一種神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于神經(jīng)藥理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腦組織為人體結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的組織，其組成細(xì)胞絕大部分為星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，但由于二者相互交織在一起，目前的研宄手段很難將其分離開。這種生理特點的制約下，為了將研宄對象準(zhǔn)確定位于神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)前的神經(jīng)藥理學(xué)研宄均以在體外單獨培養(yǎng)神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞為研宄對象，然后研宄藥物對其的作用及機(jī)制。這種研宄模式最大的缺陷在于不能體現(xiàn)在體神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互影響、相互調(diào)節(jié)作用，因此研宄有其片面性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問題，提供一種神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體的建立方法，包括以下步驟:
[0004]培養(yǎng)試驗動物；從實驗動物中提取分離神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞并分別重懸沉淀；將重懸沉淀后的神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分別接種培養(yǎng)；培養(yǎng)后的神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分別進(jìn)行免疫熒光鑒定；將鑒定后的神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，建立神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體。
[0005]進(jìn)一步的，所述共培養(yǎng)體的建立方法為，將神經(jīng)元細(xì)胞接種于6孔板底部生長1d ;將星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于Transwell小池外側(cè)底部，6h后用D_Hank’ s清洗Transwell小池外側(cè)，洗去未貼壁細(xì)胞，再將Transwell小池插入已接種神經(jīng)元細(xì)胞并生長1d的所述6孔板內(nèi)，在孔內(nèi)加入完全培養(yǎng)基，共培養(yǎng)3d。
[0006]進(jìn)一步的，所述完全培養(yǎng)基為體積比為1:1的10% FBS和2% B27。
[0007]進(jìn)一步的，所述神經(jīng)元細(xì)胞接種于6孔板底部生長1d后細(xì)胞密度為IX 15個/cm2，所述外側(cè)底部接種了星形膠質(zhì)細(xì)胞的Transwell小池插入6孔板前細(xì)胞密度為1.5X 15個 /cm 20
[0008]進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)試驗動物方法為，取SD大鼠種鼠雌性120只，雄性40只，按3:1接種后將雌雄鼠合籠飼養(yǎng)。
[0009]進(jìn)一步的，從實驗動物中提取分離神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞并分別重懸沉淀的方法為，將新生24h內(nèi)的SD大鼠無菌處死，分離皮層至冷D-Hank’ s液中并剪碎成直徑Imm碎塊，先用0.25%胰蛋白酶消化8min，再用10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基終止消化，然后過篩，過篩后150 Xg離心5min，得到神經(jīng)元細(xì)胞，將所述神經(jīng)元細(xì)胞用含2% B27的DMEM-F12培養(yǎng)液重懸沉淀；
[0010]將新生72h內(nèi)的SD大鼠無菌處死，分離皮層至冷D-Hank’S液中并剪碎成直徑Imm碎塊，先用0.25%胰蛋白酶消化8min，再用10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基終止消化，然后過篩，過篩后150Xg離心5min，得到星形膠質(zhì)細(xì)胞，將所述星形膠質(zhì)細(xì)胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培養(yǎng)液重懸沉淀。
[0011]進(jìn)一步的，所述重懸沉淀后的神經(jīng)元細(xì)胞接種培養(yǎng)方法為調(diào)整所述神經(jīng)元細(xì)胞密度至5X 15個/mL，接種于0.01%多聚賴氨酸包被的6孔培養(yǎng)板中，于5% C02、37°C、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)，常規(guī)換液至細(xì)胞基本融合成單層；
[0012]所述重懸沉淀后的星形膠質(zhì)細(xì)胞接種培養(yǎng)方法為調(diào)整所述星形膠質(zhì)細(xì)胞密度至5 X 15個/mL，接種于0.01 %多聚賴氨酸包被的6孔培養(yǎng)板中，于5 % CO 2、37°C、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)，常規(guī)換液至細(xì)胞基本融合成單層，再在37°C、220rpm振蕩18h條件下純化星形膠質(zhì)細(xì)胞2次，換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)Id。
