專利名稱：蛋白質(zhì)分離方法中糖的酶促降解的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從含蛋白質(zhì)的植物材料分離蛋白質(zhì)的方法。更具體地說，本發(fā)明提供了一種用于從含蛋白質(zhì)的植物材料分離蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟使含蛋白質(zhì)的植物材料受到一種或多種糖類降解酶的作用，由此獲得包含蛋白質(zhì)和水解的糖類的混合物；并且對步驟(ⅰ)的混合物進(jìn)行分離處理，以使蛋白質(zhì)與水解的糖類分離。
現(xiàn)有技術(shù)蛋白質(zhì)分離物是未水解的天然蛋白質(zhì)的產(chǎn)物，其是從蛋白質(zhì)源(通常是含蛋白質(zhì)的植物源)分離蛋白質(zhì)獲得的。蛋白質(zhì)分離物也被稱作蛋白質(zhì)濃縮物或者純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。蛋白質(zhì)分離物具有各種工業(yè)用途，主要在食物工業(yè)中，例如，用作人和動物營養(yǎng)品，尤其是用作人類嬰兒和幼小動物的產(chǎn)品。
通過利用各種碳?xì)浠衔锾禺愋悦府a(chǎn)生蛋白質(zhì)分離物的方法已有描述。US4,478,856描述了一種用于產(chǎn)生純化的植物蛋白質(zhì)的方法，US3,958,015描述了一種用于濃縮大豆蛋白質(zhì)的方法。
蛋白質(zhì)分離物也可以通過結(jié)合采用水抽提和膜分離技術(shù)產(chǎn)生。這樣的方法由例如Lawhon等[參見，例如Lawhon J T,Rhee KC＆LusasE W；美國油料化學(xué)家學(xué)會雜志，1981 58(3)377-384；和Lawhon JT,Manak L J,Rhee K C,Rhee K S＆Lusas E W；食物科學(xué)雜志，1981 46 (3)912-916+919]進(jìn)行了描述。此外，US 4,420,425和US 5,086,166描述了加工油料種子的方法，該方法包括增溶蛋白質(zhì)，并利用超濾膜分離蛋白質(zhì)組分。
通過利用膜分離技術(shù)，蛋白質(zhì)從伴隨副產(chǎn)物(特別是多糖)得到回收。
通過組合糖降解酶的作用與分離技術(shù)產(chǎn)生蛋白質(zhì)分離物的方法從來沒有人描述過。
發(fā)明概要按照本發(fā)明，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果含蛋白質(zhì)的植物材料受到一種或多種糖類降解酶的作用，則通過分離技術(shù)分離植物蛋白質(zhì)的過程會更有效，并且產(chǎn)生質(zhì)量得到改善的產(chǎn)品。
因此，本發(fā)明提供了一種從含蛋白質(zhì)的植物材料分離蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟(ⅰ)使含蛋白質(zhì)的植物材料受到一種或多種糖類降解酶的作用，由此獲得包含蛋白質(zhì)和水解的糖類的混合物；并且(ⅱ)對步驟(ⅰ)的混合物進(jìn)行分離處理，以使蛋白質(zhì)與水解的糖類分離。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了從含蛋白質(zhì)的植物材料分離蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟使含蛋白質(zhì)的植物材料受到一種或多種糖類降解酶的作用，由此獲得包含蛋白質(zhì)和水解的糖類的混合物；并且對所說的混合物進(jìn)行分離處理，以使蛋白質(zhì)與水解的糖類分離。
通過添加糖降解酶，伴隨的多糖(其構(gòu)成副產(chǎn)物的大多數(shù))被水解成更小的片段，由此增加了主產(chǎn)物(蛋白質(zhì))和副產(chǎn)物之間的大小區(qū)別。因此，按照本發(fā)明的酶處理步驟增加了分離步驟的效率。在分離步驟中，具有更高干物質(zhì)含量的溶液可以被處理，同時產(chǎn)品的質(zhì)量得到改善，特別是就純度和感官性質(zhì)(即沒有不受歡迎的味道、氣味及顏色)而言。蛋白質(zhì)分離物本發(fā)明的方法的產(chǎn)物通常稱作蛋白質(zhì)分離物，蛋白質(zhì)濃縮物或者純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。蛋白質(zhì)基本上是天然蛋白質(zhì)，處理期間還沒有被水解，它們也不是酶促修飾的蛋白質(zhì)。
