從人多能干細胞定向分化星形膠質(zhì)細胞用于肌萎縮側(cè)索硬化(als)的治療和藥物篩選的制作方法【專利摘要】本發(fā)明公開了使用離體分化的多能干細胞(PSC)鑒定影響人星形膠質(zhì)細胞功能性的劑的方法。此外，亦公開了人祖星形膠質(zhì)細胞或人星形膠質(zhì)細胞用于在受試人中治療肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的用途。【專利說明】從人多能干細胞定向分化星形膠質(zhì)細胞用于肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的治療和藥物篩選[0001]發(fā)明領(lǐng)域及背景本發(fā)明在其一些實施方案中涉及使用離體分化的多能干細胞(PSC)鑒定影響人星形膠質(zhì)細胞功能性的劑的方法。此外，亦提供人星形膠質(zhì)細胞用于治療肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的用途。[0002]ALS為運動神經(jīng)元（MN)疾病，以喪失上下MN為特征（Moloney等，F(xiàn)rontNeurosci2014，8:252)。其對美國約30,000個體，全球約150,000個患者以及以色列約400個體產(chǎn)生影響。5-10%的ALS病例為家族性ALS，但是大多數(shù)ALS病例為偶發(fā)性的，原因不明。攜帶ALS相關(guān)的突變型人S0D1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠和大鼠重現(xiàn)所述人類疾病的許多特征。重點注意的是，迄今為止，除了一種FDA獲準的化合物，力如太(利魯唑）之外，再無可用的有效治療，所述化合物僅將壽命延長最多三個月。[0003]ALS在已發(fā)生顯著細胞損失的時候被診斷出。MN軸突的長度長至一米。所述MN軸突將細胞體與其靶標(肌肉）連接。在MN替代療法之后恰當?shù)刂亟?rewire)并確保功能連接的能力，仍為具有不確定結(jié)果的令人畏縮的任務(wù)，并且迄今為止未證實這在人類中將是可能的。因此，在診斷之后嘗試避免進一步的細胞損失，將對MN存活以及患者的生活質(zhì)量和壽命具有顯著影響。[0004]然而，ALS中的細胞異常不限于MN。在ALS患者(偶發(fā)性ALS(sALS)和家族性(fALS)二者）中有許多星形膠質(zhì)細胞機能障礙的觀察結(jié)果。來自ALS患者的星形膠質(zhì)細胞與正常運動神經(jīng)元的體外共培養(yǎng)似乎加速所述運動神經(jīng)元的死亡。[0005]因此，對于產(chǎn)生解決這些缺損的人星形膠質(zhì)細胞（自人PSC細胞中繁殖和擴展的），有廣泛公認的需求。[0006]發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供篩選用于預(yù)防或治療運動神經(jīng)元(MND)疾病(例如肌萎縮側(cè)索硬化(ALS))的劑的方法，所述方法包括：(a)使星形膠質(zhì)細胞群體與所述劑接觸，所述星形膠質(zhì)細胞離體分化自多能干細胞(PSC);(b)將步驟(a)的星形膠質(zhì)細胞群體或其調(diào)節(jié)的（conditioned)培養(yǎng)基與神經(jīng)元群體共培養(yǎng);和(c)定量所述劑增強所述神經(jīng)元群體的存活或神經(jīng)功能的作用。[0007]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述神經(jīng)元群體為缺氧的、在氧化應(yīng)激下的、在谷氨酸鹽毒性下的或者谷氨酸鹽/NMDA/AMPA/在紅藻氨酸鹽毒性下的。[0008]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元的群體比率為大于1:1、10:1、100:1、1000:1或10,000:1〇[0009]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述星形膠質(zhì)細胞表達GFAP、GLAST、AQP4的每一個或其組合。[0010]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述星形膠質(zhì)細胞顯示分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，其選自BDNF、GDNF和VEGF。[0011]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述氧化應(yīng)激選自活性氧簇(ROS)、過氧化氫(H2〇2)及其任何衍生物。[0012]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述定量通過計數(shù)處于凋亡下的神經(jīng)元數(shù)量來進行。[0013]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述神經(jīng)元的凋亡通過半胱天冬酶-3a標記、膜聯(lián)蛋白V、微管蛋白_B3、HB9或DAPI來檢測。[0014]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述劑為小分子。[0015]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，正常的人祖星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞應(yīng)提供防止運動神經(jīng)元死亡的環(huán)境。[0016]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用于在有需要的受試者中治療或預(yù)防ALS進展的方法;所述方法包括將人祖星形膠質(zhì)細胞(hAPC)或星形膠質(zhì)細胞給予有需要的受試者，所述人祖星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞離體分化自多能干細胞(PSC)。[0017]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述給予涉及有需要的受試者的腦脊液、腦或脊髓實質(zhì)。[0018]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一方面，提供一種藥物組合物，其包含作為活性劑的本發(fā)明的細胞群體，以及藥學(xué)上可接受的載體。[0019]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述細胞群體為未經(jīng)基因操作的。[0020]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述人祖星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞對于所述受試者而言為非自體同源的。[0021]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述人祖星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞對于所述受試者而言為同種異體的。[0022]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，提供人祖星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞用于制備經(jīng)鑒定用于治療ALS的藥劑的用途，所述人星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞離體分化自多能干細胞(PSC)。[0023]除非另有規(guī)定，否則本文所用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。盡管可將與本文所述的方法和材料類似或等同的方法和材料用于實施或檢驗本發(fā)明的實施方案，但仍在下文描述示例性的方法和/或材料。如有沖突，將以本專利說明書(包括定義）為準。此外，所述材料、方法和實施例僅為說明性的而不意圖其為必要限制。[0024]附圖簡述本專利或申請文件含有至少一個以彩色實行的附圖。經(jīng)要求并支付必要費用之后，將由官方提供帶有彩圖的本專利或?qū)＠暾埑霭嫖锏母北?。[0025]參考隨附圖片和影像，在本文中描述本發(fā)明的一些實施方案(僅舉例說明）?，F(xiàn)在詳細地具體參考附圖，要強調(diào)的是所示詳情為舉例說明的并且以說明性論述本發(fā)明的實施方案為目的。在這點上，所述帶有附圖的說明，使得本發(fā)明的實施方案可如何實施，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言為顯而易見的。[0026]在附圖中：圖1闡述通過hESC源星形膠質(zhì)細胞的星形膠質(zhì)細胞系基因表達的動力學(xué)。顯示了各基因在第0、7、14、21、28和35天的表達。將成人腦和人胎腦用作對照。以下顏色一一橙、藍、綠、黃、紅和淺藍分別代表GFAP、BDNF、PDGFRa、GLAST、GDNF和ALDH1L1的基因表達動力學(xué)。對于各基因，胎腦表達用作內(nèi)參基因（相對定量，RQ=1)。[0027]圖2A-C闡述hESC源星形膠質(zhì)細胞表達星形膠質(zhì)細胞標志物。通過FACS測量0、7、14、21、28、35和43天的4.0044、8.0乂0?4和(：.61^51'。？06?和0犯^為已知促進4?(：定型和分化的因子。測試了未處理(NT)、PDGF、CNTF和TOGF+CNTF處理對hESC-APC分化的影響(標志物表達％)。藍線:NT，紅線：CNTF，綠線：CNTF+PDGF，淺藍:PDGF。通過hPSC源星形膠質(zhì)細胞方案獲得的群體產(chǎn)生星形膠質(zhì)細胞富化群體。[0028]圖3A-E闡述hESC源星形膠質(zhì)細胞表達成熟星形膠質(zhì)細胞的標志物。A.GFAP陽性細胞的灰度。B.GLAST陽性細胞的灰度。C.A+B的重疊組合圖像（overlaymontageimage)，紅色為GFAP陽性細胞，綠色為GLAST陽性細胞以及藍色為Dapi陽性細胞。黃色染色表示對GFAP和GLAST的共染色。D.C插入的放大(關(guān)于黃色染色的相同觀察）』.綠色為水通道蛋白-4陽性細胞(AQP4)以及紅色為GLAST陽性細胞。A-C和E比例尺：100μπι以及D比例尺：30融〇[0029]圖4A-C闡述hPSC源星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，如分別在星形膠質(zhì)細胞激活之后的細胞內(nèi)容物和培養(yǎng)基中所測量。A.IFN-γ激活之后的GDNF細胞內(nèi)容物及分泌物（紅色）。