(yǎng)時間26h移種。
[0079]二級種子培養(yǎng):二級種子培養(yǎng)基體積10m3。
[0080]二級種子培養(yǎng)基:
玉米油80L、玉米淀粉65kg、黃豆餅粉140kg、麥芽提取物70kg、蛋白胨160kg、硫酸錢6kg、輕質(zhì)碳酸I3HOkg。
[0081 ] 二級種子培養(yǎng):首先將二級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至22 V，并用無菌空氣保壓，二級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮57.8mg/L、溶磷131ug/ml、脂肪12.7g/L。二級種子培養(yǎng)條件:罐壓0.03?0.05MPa ；罐溫28?29 V ；空氣流量50m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速80r/min ；將已經(jīng)培養(yǎng)好的一級種子培養(yǎng)基移入二級種子培養(yǎng)基中進行二級種子培養(yǎng)，至菌體濃度36%、培養(yǎng)時間23h時移入發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0082 ]發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基體積I OOm3。
[0083]發(fā)酵培養(yǎng)基:
玉米油900L、玉米淀粉780kg、黃豆餅粉1500kg、麥芽提取物800kg、蛋白胨1700kg、硫酸錢60kg、輕質(zhì)碳酸I11HOOkgc3磷酸二氫鉀9kg、硫酸鎂4kg、氯化鈉4kg、消泡劑娃油60L。
[0084]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至22°C，并用無菌空氣保壓，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮60.2mg/L、溶磷89ug/ml、脂肪18.3g/L。然后將培養(yǎng)好的二級種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0085]發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在6?7; b溫度:培養(yǎng)溫度27?28 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在113r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:250m3/h， h溶氧控制:
發(fā)酵前60h內(nèi)，不控制溶氧，
61?140h，溶氧控制在40%以上，
141?發(fā)酵結(jié)束:溶氧控制在30%以上
發(fā)酵結(jié)束，菌體濃度35%、發(fā)酵周期162h、化學(xué)效價10480u/ml。
【主權(quán)項】
1.一種小金色放線菌發(fā)酵生產(chǎn)春雷霉素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，其特征在于包括一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其中 所述一級種子培養(yǎng)基的組成為: 棉籽油4?8ml/L、油泥3?7g/L、淀粉7?llg/L、棉籽餅粉11?15g/L、蠶蛹油4?8ml/L、玉米楽ll_15ml/L、硫酸錢0.4?0.8g/L、輕質(zhì)碳酸|丐1?5g/L; 所述二級種子培養(yǎng)基的組成為: 棉籽油7?12ml/L、油泥3?7g/L、淀粉11?15g/L、棉籽餅粉13?15g/L、花生餅粉11?15區(qū)凡、蠶蛹油6?10!111凡、玉米楽13-171111凡、硫酸錢0.5?0.98凡、輕質(zhì)碳酸|丐1?5區(qū)凡； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為: 棉籽油9?13ml/L、油泥4?8g/L、淀粉13?17g/L、棉籽餅粉14?18g/L、花生餅粉15?19g/L、蠶蛹油8?12ml/L、發(fā)酵豆腐干渣3_7g/L、玉米楽16_20ml/L、硫酸錢0.6?lg/L、輕質(zhì)碳酸鈣2?6g/L、磷酸二氫鉀0.07?0.Ilg/L、硫酸鎂0.02?0.06g/L、硫酸鎳0.006?0.0lg/L、氯化鈉0.02?0.06g/L、聚醚改性硅油0.5?0.9ml/L、月桂醇聚氧乙烯醚0.01?0.05g/L02.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述油泥是指加工菜籽油時的沉淀物。3.—種利用權(quán)利要求1或2所述培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)春雷霉素的培養(yǎng)方法，其特征在于工藝步驟為: O一級種子培養(yǎng):首先將一級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至20?25°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的小金色放線菌母瓶發(fā)酵液按照2?3L/m3的接種量接入一級種子培養(yǎng)基中進行一級種子培養(yǎng)，至菌體濃度28?32%、培養(yǎng)時間22?24h移種； 2)二級種子培養(yǎng):首先將二級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至20?25°C，并用無菌空氣保壓，將已經(jīng)培養(yǎng)好的一級種子培養(yǎng)基移入二級種子培養(yǎng)基中進行二級種子培養(yǎng)，至菌體濃度35?39%、培養(yǎng)時間20?22h時移入發(fā)酵培養(yǎng)基； 3)發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至20?25°C，并用無菌空氣保壓，然后將培養(yǎng)好的二級種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，至菌體濃度35?39%、發(fā)酵周期不超過160h，化學(xué)效價>15000u/ml終止發(fā)酵。4.按照權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述一級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為:氨基氮30?40mg/L、溶磷120?140ug/ml、脂肪6?8g/L; 所述二級種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為:氨基氮40?50mg/L、溶磷100?120ug/ml、脂肪9?llg/L; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為:氨基氮50?60mg/L、溶磷30?50ug/ml、脂肪14?16g/L。5.按照權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)好的小金色放線菌母瓶發(fā)酵液質(zhì)量要求為:菌體濃度20?30%;鏡檢無雜菌。6.按照權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述一級種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量:20?40m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速60?80r/min。7.按照權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述二級種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.05MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量40?60m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速70?90r/min。8.按照權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為: a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在6?7; b溫度:培養(yǎng)溫度27?28 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在110-120r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7； f空氣流量:200?300m3/h， h溶氧控制: 發(fā)酵前60h內(nèi)，不控制溶氧， 61?140h，溶氧控制在40%以上， 141?發(fā)酵結(jié)束:溶氧控制在30%以上。9.按照權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述發(fā)酵過程中采用流加法進行補料，補料包括補菜籽油、補水、補硫酸錢、補蠶蛹油和pH控制，其中a補菜籽油工藝控制: 發(fā)酵時間60?100h，當(dāng)脂肪含量低于5g/L時，補入菜籽油，控制發(fā)酵液中脂肪含量在5?7g/L， 發(fā)酵時間101?140h，當(dāng)脂肪含量低于2g/L時，補入菜籽油，控制發(fā)酵液中含量在2?.3g/L； b補水工藝控制: 發(fā)酵前60h不用進行補水， 發(fā)酵時間在61?10h，當(dāng)菌體濃度高于45%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在.40?45%，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度， 發(fā)酵時間在1lh?發(fā)酵結(jié)束，當(dāng)菌體濃度高于40%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在35?40%，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度；c發(fā)酵過程pH控制工藝: 發(fā)酵前60h，pH不進行控制， 發(fā)酵時間在61?120h，若pH<6.0，采用流加法加入10?20%的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH至6?.8，若pH> 8，采用流加法加入30%的硫酸溶液，調(diào)節(jié)pH至6?8，d補入蠶蛹油: 發(fā)酵前60h，氨基氮含量不進行控制， 發(fā)酵時間61h?100h，當(dāng)氨基氮含量低于30mg/L，補入已滅菌的蠶蛹油溶液，使氨基氮的含量控制在30?40mg/L， 發(fā)酵時間1lh至發(fā)酵結(jié)束，當(dāng)氨基氮含量低于5mg/L，補入已滅菌的蠶蛹油溶液，使氨基氮的含量控制在5?10mg/L;e補硫酸錢: 在發(fā)酵80h和120h時補入10%的硫酸銨溶液，其用量控制在發(fā)酵液體積的0.01?0.03% ο
【文檔編號】C12R1/465GK106011201SQ201610504641
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月1日
【發(fā)明人】任勇, 王雋梅
【申請人】寧夏泰瑞制藥股份有限公司