由本發(fā)明的方法獲得的蛋白質(zhì)分離物的干物質(zhì)含量的80％以上(重量)由蛋白質(zhì)構(gòu)成，優(yōu)選地，90％以上(重量)由蛋白質(zhì)構(gòu)成。
由本發(fā)明的方法分離的蛋白質(zhì)對摻入進(jìn)食物產(chǎn)品來說特別有用。含蛋白質(zhì)的植物材料用于本發(fā)明的方法的含蛋白質(zhì)的植物材料可以是任何植物來源的包含蛋白質(zhì)的材料，以及從它們產(chǎn)生的材料。含蛋白質(zhì)的植物材料優(yōu)選地是谷類，玉米，稻米，高粱，小麥，大豆，蠶豆，豇豆，木薯，芝麻，花生，豌豆，棉花，油料種子，以及薯蕷屬植物。含蛋白質(zhì)的植物材料可以來自植物源或者植物材料，例如通過磨碎，粉碎或研磨獲得的，如面粉，脫脂大豆或豆瓣。
含蛋白質(zhì)的植物材料優(yōu)選地是基本上無纖維的。糖類降解酶本發(fā)明的方法包括使含蛋白質(zhì)的植物材料受到一種或多種糖類降解酶的作用。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于所說的方法的一種或多種酶是糖苷酶(EC 3.2)。
在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于所說的方法的一種或多種酶是淀粉酶，特別是α-淀粉酶或β-淀粉酶、阿糖酶、呋喃阿糖苷酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸乙?；ッ浮⒐z裂合酶、木聚糖酶、纖維素酶、β-葡糖苷酶、纖維二糖水解酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶和/或葡糖醛酸糖苷酶。
為了獲得天然蛋白質(zhì)的分離物，酶制劑應(yīng)該實(shí)質(zhì)上沒有蛋白水解酶，因?yàn)檫@些酶會降解所討論的蛋白質(zhì)，由此將其轉(zhuǎn)變成修飾的蛋白質(zhì)。微生物來源本發(fā)明的糖苷酶可以從任何已知來源獲得。糖苷酶優(yōu)選地可以從微生物來源獲得，所說的微生物特別是絲狀真菌或者酵母，以及細(xì)菌。
具體地說，淀粉酶可以來自頂孢霉屬的菌株，產(chǎn)堿菌屬的菌株(特別是廣泛產(chǎn)堿菌)，曲霉屬的菌株(特別是Aspergillus kawachii和米曲霉)，芽孢桿菌屬的菌株(特別是解淀粉芽孢桿菌，地衣型芽孢桿菌，多粘芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌以及嗜熱脂肪芽孢桿菌)，硫還原球菌屬的菌株(特別是粘硫還原球菌)，閃爍桿菌屬的菌株，乳酸桿菌的菌株，微球菌屬的菌株，假單胞菌屬的菌株(特別是淀粉皮假單胞菌)，熱球菌屬的菌株(特別是激烈熱球菌和沃氏熱球菌)，熱網(wǎng)菌屬的菌株，硫化葉菌屬的菌株，葡萄嗜熱菌屬的菌株，或者熱球菌屬的菌株。
阿聚糖酶可以來自棘孢曲霉的菌株。
半乳聚糖酶可以來自曲霉屬的菌株(特別是棘孢曲霉)，腐質(zhì)霉屬的菌株(特別是Humicola insolens)，毀絲霉屬的菌株(特別是Myceliophthora thermophila)，或者M(jìn)eripilus的菌株(特別是Meripilus giganteuus)。
半乳糖苷酶(α-半乳糖苷酶或β-半乳糖苷酶)可以是細(xì)菌來源的，并且來自大腸桿菌的菌株，或芽孢桿菌屬的菌株(特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌)，或者其可以是真菌來源的，并且來自曲霉屬的菌株(特別是棘孢曲霉，無花果曲霉，黑曲霉和米曲霉)，克雷伯氏菌屬的菌株(特別是植生克雷伯氏菌)，脈孢菌屬的菌株，或根霉屬的菌株，或者其可以來自酵母，優(yōu)選地是酵母屬的菌株(特別是釀酒酵母和油脂酵母)。
聚半乳糖醛酸酶可以來自曲霉屬的菌株(特別是棘孢曲霉和黑曲霉)，或歐文氏菌屬的菌株(特別是胡蘿卜軟腐歐文氏菌)。
果膠甲基酯酶可以來自曲霉屬的菌株(特別是棘孢曲霉)。
鼠李糖半乳糖醛酸酶可以來自曲霉屬的菌株，特別是棘孢曲霉，日本曲霉的菌株，以及耙菌屬的菌株(特別是乳白耙菌)。