1IFN-γ激活之后的BDNF細胞內(nèi)容物及分泌物（橙色）<X.LPS激活之后的VEGF細胞內(nèi)容物及VEGF分泌物(紫色）。[0030]圖5Α-Β闡述通過hESC源星形膠質(zhì)細胞的500μΜ和2mM谷氨酸鹽攝取的動力學(xué)。Α.從左到右(綠色條）：在分化的第100天向hESC源星形膠質(zhì)細胞中加入500μΜ谷氨酸鹽之后的0'、10'、30'、60'、90'和120'。淺紅色條:11月性對照，不含星形膠質(zhì)細胞的含有500μΜ谷氨酸鹽60'的培養(yǎng)基。深紅色條-2nd陰性對照，120'之后與人成纖維細胞一起生長的培養(yǎng)基中的谷氨酸鹽水平。右側(cè)條(藍色）：陽性對照，與人脊髓來源的星形膠質(zhì)細胞一起生長的培養(yǎng)基中的谷氨酸鹽水平。B.從左到右(淺綠色條）：在分化的第100天向hESC源星形膠質(zhì)細胞中加入2mM谷氨酸鹽之后〇'、1〇'、30'、60'、90'和120'。藍色條：陰性對照，在沒有星形膠質(zhì)細胞的情況下60'之后含2mM谷氨酸鹽的培養(yǎng)基。[0031]圖6A-D闡述人PSC源星形膠質(zhì)細胞對氧化應(yīng)激下的運動神經(jīng)元的神經(jīng)保護作用。[0032]A.用Η202(50μΜ和150μΜ)補充MN達6小時或不進行處理。在此期間，不處理MN或者對其補充星形膠質(zhì)細胞上清液(24小時調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基)或星形膠質(zhì)細胞。Α:不含Η2〇2的ΜΝ中的半胱天冬酶-3a%通過灰色條(右)表示。僅與Η2〇2-起孵育的ΜΝ中的半胱天冬酶-3a%通過紅色條(50μΜH2〇2)和橄欖綠色條（150μΜH2〇2)表示，或者在加入星形膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基之后通過橙色條和淺綠色條表示，以及在存在星形膠質(zhì)細胞時通過粉紅色條和淺綠色條表示。B和C中的半胱天冬酶-3激活(紅色）。運動神經(jīng)元用beta3微管蛋白（綠色)染色，細胞核用DAPI染色。D.用于圖像定量和分析的高內(nèi)涵分析裝置的圖像。[0033]圖7A-C證實注射人祖星形膠質(zhì)細胞(hAPC)增加hSODl小鼠的存活。A.以兩個時間點（第130天和第140天）比較hSODl小鼠存活的表格。如在第140天所示，移植"第7天"細胞(在不含生長因子的條件下生長7天）的小鼠的存活增加。B.比較所有實驗組的Kaplan-Meir生存曲線。C.比較所有實驗組的對通過旋轉(zhuǎn)〈106測量的針對疾病發(fā)作生成的Kaplan-Meir曲線。[0034]圖8A-C證實早期的人來源的星形膠質(zhì)細胞在hSODl小鼠中增加運動性能。A.比較所有組的通過BBB評分描述的疾病進展的動力學(xué)。0=正常小鼠，5=癱瘓小鼠。B.比較所有實驗組的通過轉(zhuǎn)棒(rotarod)評分描述的疾病進展的動力學(xué)，180秒=正常小鼠，0=不能握住轉(zhuǎn)棒的小鼠。C.轉(zhuǎn)棒儀上的小鼠。[0035]圖9證實早期的人來源的星形膠質(zhì)細胞維持移植hSODl體重。比較所有組的疾病進展全程的體重變化的動力學(xué)。[0036]圖10闡述了KapalnMeierLogrank統(tǒng)計分析。對50%的所述群體進行LogRank生存分析。[0037]本發(fā)明具體實施方案的描述本發(fā)明在其一些實施方案中涉及使用離體分化的多能干細胞(PSC)鑒定影響人星形膠質(zhì)細胞功能性的劑的方法。此外，亦公開了人星形膠質(zhì)細胞或人祖星形膠質(zhì)細胞用于治療受試人中的肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的用途。[0038]為了獲得大量的人星形膠質(zhì)細胞，本發(fā)明的發(fā)明人提出將其從人多能干細胞(PSC)中分化，所述人多能干細胞在分化之前能夠無限繁殖。[0039]本發(fā)明進一步公開了用于從人多能干細胞(hPSC)中產(chǎn)生高同質(zhì)性星形膠質(zhì)細胞群體(>90%GFAP，S100b)的獨特而強大的方案。所述分化方案連同可擴大培養(yǎng)技術(shù)，允許在體外產(chǎn)生大量的星形膠質(zhì)細胞。這些hPSC源星形膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出與初級人星形膠質(zhì)細胞相似的基因表達模式以及功能特性，包括：1)分泌保護運動神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF、GDNF和VEGF)。II)攝取谷氨酸鹽的能力和III)在體外保護神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激。這些hPSC源星形膠質(zhì)細胞可冷凍保存并根據(jù)需要使用。[0040]在體內(nèi)評價了所述人星形膠質(zhì)細胞的治療特性，對于所述目的，將所述細胞鞘內(nèi)移植到G93A高拷貝數(shù)hSODl小鼠（用于ALS疾病的小鼠模型）中。人星形膠質(zhì)細胞移植在所有功能測試中得到運動性能上的顯著改善(P〈〇.05)。此外，在移植小鼠中觀察到對存活和疾病期間的正效應(yīng)。[0041]ALS以皮質(zhì)、腦干和脊髓中的運動神經(jīng)元死亡為特征。在所述病例的約5-10%中，ALS為家族性的，其余為偶發(fā)性的。在家族性和偶發(fā)性ALS之間，所述疾病的進程難以區(qū)分。所述疾病在平均56歲年齡的生命晚期顯露自身，并且一旦被診斷便在2-5年內(nèi)導(dǎo)致完全癱瘓和死亡。在所述家族性患者的亞群中，在編碼銅-鋅超氧化物歧化酶1(S0D1)的基因中發(fā)現(xiàn)了突變。S0D1為涉及自由基解毒的胞質(zhì)酶。此外，編碼致病性人S0D1蛋白的等位基因在運動神經(jīng)元中的過度產(chǎn)生，導(dǎo)致晚發(fā)的進行性神經(jīng)變性疾病。研究已導(dǎo)向鑒定ALS運動神經(jīng)元的內(nèi)在致病特征，包括蛋白質(zhì)聚集物的形成、細胞骨架異常、蛋白體機能障礙以及對細胞死亡信號增加的敏感性。此外，在其它細胞中編碼致病性人S0D1蛋白的等位基因的過度產(chǎn)生，可導(dǎo)致非細胞自發(fā)的運動神經(jīng)元病理，所述細胞常被發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)與運動神經(jīng)元相關(guān)，例如但不限于神經(jīng)膠質(zhì)細胞(例如星形膠質(zhì)細胞、Schwann細胞等）。編碼致病性S0D1蛋白的等位基因的實例包括但不限于S0D1G93A、S0D1G85R和S0D1G37R。[0042]諸如ALS、阿爾茨海默氏病和帕金森病等神經(jīng)變性疾病，為共同表現(xiàn)為嚴重健康護理負擔的無法治療的病況。需要對這些疾病的生物學(xué)的增進理解，以便開發(fā)神經(jīng)保護治療以及最終的修復(fù)性治療。直至最近，神經(jīng)變性疾病在很大程度上被視為專門的神經(jīng)元病癥。然而，近期研究結(jié)果對此觀念提出異議，其暗示急性和慢性病癥中的由星形膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)變性的非細胞自發(fā)性機制。人干細胞生物學(xué)允許模擬生理和損傷范例下的人星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元相互作用。盡管已有用于產(chǎn)生神經(jīng)干細胞和功能性神經(jīng)元的穩(wěn)健平臺，但是富化和功能性人星形膠質(zhì)細胞的產(chǎn)生相對而言正在研究。假設(shè)人星形膠質(zhì)細胞可能通過其保護患病神經(jīng)元且增加其存活的機制包括：防止谷氨酸鹽神經(jīng)毒性、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)例如BDNF和⑶NF，以及通過VEGF分泌的神經(jīng)血管修飾。[0043]本發(fā)明部分基于在體外產(chǎn)生富化和功能性的人多能干細胞來源的祖星形膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞群體，以及建立用于ALS的劑篩選平臺，其中測試了人星形膠質(zhì)細胞對氧化應(yīng)激下的運動神經(jīng)元的神經(jīng)保護作用。[0044]在本發(fā)明的一些實施方案中，提供方法和組合物用于鑒定、表征和優(yōu)化表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用且增強人星形膠質(zhì)細胞功能性的先導(dǎo)化合物。[0045]可使用本發(fā)明的測定法測試的劑包括小分子劑、化學(xué)品、肽、蛋白質(zhì)、多核苷酸劑(例如siRNA劑）。[0046]使所述細胞與所述劑接觸，可通過本領(lǐng)域已知的任何體外方法進行，所述方法包括例如將所述劑加入所述細胞中，以使所述劑直接與所述細胞接觸。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，將所述細胞與所述劑一起孵育。針對時間周期/細胞濃度/劑濃度/細胞和劑之間的比率等，選擇用于孵育所述細胞的條件，這使得所述劑能夠誘導(dǎo)細胞變化，例如經(jīng)分析的在特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯速率上的變化。根據(jù)一個具體的實施方案，使所述細胞與所述劑接觸至少1天、3天、5天、7天、10天、14天或至少21天。[0047]可將候選的神經(jīng)保護性先導(dǎo)化合物加入本發(fā)明細胞的培養(yǎng)基中，并測定所需特性?？商暨x表現(xiàn)出所需特性的化合物，例如相對于不存在所述候選神經(jīng)保護性先導(dǎo)化合物時的活運動神經(jīng)元數(shù)量，增加培養(yǎng)基中活運動神經(jīng)元數(shù)量的化合物，用于進一步的表征和優(yōu)化?？舍槍ζ湓黾釉谂c人星形膠質(zhì)細胞的共培養(yǎng)物中或其調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中的運動神經(jīng)元生存力的能力來挑選化合物。[0048]所述高通量篩選亦可用于鑒定能夠校正任何疾病相關(guān)表型的化合物，所述表型例如存活、凋亡、壞死、軸突變性、軸突引導(dǎo)、軸突形態(tài)、樹突形態(tài)、受體密度、突觸發(fā)生、神經(jīng)發(fā)生、突觸密度、突觸傳遞、突觸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體運輸、蛋白質(zhì)運輸、蛋白質(zhì)聚集、蛋白酶體活性、受體表達、氧化應(yīng)激(R0S)、FGFR-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和FGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。