[0013]進(jìn)一步的，所述免疫熒光鑒定方法為，將神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞爬片，將所述細(xì)胞爬片用0.0lM的PBS洗3次，然后用4%多聚甲醛室溫固定lh，再用PBS洗3次，每次5min，再加含 0.5% TritonX-1OO 的山羊血清封閉 30min ;再加 MAP2 (Microtubule AssociatedProtein 2，微管相關(guān)蛋白2)，4°C孵育過夜，過夜后用PBS洗3次，每次5min，滴加FITC-1gG于37°C孵育lh，PBS洗3次，每次5min，滴加DAPI染色5min后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果；
[0014]將星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞爬片，將所述細(xì)胞爬片用0.0lM的PBS洗3次，然后用4%多聚甲醛室溫固定lh，再用PBS洗3次，每次5min，再加含0.5% TritonX-1OO的山羊血清封閉30min ;再加GFAP，4°C孵育過夜，過夜后用PBS洗3次，每次5min，滴加FITC-1gG于37°C孵育lh，PBS洗3次，每次5min，滴加DAPI染色5min后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
[0015]進(jìn)一步的，所述MAP2用PBS稀釋至1: 200，所述GFAP用PBS稀釋至1:200。
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體的建立方法，以原代培養(yǎng)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞為材料，以Transwell小池為骨架建立了兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，兩種細(xì)胞之間既存在一定的相互聯(lián)系，又可以相互分離，從而可以對神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞在共培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行相對獨立的研宄，尤其適用于基于兩種細(xì)胞相互調(diào)控基礎(chǔ)上的生理、病理及藥理研宄，從而解決了在體神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞無法實現(xiàn)有效分離的問題，在神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)研宄中具有較高的實用價值。
【附圖說明】
[0017]圖1所示為本發(fā)明神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體建立方法的共培養(yǎng)體建立前神經(jīng)元細(xì)胞的生長狀態(tài)圖；
[0018]圖2所示為本發(fā)明神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體建立方法的共培養(yǎng)體建立前星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長狀態(tài)圖；
[0019]圖3所示為本發(fā)明神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體建立方法的神經(jīng)元細(xì)胞免疫熒光鑒定圖片；
[0020]圖4所示為本發(fā)明神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體建立方法的星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光鑒定圖片；
[0021]圖5所示為本發(fā)明神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體建立方法得到的共培養(yǎng)體中神經(jīng)元細(xì)胞的生長狀態(tài)圖；
[0022]圖6所示為本發(fā)明神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體建立方法得到的共培養(yǎng)體中星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長狀態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0023]下文將結(jié)合具體附圖詳細(xì)描述本發(fā)明具體實施例。應(yīng)當(dāng)注意的是，下述實施例中描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是孤立的，它們可以被相互組合從而達(dá)到更好的技術(shù)效果。
[0024]本發(fā)明的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體的建立方法，包括以下步驟:
[0025]培養(yǎng)試驗動物；從實驗動物中提取分離神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞并分別重懸沉淀；將重懸沉淀后的神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分別接種培養(yǎng)；培養(yǎng)后的神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分別進(jìn)行免疫熒光鑒定；將鑒定后的神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，建立神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體。
[0026]培養(yǎng)試驗動物。取SD大鼠種鼠雌性120只，雄性40只，按3:1將雌雄鼠合籠飼養(yǎng)，取新生3日齡內(nèi)幼鼠用于皮層神經(jīng)元和星形角質(zhì)細(xì)胞作為原代培養(yǎng)細(xì)胞。
[0027]細(xì)胞分離、重懸沉淀及接種培養(yǎng)。無菌處死新生24h(神經(jīng)元)、72h(星形膠質(zhì)細(xì)胞)內(nèi)的SD大鼠無菌處死并分離皮層至冷D-Hank’ s液中并剪碎成直徑Imm碎塊，0.25%胰