鼠李糖半乳糖醛酸乙?；ッ缚梢詠碜郧箤俚木?特別是棘孢曲霉)。
木聚糖酶可以是真菌來源的，并且可以來自曲霉屬的菌株(特別是棘孢曲霉，泡盛曲霉，Aspergillus kawachii，構(gòu)巢曲霉，黑曲霉以及塔賓曲霉)，短梗霉屬的菌株，毛殼菌屬的菌株(特別是細(xì)麗毛殼)，旋孢腔菌屬的菌株(特別是Cochliobolus carbonum)，Disporotrichum的菌株(特別是Disporotrichumdimorphosporum)，腐質(zhì)霉屬的菌株(特別是Humicola insolens)，Neocallimastix的菌株(特別是Neocallimastix patriciarum)，Orpinomyces sp.的菌株，青霉屬的菌株(特別是微紫青霉)，Thermomyces的菌株(特別是Thermomyces lanuginosus(別名Humicola lanuginosa))，或木霉屬的菌株(特別是Trichodermalongibrachiatum和Trichoderma resii)，或者其是細(xì)菌來源的，并且可以來自芽孢桿菌屬的菌株(特別是環(huán)狀芽孢桿菌，短小芽胞桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，以及枯草芽孢桿菌)，纖維單胞菌屬的菌株(特別是糞肥纖維單胞菌)，梭菌屬的菌株(特別是熱纖梭菌)，網(wǎng)球菌屬的菌株(特別是嗜熱網(wǎng)球菌)，小四孢菌屬的菌株(特別是柔曲小四孢菌)，鏈霉菌屬的菌株(特別是淺青紫鏈霉菌)，以及產(chǎn)橄欖色鏈霉菌，或高溫單孢菌屬的菌株，或者其可以是酵母來源的，并且可以來自短梗霉屬的菌株。
纖維素酶可以來自Bacterioides的菌株，纖維單胞菌屬的菌株(特別是糞肥纖維單胞菌)，梭菌屬的菌株(特別是熱纖梭菌)，歐文氏菌屬的菌株(特別是Erwinia chrysanthermis)，鐮孢菌屬的菌株(特別是尖鐮孢)，腐質(zhì)霉屬的菌株(特別是Humicola insolens和Humicola lanuginosa(別名Thermomyces lanuginosus)，小雙孢菌屬的菌株(特別是雙孢小雙孢菌)，毀絲霉屬的菌株(特別是Myceliopthora thermophile),Neocallimastix的菌株(特別是Neocallimastix frontalis),Piromonas的菌株(特別是Piromonascommunis)，假單胞菌屬的菌株，三毛孢屬的菌株，瘤胃球菌屬的菌株，Sphaeromonas的菌株(特別是Sphaeromonas communis)，木霉屬的菌株(特別是綠色木霉，Trichoderma reesei和康寧木霉)，或Thermonospora的菌株。
在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了一種包含多種酶活性的酶制劑，例如由Humicola insolens的菌株產(chǎn)生的多活性β-葡聚糖酶制劑。這樣一種制劑以商品名UltrafloTM出售，其是由Humicolainsolens產(chǎn)生的多活性β-葡聚糖酶制劑，可以從丹麥的Novo NordiskA/S獲得。
在另一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用了一種含有寬范圍的糖酶的多酶復(fù)合物，所說的糖酶包括從曲霉屬獲得的阿聚糖酶，纖維素酶，β-葡聚糖酶，半纖維素酶以及木聚糖酶。這樣一種制劑以商品名ViscozymeTM出售，可以從丹麥的Novo Nordisk A/S獲得。
在另一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用了一種由Trichodermareesei的深層發(fā)酵獲得的酶制劑。這樣一種制劑以商品名CelluclastTM出售，可以從丹麥的Novo Nordisk A/S獲得。工藝操作條件和設(shè)備本發(fā)明的方法包括步驟(ⅰ)使含蛋白質(zhì)的植物材料受到一種或多種糖類降解酶的作用，由此獲得包含蛋白質(zhì)和水解的糖類的混合物；和步驟(ⅱ)對步驟(ⅰ)的混合物進(jìn)行分離處理，以使蛋白質(zhì)與水解的糖類分離。
步驟(ⅰ)和步驟(ⅱ)可以作為兩個連續(xù)的步驟進(jìn)行，或它們可以同時完成。本發(fā)明的方法也可以作為批量處理或持續(xù)的過程實(shí)施。如果本發(fā)明的方法作為持續(xù)的過程實(shí)施，則步驟(ⅰ)和步驟(ⅱ)優(yōu)選地是同時進(jìn)行。