[0049]針對其調(diào)節(jié)細胞表型的能力（例如神經(jīng)保護作用）挑選的候選先導(dǎo)化合物的表征和優(yōu)化，包括但不限于進一步篩選，生成衍生物及類似物，分析吸收分布、代謝和排泄(ADME)特征，安全性試驗和功效試驗。具體而言，優(yōu)化努力可包括開發(fā)設(shè)計成通過血腦屏障的化合物。[0050]藥物候選化合物(或"測試劑"）可以是精選的獨立小分子(例如來自先前藥物篩選的先導(dǎo)化合物)或者在一些情況下，待篩選的藥物候選化合物來自組合文庫，即通過將許多化學(xué)"結(jié)構(gòu)塊"組合的化學(xué)合成或生物合成生成的多種化學(xué)化合物的集合。例如，諸如多肽文庫等線性組合化學(xué)文庫，是通過針對給定化合物長度（即多肽化合物中氨基酸的數(shù)量）以每種可能的方式將稱為氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)塊的集合組合來形成。數(shù)百萬的化學(xué)化合物可通過化學(xué)結(jié)構(gòu)塊的這類組合式混合來合成。甚至，在理論上，1〇〇種可交換化學(xué)結(jié)構(gòu)塊的系統(tǒng)的組合式混合，得到1億個四聚體化合物或100億個五聚體化合物的合成。[0051]本文所用的術(shù)語"存活"意指細胞通過其避免死亡的任何過程。本文所用的術(shù)語存活，亦指防止如通過壞死、凋亡所證實的細胞損失，或者防止其它機制的細胞損失。本文所用的增加存活，指示相對于未處理對照在細胞死亡率上至少10%、25%、50%、75%、100%或更多的降低。所述存活率可通過計數(shù)培養(yǎng)基中能夠被對死細胞特異的染料(例如碘化丙啶)染色的細胞來測量。[0052]用于本發(fā)明測定的細胞包括離體分化自多能干細胞的星形膠質(zhì)細胞。[0053]例如，可從人胚泡或延期的胚泡階段分離人胚胎干細胞（如描述于W02006/040763)。人胚泡通常獲自人體內(nèi)植入前胚胎或來自體外受精（IVF)胚胎?；蛘撸蓪渭毎祟惻咛U展至胚泡期。對于分離人ES細胞，將透明帶從胚泡中取出并通過免疫外科分離內(nèi)細胞團（ICM)，其中使滋養(yǎng)外胚層細胞裂解并通過輕輕吹吸從完整ICM中去除。然后將ICM接種到含有適當培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶中，所述培養(yǎng)基使其能夠向外生長。9-15天之后，通過機械解離或通過酶促降解將來自ICM的生長物解離成團（clump)，然后將所述細胞重新接種到新鮮的組織培養(yǎng)基上。通過微量移液器單獨挑選顯示未分化形態(tài)的集落，機械解離成團并重新接種。然后每1-2周常規(guī)分裂所得ES細胞。對于制備人ES細胞的方法的進一步詳情，參見Thomson等，[美國專利號5,843,780;5(^61^6282:1145，1998;(：11燈.1'(^.06￥·Biol.38:133，1998;Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844，1995];Bongso等，[Hum1^卩1'0(14:706，1989];6&『(11161'等，[卩61'1:;[1.3七61'；[1.69:84，1998]〇[0054]將理解的是，商購可得的干細胞亦可用于本發(fā)明的此方面。人ES細胞可購自NIH人類胚胎干細胞登記處(<http://escr.nih.gov>)。商購可得的胚胎干細胞系的非限制性實例為BG01、BG02、BG03、SA01、TE03(I3)、TE04、TE06(I6)、HES-1、HES-2、HES-3、UC01、UC06、WA0UWA07和WA09。[0055]本發(fā)明使用的干細胞亦可來源于誘導(dǎo)的多能干細胞（IPSc)。[0056]不論其來源，根據(jù)本發(fā)明使用的干細胞為至少50%純化的、75%純化的或至少90%純化的。當使用人胚胎干細胞系時，例如通過機械和/或酶促手段從其滋養(yǎng)層(經(jīng)X-射線輻照的成纖維細胞樣細胞)中分離所述人ES細胞集落，以提供基本上純的干細胞群體。[0057]一旦獲得人干細胞，便可對其進行處理以分化成星形膠質(zhì)細胞。一個示例性方法描述于下文材料和方法部分。然而將理解的是，本發(fā)明方法考慮用于生成星形膠質(zhì)細胞的其它方法，其為本領(lǐng)域已知的。[0058]所用的培養(yǎng)基是根據(jù)所用的干細胞來選擇。因此，例如，適于ES細胞生長的培養(yǎng)基可以是例如DMEM/F12(Sigma_Aldrich，St·Lewis，M0)或alphaMEM培養(yǎng)基（LifeTechnologiesInc.，Rockville，MD，USA)，其補充有支持的酶和激素。這些酶可以是例如胰島素(ActRapid;NovoNordisk，Bagsvaerd，DENMARK)、孕酮和/或Apo轉(zhuǎn)鐵蛋白（BiologicalIndustries，BeitHaemek，Israel)。其它成分列于實施例部分。[0059]本文所用的短語"視黃酸"是指維生素A的活性形式(合成的或天然的），能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細胞分化。可根據(jù)本發(fā)明使用的視黃酸形式的實例包括但不限于視黃酸、視黃醇、視黃醛、11-順-視黃醛、全反-視黃酸、13-順視黃酸和9-順視黃酸(均可得自Sigma-Aldrich，St.Lewis,M0)〇[0060]在本發(fā)明的一些實施方案中，以1-50μΜ的濃度范圍使用視黃酸。[0061]所述培養(yǎng)基可進一步補充生長因子，其可至少存在于部分培養(yǎng)期中以促進細胞增殖以及利于分化成神經(jīng)元的神經(jīng)膠質(zhì)細胞系。根據(jù)本發(fā)明的此方面的一個實施方案，所述生長因子包括例如EGF(5-50ng/ml)和bFGF(5-50ng/ml)(R&DSystems，Minneapolis，MN，Biotest，Dreieich，Germany)〇[0062]本文所用的短語"神經(jīng)球"是指這樣的類球形的簇或球，其主要含有神經(jīng)干細胞和早期多能祖細胞，所述細胞可分化成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞以及其它神經(jīng)膠質(zhì)細胞。[0063]培養(yǎng)所述細胞直至形成成熟的神經(jīng)球。[0064]本文所用的短語"成熟的神經(jīng)球"是指這樣的神經(jīng)球，其中神經(jīng)干細胞中的某些已分化變?yōu)榫哂蝎@得的少突膠質(zhì)細胞系標志物（例如3似10、他12.2.、如2^285)的特化少突膠質(zhì)細胞祖細胞，而其它的已分化變?yōu)樯窠?jīng)祖細胞或星形膠質(zhì)細胞祖細胞。[0065]根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，使所述細胞培養(yǎng)例如10-30(例如20-30)天，在此結(jié)束時形成分離的神經(jīng)球。然后使所述神經(jīng)球或自其解離的細胞粘附至粘附基底(例如基質(zhì)膠或胞外基質(zhì)組分（如膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白））并用生長因子使之進一步擴展以及在去除生長因子之后在陽離子粘附基底(例如含有纖連蛋白（FN)的多聚-D-賴氨酸或多聚鳥氨酸)或粘附基底(例如基質(zhì)膠或胞外基質(zhì)組分(如膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白））上最終分化。[0066]本文所用的術(shù)語"人星形膠質(zhì)細胞祖細胞(hAPC)"或"人祖星形膠質(zhì)細胞"意指能夠產(chǎn)生為成熟星形膠質(zhì)細胞的子代的細胞。通常，所述細胞表達星形膠質(zhì)細胞系所特有的表型標志物中的某些。[0067]術(shù)語"給予的"和"給予"是指通過其將本文所考慮的治療上有效量的星形膠質(zhì)細胞或藥劑遞送給受試者用于預(yù)防和/或治療目的的過程。所述星形膠質(zhì)細胞和藥劑依照良好醫(yī)療實踐給予，并考慮所述受試者的臨床病況、給予的部位和方法、劑量、患者年齡、性另IJ、體重及醫(yī)師已知的其它因素。[0068]術(shù)語"治療"是指逆轉(zhuǎn)、緩解或抑制所述術(shù)語應(yīng)用的疾病的進展或者所述疾病的一種或多種癥狀。治療包括管理和護理正在診斷或之后的受試者。治療可以急性或慢性方式進行。根據(jù)所述受試者的病況，所述術(shù)語可指預(yù)防疾病，并且包括預(yù)防疾病的發(fā)作或者預(yù)防疾病相關(guān)的癥狀。所述術(shù)語亦指在受疾病所累之前減輕所述疾病的嚴重性或所述疾病相關(guān)的癥狀。所述在受累之前預(yù)防或減輕疾病的嚴重性，是指給予并未在給予時間內(nèi)受所述疾病所累的受試者星形膠質(zhì)細胞或相同組成的藥劑。"預(yù)防"亦指預(yù)防疾病或者所述疾病相關(guān)的一種或多種癥狀的復(fù)發(fā)。治療的目標為對抗所述疾病并且包括給予所述星形膠質(zhì)細胞以預(yù)防或延遲所述癥狀或并發(fā)癥的發(fā)作，或者減輕所述癥狀或并發(fā)癥，或者消除或部分消除所述疾病。術(shù)語"療法"和"在治療上"，是指治療的行為，如"治療"在上文所定義。[0069]本發(fā)明涉及這樣的細胞及其群體，其可移植到患者中以治療大量的神經(jīng)變性疾病。[0070]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，未對所述細胞及其群體進行基因操作（即，使用表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化)以產(chǎn)生本文所述的細胞及細胞群體。[0071]術(shù)語或短語"移植術(shù)"、"細胞替代"或"移植(grafting)"在本文中可交換使用，以及是指將本發(fā)明的細胞引入靶組織中。[0072]可將所述細胞移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中或者室腔中或者硬膜下移植到宿主腦的表面上或者宿主腦脊液上。成功移植的條件可包括：（i)所述植入物的生存力；（ii)所述移植物保留在移植部位;和（iii)在移植部位最小量的病理反應(yīng)。用于將不同神經(jīng)組織例如胎腦組織移植到宿主腦中的方法已描述于："哺乳動物CNS中的神經(jīng)移植(NeuralgraftinginthemammalianCNS)"，Bjorklund和Stenevi，編輯（1985);Freed等，2001;Olanow等，2003)。這些程序包括實質(zhì)內(nèi)移植，即在宿主腦中（與腦外部或?qū)嵸|(zhì)外移植相比），其通過在宿主腦中注射或安置(deposition)組織來實現(xiàn)，以便在移植時對抗腦實質(zhì)。實質(zhì)內(nèi)移植可使用兩種途徑實現(xiàn)：（i)將細胞注射到宿主腦實質(zhì)中或（ii)通過外科方式制備腔以暴露所述宿主腦實質(zhì)并隨后將所述移植物安置到所述腔中。兩種方法均在移植時提供所述移植物與宿主腦組織之間的實質(zhì)安置，并且二者均利于所述移植物與宿主腦組織之間的解剖學(xué)整合。如果需要所述移植物變?yōu)樗鏊拗髂X的組成部分并且在所述宿主的生命中存活，那么這很重要。或者，可將所述移植物置于室(例如腦室）中或者硬膜下置于腦脊液上，即置于通過介入軟腦膜或蛛網(wǎng)膜和軟腦膜將其從宿主腦實質(zhì)中分離的宿主腦的表面上。移植到室中可通過注射所述細胞來完成。對于硬膜下移植，可在硬膜中制備切口之后在腦表面的周圍注射所述細胞。注射到所選的宿主腦區(qū)中可通過鉆孔并刺穿硬膜以允許插入微量注射器的針頭來進行。優(yōu)選將所述微量注射器安裝在立體定位架上并且選擇三維立體定位坐標用于將所述針頭放入腦或脊髓的所需部位中。亦可將所述細胞引入腦的殼、基底核、海馬皮質(zhì)、紋狀體、黑質(zhì)或尾狀區(qū)以及脊髓中。[0073]亦可將所述細胞移植到組織的健康區(qū)域中。在一些情況下，受損組織區(qū)的準確位置可能是未知的，并且可能將所述細胞無意中移植到健康區(qū)域。在其它情況下，可能優(yōu)選將所述細胞給予到健康區(qū)域，從而避免對所述區(qū)域的任何進一步損傷。不論哪種情況，在移植之后，所述細胞均可迀移到受損區(qū)域。[0074]對于移植，將所述細胞懸液吸入注射器中并給予麻醉的移植受體?？墒褂么顺绦蜻M行多次注射。[0075]因此所述細胞懸浮程序允許將所述細胞移植到腦和脊髓中的任何預(yù)定部位，為相對非創(chuàng)傷性的，允許使用相同的細胞懸液在數(shù)個不同部位或相同部位同時多次移植。[0076]對于移植到腔內(nèi)，其對于脊髓移植可能為優(yōu)選的，從靠近中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)外表面的區(qū)域中移除組織以形成移植腔，例如通過Stenevi等(BrainRes.114:1-20.，1976)所述，通過移除覆蓋腦的骨并使用例如明膠海綿等材料止血來進行。可使用抽吸產(chǎn)生所述腔。然后將所述移植物置于所述腔中。[0077]鑒于非自體同源細胞在給予身體時可能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，已開發(fā)數(shù)種途徑來降低非自體同源細胞的排異作用的可能性。這些途徑包括阻抑受體免疫系統(tǒng)。免疫抑制劑的實例包括但不限于甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素、環(huán)孢霉素A、氯喹、羥氯喹、柳氮磺吡啶(磺胺柳氮吡啶（811]^1^83132(^5^；[116))、氯金酸鈉(801(1331〖8)、0-青霉胺、來氟米特、硫唑噪呤、阿那白滯素、英夫利昔單抗、依那西普、TNF、a阻斷劑(靶定炎性細胞因子的生物劑）、和非甾體抗炎藥(NSAIDhNSAID的實例包括但不限于乙酰水楊酸、膽堿水楊酸鎂、二氟尼柳、水楊酸鎂、雙水楊酯、水楊酸鈉、雙氯芬酸、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮略酸、甲氯滅酸鹽(meclofenamate)、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、他克莫司、托美丁、對乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制劑和曲馬多。[0078]術(shù)語"受試者"、"個體"或"患者"在本文中可交換使用，以及是指包括溫血動物在內(nèi)的動物，例如哺乳動物。[0079]本文所用的術(shù)語"健康受試者"意指不具有診斷的ALS或ALS癥狀的受試者，具體而言為哺乳動物。[0080]本文所用"藥物組合物"是指本文所述的一種或多種活性成分或細胞與諸如生理學(xué)上合適的載體和賦形劑等其它化學(xué)組分的制劑。藥物組合物的目的是要利于將細胞或化合物給予生物。[0081]本文的術(shù)語"活性成分"是指增強所述運動神經(jīng)元群體的存活或神經(jīng)功能的劑。[0082]下文中，短語"生理學(xué)上可接受的載體"和"藥學(xué)上可接受的載體"可交換使用，是指不會引起對生物的顯著刺激并且不會消除所述給予化合物的生物活性和特性的載體或稀釋劑。輔劑包含在這些短語之內(nèi)。[0083]本文的術(shù)語"賦形劑"是指加入藥物組合物中以進一步利于活性成分給予的惰性物質(zhì)。賦形劑的非限制性實例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。[0084]"治療上有效的量"涉及星形膠質(zhì)細胞或其藥劑的量或劑量，其將導(dǎo)致一種或多種所需效應(yīng)，具體而言，一種或多種有益效應(yīng)。物質(zhì)的治療上有效的量可根據(jù)以下因素而不同，例如所述受試者的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，以及所述物質(zhì)在所述受試者中引起所需反應(yīng)的能力?？烧{(diào)整給藥方案以提供最佳的治療反應(yīng)(例如有益效應(yīng)，更具體而言持續(xù)的有益效應(yīng)）。例如，可每日給予數(shù)個分次劑量或者可相稱地減少劑量，如通過治療狀況的緊急情況所指示。[0085]誘導(dǎo)的多能和多潛能干細胞系在本文中被稱為"誘導(dǎo)的干細胞系"（iSC系）。誘導(dǎo)的多能干細胞被稱為iPS細胞或iPSC。[0086]本文所用的"校正"表型，是指改變表型以使其更密切接近正常表型。[0087]用于配制和給予藥物的技術(shù)可在"雷明頓藥物科學(xué)（Remingtοη'sPharmaceuticalSciences)"，MackPublishingCo.，Easton，PA，最版本版中找到，其通過引用結(jié)合到本文中。[0088]本文所用的術(shù)語"大約"是指±10%。[0089]術(shù)語"包括（comprises)"、"包括（comprising)"、"包含（includes)"、"包含(including)"、"具有"及其變化形式(conjugates)，意指"包括但不限于"。[0090]術(shù)語"由……組成"意指"包括且限于"。[0091]術(shù)語"基本上由……組成"意指所述組合物、方法或結(jié)構(gòu)可包含另外的成分、步驟和/或部分，但僅在所述另外的成分、步驟和/或部分不會實質(zhì)上改變權(quán)利要求的組合物、方法或結(jié)構(gòu)的基本特征和新特征的情況下。[0092]貫穿本申請，本發(fā)明的各種實施方案可以范圍形式表示。應(yīng)理解的是，以范圍形式描述僅為了方便和簡潔，而不應(yīng)理解為對本發(fā)明范圍的硬性限制。因此，范圍的描述應(yīng)認為是具體地公開所有可能的子范圍以及所述范圍內(nèi)的各個數(shù)值。例如，如1-6的范圍描述應(yīng)認為是具體地公開諸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等子范圍，以及所述范圍內(nèi)的各個數(shù)字，例如1、2、3、4、5和6。不論范圍的寬度，這均適用。[0093]每當本文中顯示數(shù)值范圍時，均意指其包含所示范圍內(nèi)的任何引用數(shù)字(分數(shù)或整數(shù)）。短語"范圍為/范圍在第一標示數(shù)和第二標示數(shù)之間"和"范圍為/范圍從第一標示數(shù)到第二標示數(shù)"，在本文中可交換使用并意指包含所述第一和第二標示數(shù)以及在其間的所有分數(shù)和整數(shù)。[0094]本文所用的術(shù)語"方法"是指用于完成給定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和程序，包括但不限于化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的從業(yè)人員已知的那些方式、手段、技術(shù)和程序，或其從已知的方式、手段、技術(shù)和程序中容易開發(fā)的那些方式、手段、技術(shù)和程序。[0095]要理解的是，本發(fā)明的某些特征，其為清楚起見而在獨立的實施方案的文段中描述，亦可在單個實施方案中以組合提供。相反地，本發(fā)明的多個特征，其為簡潔起見而在單個實施方案的文段中描述，亦可獨立提供或者以任何合適的亞組合提供，或者在合適時(assuitable)在本發(fā)明的任何其它描述的實施方案中提供。在各個實施方案的文段中描述的某些特征，不被認為是那些實施方案的基本特征，除非所述實施方案在沒有那些要素的情況下為無效的。[0096]如在下文中所述以及在下文權(quán)利要求部分中所要求的本發(fā)明的各個實施方案和方面，在下列實施例中得到實驗支持。實施例[0097]現(xiàn)在對以下實施例進行參考，其同上文描述一起以非限制性方式闡述本發(fā)明的一些實施方案。[0098]-般而言，本文使用的命名法以及在本發(fā)明中所使用的實驗室程序包括分子、生物化學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。文獻中透徹地解釋了這類技術(shù)。參見，例如"分子克隆:實驗室手冊（MolecularCloning:AlaboratoryManual)"Sambrook等，（1989);"分子生物學(xué)中的現(xiàn)行方案（CurrentProtocolsinMolecularBiology)"第I-III卷Ausubel，R.M.