本發(fā)明的方法可以如本領(lǐng)域中所描述的[參見例如Olsen H S；通過抽提，離心，超濾和噴霧干燥連續(xù)中試生產(chǎn)大豆蛋白質(zhì)；Lebensm.Wiss.u.Technol.1978 11 57-64；和Olsen H S＆Adler-NissenJ；在酶促修飾蛋白質(zhì)的生產(chǎn)期間應(yīng)用超濾和超過濾方法；美國化學(xué)會專題研討系列，1981 154(10)133-169]。
分離處理可以利用任何方便的分離技術(shù)完成，特別是膜分離技術(shù)，如超濾，滲濾，微量過濾，毫微量過濾，超過濾等。
可以利用具有適于所討論的蛋白質(zhì)的截斷值的膜完成膜分離。對于許多場合的使用而言，所說的膜可以具有約2,000到約200,000的理論分子量截斷值，更優(yōu)選的是約5,000到約150,000，最優(yōu)選的是約70,000到約100,000。
如果步驟(ⅰ)已經(jīng)完成，則步驟(ⅱ)的pH值可以在從約4到約9的范圍內(nèi)，溫度可以在約5到約65℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在約50到約65℃的范圍內(nèi)。如果步驟(ⅰ)和(ⅱ)同時進(jìn)行，則pH和溫度必須適合步驟(ⅰ)中使用的糖降解酶的需要。
本發(fā)明的方法可以采用常規(guī)用于降解糖類的劑量的糖降解酶完成。現(xiàn)在預(yù)期，在約0.1％到約10％w/w干物質(zhì)組合物的酶蛋白質(zhì)是合適的。工業(yè)實(shí)用性由本發(fā)明的方法獲得的蛋白質(zhì)分離物可以具有各種工業(yè)實(shí)用性。所說的蛋白質(zhì)分離物用作人和動物營養(yǎng)品，尤其是用作人類嬰兒和幼小動物的產(chǎn)品特別有用。
因此，另一方面，本發(fā)明提供了包含由本發(fā)明的方法獲得的蛋白質(zhì)分離物的食物產(chǎn)品。
實(shí)施例以下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，這些實(shí)施例無意于以任何方式限制所要求的本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1制備大豆蛋白質(zhì)分離物在55℃下，將55kg具有高NSI(大于70)的脫脂大豆蛋白質(zhì)(來源于Loders Crooklaan的UnisoyTM800)加入到305 kg水中。在20分鐘期間用NaOH將pH值調(diào)節(jié)至8.5。
通過離心對混合物進(jìn)行分離(沉淀物上清液=60∶40)。向沉淀物中添加水至初始體積，并再次分離。
向兩種上清液(420升，7.4 Brix)中加入2％UltrafloTM(來自丹麥的Novo Nordisk A/S)，基于Brix干物質(zhì)=621g(UltrafloTM是一種多活性β-葡聚糖酶制劑，由一種選擇的Humicola insolens的菌株產(chǎn)生，其中占優(yōu)勢的活性是纖維素酶，木聚糖酶，戊聚糖酶以及阿聚糖酶活性)。
對混合物進(jìn)行超濾(包括滲濾)。所利用的設(shè)備是安裝有FC 100膜(具有100,000的理論分子量截斷值)的PCI Membrane SystemsTM。在12-13 Brix下進(jìn)行濃縮和滲濾。
閃爍處理和噴霧干燥(Tin=200C,Tout=80C)。
終產(chǎn)物是大豆蛋白質(zhì)分離物，具有超過90％w/w的干固體蛋白質(zhì)，具有很高的溶解性和良好的感官性質(zhì)。
實(shí)施例2制備大豆蛋白質(zhì)分離物在62-63℃的溫度下，將在pH6.5下具有55％的PSI的非烘烤脫脂大豆粉與水混合至10％干物質(zhì)含量。用4N NaOH將漿狀物的pH值調(diào)節(jié)至8.5。
加入基于干物質(zhì)的2％的UltrafloTM(UltrafloTM是一種多活性β-葡聚糖酶制劑，由一種選擇的Humicola insolens的菌株產(chǎn)生，其中占優(yōu)勢的活性是纖維素酶，木聚糖酶，戊聚糖酶以及阿聚糖酶活性)。在保持30分鐘后，通過兩個離心步驟從漿狀物提取可溶性蛋白質(zhì)，由此得到約90％的提取效率。