，編輯（1994);Ausubel等，"分子生物學(xué)中的現(xiàn)行方案（CurrentProtocolsinMolecularBiology)"，JohnWiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989);Perbal，"分子克隆實用指南（APracticalGuidetoMolecularCloning)"JohnWiley&Sons，NewYork(1988);Watson等，"重組DNA(RecombinantDNA)''，ScientificAmericanBooks，NewYork;Birren等（編輯）"基因組分析：實驗室手冊系列（GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries)''，第1-4卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);在美國專利號4,666,828;4,683,202;4,801,531;5,192,659和5,272,057中陳述的方法學(xué)；"細胞生物學(xué)：實驗室手冊（CellBiology:ALaboratoryHandbook)"，第I-III卷Cellis，J.E·，編輯（1994);"動物細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)手冊(CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechniqueFreshney,ffiley-Liss,N.Y.(1994)，第三版；"免疫學(xué)中的現(xiàn)行方案(CurrentProtocolsinImmunology)"第I-III卷ColiganJ.E·，編輯（1994);Stites等（編輯），"基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)（BasicandClinicalImmunology)"(第8版），Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994);Mishell和Shiigi(編輯），"細胞免疫學(xué)中的選擇方法（SelectedMethodsinCellularImmunology)"，W.H.Freeman和Co.，NewYork(1980);可得的免疫測定法廣泛描述于專利和科學(xué)文獻中，參見例如美國專利號3，791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;4,098,876;4,879,219;5,011,771和5，281,521;"寡核苷酸合成（OligonucleotideSynthesis)"Gait，M.J.，編輯（1984);"核酸雜交(NucleicAcidHybridization)"Hames，B.D.和HigginsS.J·，編輯（1985);"轉(zhuǎn)錄和翻譯（TranscriptionandTranslation)"Hames，B.D.和HigginsS.J·，編輯（1984);"動物細胞培養(yǎng)(AnimalCellCulture)"Freshney，R.I·，編輯（1986);"固定化細胞和酶(ImmobilizedCellsandEnzymes)"IRLPress，（1986);"分子克隆實用指南（APracticalGuidetoMolecularCloning)"Perbal，B.，（1984)和"酶學(xué)的方法(MethodsinEnzymology)"第1-317卷，AcademicPress;"RCR方案：方法和應(yīng)用指導(dǎo)（PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications)''，AcademicPress,SanDiego,CA(1990);Marshak等，"蛋白質(zhì)純化和表征策略-實驗室課程手冊（StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual)''CSHLPress(1996);所有所述文獻均通過引用結(jié)合，如同完整陳述于本文中。在整個本文檔中提供其它的一般參考文獻。認為其中的程序為本領(lǐng)域所熟知并且提供其以方便讀者。其中包含的所有信息均通過引用結(jié)合到本文中。[0099]材料和方法用于測定的星形膠質(zhì)細胞的產(chǎn)生使人ES細胞系在人新生兒包皮成纖維細胞(HEF)的滋養(yǎng)層上于37°C、5%C02下培養(yǎng)。所述生長培養(yǎng)基(ESI)由以下組成:DMEM/F12(Sigma)、14%knockout血清替代物(KSR)、非必需氨基酸（1/100)、0.111^[匕6七3-疏基乙醇（三者均來自111￥；[1：1'08611/6；[13(30)、111^[丙酮酸鈉、2μg/ml肝素（Sigma)和8ng/ml人重組堿性FGF(FGF_2;Preprotech)。接種五天之后，使用1.2mg/ml膠原酶IV(Worthington)使hES細胞集落于37°C分離45-90分鐘。如上將所述聚集物進一步培養(yǎng)，或者如所述（Izrael等MolCellNeurosci34,310-323(2007))使其經(jīng)歷分化。[0100]步潔轉(zhuǎn)滿.·對于此轉(zhuǎn)換步驟，將hES細胞集落轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)板的培養(yǎng)基T(轉(zhuǎn)換）中，所述培養(yǎng)基由50%(v/v)ESI培養(yǎng)基和50%(v/v)的ITTSPP/B27培養(yǎng)基組成。ITTSPP/B27本身為一體積的含2%B27補充物（Invitrogen)的DMEM/F12與一體積的含25μg/ml人膜島素（ActRapid，NovoNordisk)、50μg/ml人Αρ〇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（BiologicalIndustries，Israel)、6.3ng/ml孕酮、10μg/ml腐胺、50ng/ml亞硒酸鈉和40ng/ml三鵬甲腺原氨酸(T3)(均來自Sigma)的DMEM/F12的混合物，并具有100U/ml青霉素和100yg/ml鏈霉素。培養(yǎng)基T補充有20ng/mlr-人EGF(R&DSystems)和4ng/mlr-人bFGFd天之后，將大量的未粘附的hES細胞集落和聚集物轉(zhuǎn)移到6cm細菌(非粘附性)平板并在補充有20ng/mlr-人EGF(R&DSystems)和2ng/mlr-人bFGF的T培養(yǎng)基中生長。[0101]步潔^;全反式黎伊麼處湮；將培養(yǎng)基換成ITTSPP/B27,添加20ng/mlEGF和10μΜATRA。每天更換培養(yǎng)基，進行7天。[0102]步潔^;產(chǎn)浮潛養(yǎng)；在此步驟中，其使神經(jīng)球(NS)成熟，所述培養(yǎng)在含20ng/mlEGF的ITTSPP/B27培養(yǎng)基中繼續(xù)18天。每隔一天更換培養(yǎng)基。[0103]神經(jīng)干細胞增殖和分化步潔^:基處歡齡將球/簇轉(zhuǎn)移到6-孔組織培養(yǎng)板，所述培養(yǎng)板已使用以1:30稀釋在DMEM/F12中的BD基質(zhì)膠(減少生長因子的基質(zhì)膠，BDBiosciences)于室溫(RT)包被1.5h。所述培養(yǎng)基為含20ng/mlEGF的ITTSPP/B27,以及在一天之后去除任何未粘附的聚集物。每隔一天更換培養(yǎng)基，進行7-9天。[0104]:基處狡齡..挑選不含成纖維細胞和上皮細胞的神經(jīng)球/簇并挑取到新的基質(zhì)膠平板上。使神經(jīng)球(不超過10NS)分離并使用含0.025%胰蛋白酶（InVitrogen)的PBS(不含Ca+和Mg2+)于37°C部分解離2-3min(第1代）。通過一體積的胰蛋白酶抑制劑(Invitrogen)和四體積的含2mg/mlBSA的ITTSPP/B27中和胰蛋白酶。使所述細胞在Eppendorf離心機中以1200rpm旋轉(zhuǎn)五分鐘。將解離的小細胞簇重新接種到基質(zhì)膠包被平板（以1:1-1:3比率）中含20ng/mlEGF的ITTSPP/B27上(步驟4)。2-3周之后，如上通過胰蛋白酶處理解離所述細胞(第2代)并將所得hES-NS細胞接種到用多聚D-賴氨酸(PDL，100yg/ml)包被的平板或者基質(zhì)膠包被的平板上，以及具有20ng/mlEGF的含小鼠層粘連蛋白（20μg/ml)或TOL(20μg/ml)和纖連蛋白5μg/ml的ITTSPP/B27,維持一天。在每次新接種時，向培養(yǎng)基中加入1μg/ml小鼠層粘連蛋白（Sigma)。[0105]步驟6和7:多聚D-賴氨酸或基質(zhì)膠上的擴展：一天之后Μ培養(yǎng)基更培養(yǎng)基，其由含0.5%(v/v)N2補充物（Invitrogen)、l%(v/v)B27補充物的DMEM/F12組成。生長因子EGF和bFGF各自以10ng/ml添加。7-14天之后，通過胰蛋白酶消化使所述細胞分裂（1:2或1:3,第2代(P2))以獲得單層。一周之后，用胰蛋白酶收集細胞并以0.5ΧΙΟ，細胞凍存在安瓿中(Ρ3)。在需要時(whenindicated)，每周進行進一步傳代。[0106]為了富集星形膠質(zhì)細胞并促進其定型，可使所述細胞生長在基質(zhì)膠、Cultrex或Geltrex上。[0107]步潔^:仏去餘.·在不同的傳代中，通過去除生長因子來啟動終末分化。每當去除生長因子，便向N2/B27培養(yǎng)基中加入50μg/ml維生素C。使細胞在補充有生長因子bFGF和EGF的N2/B27培養(yǎng)基中解凍。在分裂并接種到96孔板之前一天，去除生長因子。[0108]使用添加星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基（astrocyteconditionmedium)或星形膠質(zhì)細胞的神經(jīng)保護測定化合物的效果可在下列步驟中測試(黃色圓圈）：1.在hAPC向成熟星形膠質(zhì)細胞分化的期間可添加化合物，此后可向神經(jīng)元中加入所述暴露于化合物的星形膠質(zhì)細胞或其條件培養(yǎng)基。[0109]2.在誘導(dǎo)氧化應(yīng)激之前24-72小時最后一次培養(yǎng)基更換時。[0110]3.在氧化應(yīng)激期間的共培養(yǎng)中。[0111]4·可進行組合，BP1+2、1+3、2+3等。[0112]步潔7:從嚙齒類動物的脊髓中產(chǎn)生運動神經(jīng)元將來自大鼠胚胎(E15)的脊髓用于各實驗。從全部脊髓中去除腦膜。將所述脊髓組織切成小碎片并分到15ml管中（每管5個胚胎）。向各管中加入胰蛋白酶(2ml，0.25%)(Gibco#250050014)并于37°C孵育15min。用NB培養(yǎng)基(7ml)和FCS(1ml)重懸浮細胞、以300g離心5分鐘并吸除上清液。用NB培養(yǎng)基(2ml)重懸浮沉淀。對單細胞計數(shù)并接種（120K個細胞/孔)到基質(zhì)膠(K)#FAL354230)包被的96孔板(Costar#cc-3596)上。在補充有50ng/mlNGF(Alomone#n-100)的NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，每2天更換培養(yǎng)基。運動神經(jīng)元的表征在培養(yǎng)三天之后進行。用微管蛋白_b3、神經(jīng)絲和HB9(運動神經(jīng)元特異性轉(zhuǎn)錄因子)將所述神經(jīng)元染色。至少70%的所述神經(jīng)元對這些抗體為陽性的。[0113]步蔡:星形膠質(zhì)細胞接種在第8-10天（脊髓手術(shù)之后）接種所述星形膠質(zhì)細胞。使用補充有50ng/mlNGF(Alomone#n-100)的NB培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。[0114]步潔^:星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基產(chǎn)生收集來自hPSC源星形膠質(zhì)細胞(30-150日齡星形膠質(zhì)細胞)的培養(yǎng)基；用補充有維生素C的新鮮N2B27以1:1稀釋。所述培養(yǎng)基稱為ACM(星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基）。[0115]步蔡4:氧化應(yīng)激誘導(dǎo)(在第9-10天進行）用補充有維生素C或ACM的N2B27(150μ1)稀釋50μΜ或150μΜH202(Sigma#216763)，并加至接種有星形膠質(zhì)細胞的平板的各孔中。將所述平板于37°C孵育6小時。[0116]用4%PFA(100μ1/孔)將所述平板固定10分鐘，然后將所述平板清洗兩次并儲存于4°C直至染色。[0117]:運動神經(jīng)元細胞死亡分析：染色：將所述細胞與補充有Tx-1000.3%(sigma)的封閉緩沖液一起于室溫(RT)孵育1小時，然后用PBS(-/-)清洗。[0118]將所述細胞與下列抗體一起于RT孵育1小時：Ist抗體-Rb-抗半胱天冬酶_3a(Promega#G748l)(1:25〇)Μ-抗-β-ΤιΛ3(Convence#MMS-435P)(1:500)Rb-抗-HB9(Abeam#AB-ab92606)(1:100)使用PBS(-/-)將所述細胞清洗兩次，并與下列抗體一起于RT孵育1小時：211??體-山羊-抗-Rb-568(Invitrogen#A11036)(1:1000)山羊-抗-鼠-488(Invitrogen#A11029)(1:1000)使用PBS(-/-)將所述細胞清洗兩次，用DAPI(1:1000)標記，孵育5min并使用PBS(_/_)清洗兩次。使用ScanArray-Cellomics(Thermo-scientificinc)進行HCS分析。[0119]ACM或者添加hPSC源星形膠質(zhì)細胞的效果可用其它應(yīng)激誘導(dǎo)物測試，例如：-運動神經(jīng)元興奮性中毒。具體而言，谷氨酸鹽毒性(除運動神經(jīng)元細胞生存力之外測試谷氨酸鹽攝取能力）-另外的活性氧簇毒性-AMPA/紅藻氨酸鹽毒性培養(yǎng)基組成：N2B27培養(yǎng)基：-DMEM/F12(Sigma#01-170)96.5%。[0120]-N2(Invitrogen#17502-048)0.5%〇[0121]-B27(Invitrogen#17504044)l%〇[0122]-Pen/Srep/AmphoB(Biologicalind.#03-〇33-lB)l%〇[0123]-GlutaMAX(Invitrogen#35050038)l%〇[0124]NB培養(yǎng)基:-Neurobasal培養(yǎng)基（Gibco#2ll〇3〇49)97%〇[0125]-B27(Invitrogen#17504044)l%〇[0126]-Pen/Srep/AmphoB(Biologicalind.#03-〇33-lB)l%〇[0127]-GlutaMAX(Invitrogen#35050038)l%〇[0128]使用FACS分析表征人PSC源星形膠質(zhì)細胞：用于FACS的樣品：將來自不同發(fā)育階段的hPSC源星形膠質(zhì)細胞的樣品染色；第0天=在EGF和bFGF存在下生長的hPSC源星形膠質(zhì)細胞第7-14天=在不存在EGF和bFGF的情況下生長7-14天的hPSC源星形膠質(zhì)細胞第14-28天=在不存在EGF和bFGF的情況下生長14-28天的hPSC源星形膠質(zhì)細胞第28-42天=在不存在EGF和bFGF的情況下生長28-42天的hPSC源星形膠質(zhì)細胞第42-56天=在不存在EGF和bFGF的情況下生長42-56天的hPSC源星形膠質(zhì)細胞FACS染色：試劑：FACS緩沖液:PBS(Gibco#14190-094)99.5%BSA(sigma#A9418)0.5%抗體：-GLAST(Miltenyi)-A2B5(Miltenyi)-CD44(Miltenyi)-CXCR4(Miltenyi)-CD140(BD)-CD9(Miltenyi)-CD133(Miltenyi)-TRA1-60(Miltenyi)-EpCAM(Miltenyi)-ALDHILI(Miltenyi)-GFAP(固定之后）（Sigma)_Aqua4(固定之后+Tx_100)粘附細胞的細胞制備：使用胰蛋白酶(Gibco)將細胞進行胰蛋白酶消化3分鐘，用含有補充了2mg/mlBSA(Sigma，Cat#:A9418)的DTI(Gibco)的DMEM/F12(Sigma)滅活。將細胞連同培養(yǎng)基一起收集到錐形管中，以300g于RT離心5分鐘并棄去上清液。使用冷的PBS緩沖液(Gibco，Cat#:14190-094)重懸浮細胞，以300g于RT離心5分鐘并棄去上清液。[0129]固定:使用PFA0.5%(經(jīng)稀釋的，EMC)重懸浮細胞并于4°C孵育30分鐘。將細胞以300g離心5分鐘，棄去上清液。用1mlPBS清洗細胞，以300g離心5分鐘并棄去上清液。[0130]用于胞內(nèi)抗原染色的透化:將細胞與Tx-1000.5%-起于4°C孵育30分鐘以將細胞膜透化。將細胞以300g離心5分鐘，棄去上清液。用PBS重懸浮細胞，以300g離心5分鐘并棄去上清液。[0131]免疫染色:用FACS緩沖液(FB)(1X105個細胞/管，以100ul的體積)重懸浮細胞。[0132]對于未綴合的第一抗體：用FB分別稀釋未綴合的第一抗體和未綴合的同種型對照抗體。根據(jù)制造商說明書以最佳稀釋度稀釋第一抗體。用所述稀釋的第一抗體或稀釋的同種型對照抗體重懸浮細胞并于4°C孵育30min。將細胞以300g離心5分鐘并棄去上清液。用FB清洗細胞并以300g離心5分鐘，棄去上清液。用FB稀釋相應(yīng)的熒光染料綴合的第二抗體。用所述稀釋的第二抗體重懸浮細胞并于4°C孵育30分鐘。根據(jù)制造商說明書以最佳稀釋度稀釋第二抗體，并且此孵育必須在黑暗中完成。用FB重懸浮細胞并以300g離心5分鐘，棄去上清液。用0.5mlFB重懸浮細胞并在流式細胞儀上分析。[0133]對于熒光染料綴合的第一抗體：根據(jù)制造商說明書用FB稀釋所述熒光染料綴合的第一抗體。用所述綴合的第一抗體重懸浮細胞并于4°C在黑暗中孵育15min。將細胞以300g離心5分鐘并棄去上清液。用FB重懸浮細胞并以300g離心5分鐘，棄去上清液。用0.5mlFB重懸浮細胞并在流式細胞儀上分析。[0134]人PSC源星形膠質(zhì)細胞的基因表達：用于RNA提取的樣品：RNA樣品提取自不同發(fā)育階段的hPSC源星形膠質(zhì)細胞；第0天=在EGF和bFGF存在下生長的hPSC源星形膠質(zhì)細胞第7-14天=在不存在EGF和bFGF的情況下生長7-14天的hPSC源星形膠質(zhì)細胞第14-28天=在不存在EGF和bFGF的情況下生長14-28天的hPSC源星形膠質(zhì)細胞第28-42天=在不存在EGF和bFGF的情況下生長28-42天的hPSC源星形膠質(zhì)細胞第42-56天=在不存在EGF和bFGF的情況下生長42-56天的hPSC源星形膠質(zhì)細胞從hPSC源星形膠質(zhì)細胞中提取RNA:向所述細胞樣品（1*1〇6_1〇*1〇6個細胞）中加入〇.05%胰蛋白酶（Invitrogen#25200-056)。將細胞于37°C孵育5分鐘。通過加入2體積的2mg/mlBSA(Sigma)將胰蛋白酶滅活。將細胞以300rpm離心并去除上清液。用lml的RLT(Qiangen)和10yLbeta-疏基乙醇重懸浮沉淀，并儲存于-80°C。[0135]實時RT-PCR試劑和儀器TaqMan?基因表達測定探針：-A2B5(ABI，Lifetechnologies)-GFAPHs00909236(lifetechnologies)-BDNF(ABI，Lifetechnologies)-PDGFRHs00998018(lifetechnologies)-GLAST(ABI,Lifetechnologies)-GDNF(ABI，Lifetechnologies)-ALDH1L1Hs00201836(lifetechnologies)-TRA-1-60(ABI,Lifetechnologies)-NanogHs04260366(lifetechnologies)-〇ct4(ABI,Lifetechnologies)-GlulHs00365928(lifetechnologies)-IGF-1(ABI,Lifetechnologies)-NGF(ABI,Lifetechnologies)-Aqua4(ABI,Lifetechnologies)-間隙連接蛋白3〇(ABI，Lifetechnologies)-CD44(ABI,Lifetechnologies).人總RNA(Ambion)。[0136].人胎兒RNA(Clontech)。[0137].TaqManPCR預(yù)混液，50ml(AppliedBiosystems)。[0138].FastOptical96孔反應(yīng)板（AppliedBiosystems)。[0139].用于RT-PCR的T-Professional基礎(chǔ)梯度儀（Biometra)〇[0140].高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(200次反應(yīng)）（AppliedBiosystems)。[0141].StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)（AppliedBiosystems)。[0142]反轉(zhuǎn)錄使用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AppliedBiosystems)和T-Professional基礎(chǔ)梯度儀進行反轉(zhuǎn)錄。下列程序是基于Invitrogen的方案。[0143]在各管中制備下列RNA/引物混合物：RT緩沖液2μL總RNA1ygRT隨機引物1μLRNA酶抑制劑1μL反轉(zhuǎn)錄酶1μL100mMdNTP混合物0.8μLDEPCΗ20至10μL將自動熱循環(huán)儀編程為：1.25Γ10min2.37°C120min3.85〇C5min4.4°C暫停將cDNA儲存于-20°C直至用于實時PCR。[0144]實時PCR在光學(xué)板的各孔中制備下列混合物(對于10μL反應(yīng)混合物）。[0145]5μLTaqManMix0.5μL探針+引物0.5μLcDNA4μLΗ20使用成人胎腦RNA作為內(nèi)參，分析通過qPCR對各個基因獲得的數(shù)據(jù)。[0146]hPSC源星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌測定Elisa方案：使用的市購試劑盒：_m)NF(promega#G7610)-GDNF(promega#G7620)-IGF-1(R&DSystems#DG100)-VEGF(R&DSystems#DVE00)-NGF(promega#G7630)使hPSC源星形膠質(zhì)細胞在不存在生長因子(EGF+bFGF)的情況下生長至少20天。在最后一次培養(yǎng)基補充之后收集hPSC源星形膠質(zhì)細胞上層培養(yǎng)基(條件培養(yǎng)基)和/或細胞內(nèi)容物(24h-72h)〇[0147]根據(jù)制造商方案說明書對各因子進行Elisa。[0148]谷氨酸鹽攝取方案：市購試劑盒使用EnzyChrom谷氨酸測定試劑盒(BioassaySystems#EGLT-100)。[0149]使用的細胞培養(yǎng)物樣品：至少20天的去除生長因子(EGF+bFGF)的hPSC源星形膠質(zhì)細胞，陽性對照-人星形膠質(zhì)細胞(Gibco)，陰性對照-人成纖維細胞。向各實驗孔中加入谷氨酸鹽(〇.5-3mM)。[0150]在以下時間點從測試細胞中取出至少0.5ml的培養(yǎng)基樣品：T=0'、10'、30'、60'、90'、120'并將其儲存于4°C直至進一步處理。根據(jù)制造商方案(BioassaySystems#EGLT-100)進行谷氨酸鹽攝取。[0151]用于移植的人星形膠質(zhì)細胞：如上所述（"用于測定的星形膠質(zhì)細胞的產(chǎn)生"）進行步驟1-8來產(chǎn)生人星形膠質(zhì)細胞。對于移植，通過去除生長因子使人星形膠質(zhì)細胞前體細胞分化。將兩個細胞群體用于所述實驗:一個為在不含生長因子的情況下生長7天的細胞群體（"第7天"），另一個為生長42天的細胞群體（"第42天"）。以2.85X105個細胞/yL的濃度用DMEM/F12重懸浮"第7天"和"第42天"的人星形膠質(zhì)細胞。[0152]細胞移植實驗設(shè)計測試了5個移植實驗組。在組#1中，使用"第42天"分化的人星形膠質(zhì)細胞對67±2日齡S0D1G93M、鼠進行移植(n=10只S0D1G93M、鼠）。組#2,使用"第7天"分化的人星形膠質(zhì)細胞對67±2日齡SOD1G93M、鼠進行移植（n=12只SOD1G93M、鼠）。組#3，在67±2日齡SOD1G93M、鼠和第97±2天的SOD1G93M、鼠上進行兩次"第7天"細胞注射(n=13)。組#4僅用溶媒(DMEM/F12假注射組)對67±2日齡S0D1G93M、鼠進行注射(n=10)以及組#5不接收任何處理(未處理組，n=4)。從移植之前3天開始直至實驗結(jié)束，經(jīng)由每天I.P.注射10mg/Kg環(huán)孢霉素（Sandimmun，Novartis)使小鼠免疫抑制，此外，從移植之前3天開始直至移植后第7天，每天兩次給予15mg/kgCellCept(Roche)(經(jīng)由O.S(perO.S))。[0153]人星形膠質(zhì)細胞移植免疫抑制的動物在第67±2天(所有組)和第97±2天(組#3)接受移植。將7μ1的培養(yǎng)基或總體積7μ1的2.0X106個細胞通過小腦延髓池鞘內(nèi)注射。使用附有30號45°斜角針頭的HamiltonGastight注射器（10yL)(Hamilton;Reno，NV)遞送細胞。完成移植階段之后，使用Nucleocounter評價細胞生存力并發(fā)現(xiàn)其大于85%。[0154]S0D1G93M、鼠使用攜帶具有G93A突變的人S0D1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠（B6SJL-Tg(S0Dl*G93A)lGur/J)。將雄性和雌性小鼠均勾分布在實驗組之間。小鼠獲自Jackson實驗室(BarHarbor，ME)，并維持為內(nèi)部群體。[0155]動物的護理和處理所有程序均嚴格按照以色列指導(dǎo)方針進行;采取措施以使任何可能的痛苦或動物不適最小化。將小鼠圈養(yǎng)在標準溫度(2ΓΟ下和控制光照的環(huán)境中，任意取用食物和水，并維持在位于相同房間的通風籠子的架子中。為了避免脫水，當動物開始顯示疾病癥狀時，提供通往籠子水盆的途徑。[0156]行為和運動性能分析前肢抓力在移植前一周開始動物稱重和所有行為數(shù)據(jù)收集，并每周進行兩次直至末期。使用"抓力計"單獨測定前肢肌肉抓力。通過使動物抓住連接至測力計的細桿來進行抓力測試。在此之后將所述動物拉離所述測力計直至后肢或前肢放開所述杠。這提供最大抓力的力值。在三個獨立試驗中記錄力的測量結(jié)果，并將平均值用于分析。[0157]轉(zhuǎn)棒性能測試每周兩次進行運動功能。使用加速轉(zhuǎn)棒裝置（180秒，轉(zhuǎn)棒7650;UgoBasile，Comerio，Italy)測試運動功能。記錄小鼠脫離(failfrom)轉(zhuǎn)棒的時間。在記錄之前將動物訓(xùn)練一周。在植入之前一周開始記錄。[0158]BBB-臨床評分根據(jù)下表，以0-5的等級評分。當臨床現(xiàn)象介于兩個規(guī)定得分之間時，可對小鼠給出"中間"得分（即〇.5、1.5、2.5、3.5)。[0159]以等級0-5進行評分：當臨床現(xiàn)象介于兩個規(guī)定得分之間時，對小鼠給出"中間"得分（即〇.5、1.5、2.5、3.5)。在大部分籠中，小鼠達到3.5-4的臨床得分，并且其臨床體征從該點之后惡化。[0160]體重每周兩次測量體重。[0161]存活/末期和發(fā)作分析為了以可靠且倫理的方式確定疾病末期，通過以下來確定末期：當使其側(cè)臥時，小鼠不能在30秒內(nèi)將自身扶正。[0162]通過小于160秒的轉(zhuǎn)棒性能上的下降來確定疾病發(fā)作。[0163]統(tǒng)計分析使用統(tǒng)計學(xué)軟件Sigmastat(SASSoftware)進行所述S0D1G93M、鼠的Kaplan-Meier分析，以分析存活、疾病發(fā)作和持續(xù)期數(shù)據(jù)。通過重復(fù)測量ANOVA分析WeightRotarod、BBB和抓力結(jié)果。在一些情況下，進行Student?檢發(fā)以在動物組之間比較數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)作為平均數(shù)土S.E.M.顯示，并將顯著水平設(shè)置為ρ<0.05。[0164]組織學(xué)和生化分析組織處理通過心臟灌注(transcardialperfusion)0.3%鹽水接著冰冷的4%多聚甲醛(FisherScientific;Pittsburgh，PA)在末期處死動物。從所述動物中移出脊髓，接著用30%鹿糖(Fisher)/1Μ磷酸鹽緩沖液于4°C低溫保護3天。將所述組織包埋到OCT(Fisher)中，用干冰快速冷凍并儲存于_80°C直至處理。以30μπι厚度以矢狀面或橫斷面切割脊髓組織塊。將切片采集到載玻片上并儲存于_20°C直至分析。將脊髓切片的子集收集在PBS中用于自由漂浮組織化學(xué)（freefloatinghistochemistry)。[0165]移植物存活和迀移的定量使用他嫩（人核抗原;1;111丨。(^6;161116〇1113,04;單克??；1:400)選擇性鑒定移植物來源的人細胞(hGRP和hF二者）。[0166]實施例1人多能干細胞(PSC)源星形膠質(zhì)細胞的體外產(chǎn)生和表征通過以下對各星形膠質(zhì)細胞系在體外測試人星形膠質(zhì)細胞前體細胞(APC)向成熟星形膠質(zhì)細胞的分化：ALDH1L1。圖1顯示hESC源星形膠質(zhì)細胞的星形膠質(zhì)細胞系基因表達的動力學(xué)。為了促進星形膠質(zhì)細胞前體細胞向成熟表型分化，從培養(yǎng)基中去除生長因子。在第〇天(含生長因子）以及在去除生長因子之后每兩周收集樣品并檢測。將人胎腦用作所有測試基因的內(nèi)參樣品(相對定量(RQ)=1)，并且與成人腦一起用作陽性對照。重點注意的是，成人腦由多于50%星形膠質(zhì)細胞組成。在本研究中，在細胞分化時在所有測試的星形膠質(zhì)細胞基因中均發(fā)現(xiàn)顯著增加，以及在許多情況下，星形膠質(zhì)細胞基因（astrocyticgene)(即GFAP、BDNF、PDGFRa和GLAST)的表達顯著高于人胎腦（圖1)。這些結(jié)果證明，所述方案導(dǎo)致人星形膠質(zhì)細胞的富化群體。[0167]b.使用早期和晚期神經(jīng)膠質(zhì)限制標志物(例如:CD44、CXCR4和GLAST)的熒光激活細胞分選(FACS，流式細胞術(shù))分析。在所示FACS分析中（圖2)，測試了諸如CD44和CXCR4等早期星形膠質(zhì)細胞標志物以及作為晚期星形膠質(zhì)細胞標志物的GLAST的動力學(xué)。CXCR4亦稱為融合素或者CD184,為在CNS中具有潛在的趨化活性的趨化因子受體。發(fā)現(xiàn)大于95%的所述細胞在第0天至第21天表達CXCR4和⑶44,這些水平在星形膠質(zhì)細胞成熟時降低。同時，GLAST的水平在星形膠質(zhì)細胞成熟時增加（圖2)XXCR4表達表明所述hESC源星形膠質(zhì)細胞前體細胞的高迀移潛能，這是所述細胞達到其目的地所需的能力。[0168]c.使用星形膠質(zhì)細胞特異性抗體的免疫組織化學(xué)（IHC):GFAP、GLAST、S100l^PA通道蛋白4。通過我們的ScanArray高容量篩選裝置(HCS)定量染色。在圖3上，在體外分化的第50天將hPSC源星形膠質(zhì)細胞染色。如可在圖片中看到，大部分的所述細胞對于星形膠質(zhì)細胞特異性標志物(GFAP、GLAST和AQP4)為陽性的。[0169]實施例2測試所述hPSC源星形膠質(zhì)細胞的生物學(xué)功能性進行數(shù)個實驗以證明hPSC源人星形膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出成熟健康的星形膠質(zhì)細胞的功能特性。這些體外結(jié)果闡明了可能的體內(nèi)作用機制。對于所述目的，測試了下列功能機制：a.神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)分泌：對星形膠質(zhì)細胞上層培養(yǎng)基和去垢劑提取物進行針對BDNF、GDNF和VEGF的Elisa。使用了諸如IFN-γ和LPS等不同的星形膠質(zhì)細胞激活物。圖4證實在激活hPSC源星形膠質(zhì)細胞時，GDNF、BDNF和VEGF分泌到培養(yǎng)基中（圖4，分別為中間的柱)。[0170]b.谷氨酸鹽攝取:通過測量星形膠質(zhì)細胞上層培養(yǎng)基中的谷氨酸鹽水平來測試星形膠質(zhì)細胞谷氨酸鹽攝取能力。使用比色測定(Enzychrom)以便測量培養(yǎng)基中的谷氨酸鹽水平。使用成纖維細胞作為陰性對照，同時將來自成人組織的星形膠質(zhì)細胞用作陽性對照。數(shù)據(jù)顯示通過人PSC源星形膠質(zhì)細胞的谷氨酸鹽攝?。▓D5)。在本研究中，在下列時間點測試了兩個谷氨酸鹽濃度(〇.5mM和2mM)的谷氨酸鹽攝取的動力學(xué):添加谷氨酸鹽之后的0'、10'、30'、60'、90'和120'。發(fā)現(xiàn)的是，所述hPSC源星形膠質(zhì)細胞以時間依賴性方式從兩種濃度的培養(yǎng)基中攝取谷氨酸鹽。這表明所述星形膠質(zhì)細胞的具體樣品攝取谷氨酸鹽的能力。[0171]c.麗神經(jīng)保護測定:在此測定中，使用過氧化氫(H2〇2)激發(fā)小鼠或人來源的麗。在誘導(dǎo)氧化應(yīng)激之后測試加入hPSC源星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基和/或星形膠質(zhì)細胞對MN存活的作用。通過使用高容量篩選裝置(Ce11omics-ScanArray)評價活/死MN的數(shù)量。此測定可用作尋找影響ALS疾病中的匪存活的新藥的有價值工具。所述數(shù)據(jù)顯示了來自hPSC源星形膠質(zhì)細胞組織培養(yǎng)物的調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基對處于氧化應(yīng)激(使用H2〇2)下的嚙齒類動物脊髓MN的神經(jīng)保護作用。如在圖6中所示，測試了來自hPSC源星形膠質(zhì)細胞的條件培養(yǎng)基對小鼠MN培養(yǎng)物的保護作用以及直接向小鼠MN培養(yǎng)物中添加hPSC源星形膠質(zhì)細胞的作用。以兩個H2〇2濃度(50μΜ和150μΜ)。在兩個H2〇2濃度下添加hPSC源星形膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基之后，均發(fā)現(xiàn)在MN死亡上的顯著減少。驚人的是，向處于氧化應(yīng)激下的MN培養(yǎng)物中加入hPSC源星形膠質(zhì)細胞的神經(jīng)保護作用甚至大于添加其調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基（圖6)，表明與僅有其分泌物相比，其存在在降低氧化應(yīng)激上更顯著。這些結(jié)果進一步證實我們的hPSC源星形膠質(zhì)細胞的體外神經(jīng)保護能力。所述hPSC源星形膠質(zhì)細胞方案得到高純度的人星形膠質(zhì)細胞。所述人星形膠質(zhì)細胞在體外顯示功能性星形膠質(zhì)細胞特性，例如分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和谷氨酸鹽攝取，已知增加運動神經(jīng)元存活的特性。使用體外模型直接驗證hPSC源星形膠質(zhì)細胞在保護氧化應(yīng)激下的運動神經(jīng)元的潛能。此測定為尋找在體內(nèi)增加人星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)保護潛能的藥物的有價值工具。[0172]實施例3尋找用于移植hPSC源星形膠質(zhì)細胞的最佳條件在對S0D1動物進行實驗之前，進行對于不同移植方面的優(yōu)化實驗。[0173]a.優(yōu)化細胞注射方法i.測試了不同的移植部位(即直接注射到脊髓腹角中、鞘內(nèi)注射或腦室內(nèi)注射）。[0174]ii.測試了hPSC源星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量(每次注射/每個部位）。[0175]b.進行用于測量神經(jīng)元損傷和檢測植入細胞的評價組織學(xué)方法，其用于優(yōu)化大規(guī)模功效研究。[0176]c.評價用于跟進所述疾病的行為測試和電生理測試的功效。[0177]d.使用免疫組織化學(xué)測試在移植之后hPSC源星形膠質(zhì)細胞生存;迀移和細胞分化的動力學(xué)。[0178]實施例4hPSC源星形膠質(zhì)細胞移植到ALS動物模型(S0D1小鼠）中在體內(nèi)測試了hPSC源星形膠質(zhì)細胞對MN的神經(jīng)保護作用，即對動物運動改善和存活的作用。對于所述目的，如在材料和方法中所述使用和處理hSODlG93AC57BL6/SJL背景（高拷貝數(shù))小鼠模型。[0179]如在圖7中所示，注射早期的人來源的星形膠質(zhì)細胞增加hSODl小鼠的存活。圖8證實與假注射相比"第7天(庫(pool))"在BBB轉(zhuǎn)棒性能上的顯著改善(P〈0.05)。[0180]如在圖9中所示，與假注射組相比，"d7"組顯著維持其體重(P〈0.05)。[0181]如在圖10中所示，T1/2統(tǒng)計分析揭示在存活上的顯著增加，如在"第7天"兩個注射組與假注射組相比中觀察到的(P=〇.046)。[0182]盡管結(jié)合其具體實施方案來闡述本發(fā)明，但顯然許多備選方案、修改和變動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。因此，意圖其包括落入隨附權(quán)利要求的精神和廣泛范圍內(nèi)的所有這些備選方案、修改和變動。[0183]本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請均通過引用以其整體結(jié)合到本說明書中，其引用程度如同具體且單獨地指出各單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^引用結(jié)合到本文中。此外，對本申請中任何參考文獻的引用或鑒定，不應(yīng)理解為承認所述參考文獻可用作本發(fā)明的先有技術(shù)。對于節(jié)標題使用的程度，不應(yīng)將其理解為必要限制?！局鳈?quán)項】1.一種篩選用于預(yù)防或治療肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的劑的方法，所述方法包括：(a)使星形膠質(zhì)細胞群體與所述劑接觸，所述星形膠質(zhì)細胞離體分化自多能干細胞(PSC)；(b)將所述步驟(a)的星形膠質(zhì)細胞群體或其調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基與神經(jīng)元群體共培養(yǎng);和(c)定量所述劑增強所述神經(jīng)元群體的存活或神經(jīng)功能的作用。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)元群體為含氧低的、在氧化應(yīng)激下的、在谷氨酸鹽毒性下的或者在AMPA/紅藻氨酸鹽毒性下的。3.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(b)中，所述星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元的群體比率為大于1:1、10:1、100:1、1000:1或10,000:1。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述星形膠質(zhì)細胞表達GFAP、GLAST、AQP4的每一個或其組合。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述星形膠質(zhì)細胞顯示分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，其選自BDNF、⑶NF和VEGF。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述氧化應(yīng)激選自活性氧簇(ROS)、H2〇2及其任何衍生物。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述定量通過計數(shù)處于凋亡下的神經(jīng)元數(shù)量來進行。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述凋亡通過半胱天冬酶-3a標記、膜聯(lián)蛋白V、微管蛋白-B3、HB9或DAPI來檢測。9.權(quán)利要求1的方法，其中所述劑為小分子。10.-種用于在有需要的受試者中治療或預(yù)防ALS進展的方法;所述方法包括將治療上有效量的人祖星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞的細胞群體給予有需要的受試者，所述人祖星形膠質(zhì)細胞和人星形膠質(zhì)細胞離體分化自多能干細胞(PSC)。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述祖星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞表達GFAP、GLAST、AQP4的每一個或其組合。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述祖星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞顯示分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，其選自BDNF、GDNF和VEGF。13.權(quán)利要求10的方法，其中所述祖星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞顯示谷氨酸鹽攝取能力。14.權(quán)利要求10的方法，其中所述給予涉及有需要的受試者的腦脊液、腦或脊髓。15.權(quán)利要求10的方法，其中所述人祖星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞對于所述受試者而言為非自體同源的。16.權(quán)利要求10的方法，其中所述人祖星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞對于所述受試者而言為同種異體的。17.權(quán)利要求10的方法，其中所述人祖星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞為未經(jīng)遺傳修飾的細胞。18.人祖星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞的細胞群體用于制備經(jīng)鑒定用于治療ALS的藥劑的用途，所述人祖星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞離體分化自多能干細胞(PSC)?！疚臋n編號】G01N33/50GK105960453SQ201480054641【公開日】2016年9月21日【申請日】2014年9月23日【發(fā)明人】M.伊茲拉伊,M.雷維,A.哈斯森,K.莫拉坎多夫,J.徹巴斯【申請人】卡迪馬干細胞有限公司