在第一次離心之后，仍然在62-63℃下用去離子水再次稀釋沉淀物，進(jìn)行第二次離心步驟，此后棄去漿狀物。
用加料槽收集兩次離心的離心液至第一個超濾單元中。
優(yōu)選的是，在混合、抽提和超濾1期間，處理液體的溫度保持在60℃以上，以限制細(xì)菌生長，在混合和抽提期間溫度也保持在64-65℃以下，以阻止蛋白質(zhì)變性，顏色過深和感官性質(zhì)下降。
超濾離心液，以從蛋白質(zhì)抽提物中洗去糖類和鹽。濃縮離心液至最多5.5％DS，添加去離子水滲透，直到％DS(滲透物)/％DS(滲余物)=0.09然后，濃縮滲余物至9-10％DS。棄去滲透物。
于125℃下用巴氏法滅菌滲余物3-4秒，以降低產(chǎn)物中的細(xì)菌計數(shù)。
濃縮液體，并于55℃在PCI Membrane Systems的AFC 30膜上經(jīng)毫微量過濾脫鹽。假如低滲透性是所需的，可以在最終濃縮前進(jìn)行添加去離子水的滲濾。
由于低的通量，在30° Brix時，終止毫微量過濾。
噴霧-干燥蛋白質(zhì)分離物，并且在Tin 200℃下聚結(jié)。噴霧-干燥過的粉末中的含水量最好是在6.5％以下，以達(dá)到粉末的滿意的穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1．一種從含蛋白質(zhì)的植物材料分離蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟(ⅰ)使含蛋白質(zhì)的植物材料受到一種或多種糖類降解酶的作用，由此獲得包含蛋白質(zhì)和水解的糖類的混合物；并且(ⅱ)對步驟(ⅰ)的混合物進(jìn)行分離處理，以使蛋白質(zhì)與水解的糖類分離。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的糖降解酶是糖苷酶(EC3.2)。
3．按照權(quán)利要求2的方法，其中所說的糖苷酶是淀粉酶，特別是α-淀粉酶或β-淀粉酶、阿糖酶、呋喃阿糖苷酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸乙?；ッ?、果膠裂合酶、木聚糖酶、纖維素酶、β-葡糖苷酶、纖維二糖水解酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶和/或葡糖醛酸糖苷酶。
4．按照權(quán)利要求1-3之任一的方法，其中所說的含蛋白質(zhì)的植物材料是玉米、稻米、高粱、小麥、大豆、蠶豆、豇豆、木薯、芝麻、花生、豌豆、棉花、油料種子、和/或薯蕷屬植物，或者來源于它們的含蛋白質(zhì)的植物材料。
5．按照權(quán)利要求4的方法，其中所說的含蛋白質(zhì)的植物材料是通過以下方法獲得的在水溶液中懸浮含蛋白質(zhì)的植物材料，對溶液進(jìn)行離心，并且回收上清液。
6．按照權(quán)利要求5的方法，其中所說的含蛋白質(zhì)的植物材料是通過以下方法獲得的于pH7以上在水溶液中懸浮含蛋白質(zhì)的植物材料，對溶液進(jìn)行離心，并且回收上清液。
7．按照權(quán)利要求5-6兩者之一的方法，其中所說的含蛋白質(zhì)的植物材料是脫脂大豆。
8．按照權(quán)利要求1-7之任一的方法，其中按照步驟(ⅱ)的分離處理是通過膜過濾，特別是超濾，滲濾，或者微量過濾完成的。
9．按照權(quán)利要求8的方法，其中的膜過濾步驟是利用具有約2,000到約1,000,000的理論分子量截斷值的膜完成的。
10．按照權(quán)利要求9的方法，其中的膜過濾步驟是利用具有約2,000到約200,000的理論分子量截斷值的膜完成的。
11．按照權(quán)利要求1-10之任一的方法，其中的步驟(ⅰ)的酶劑量在約0.1％到約10％w/w干物質(zhì)組合物的酶蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)。
12．按照權(quán)利要求1-11之任一的方法，其中的步驟(ⅰ)和步驟(ⅱ)是同時進(jìn)行的。
13．按照權(quán)利要求1-11之任一的方法，其是作為一個連續(xù)過程進(jìn)行的。
14．按照權(quán)利要求1-11之任一的方法，其中的步驟(ⅰ)和步驟(ⅱ)是作為兩個接續(xù)的步驟進(jìn)行的。
15．按照權(quán)利要求1-11之任一的方法，其是作為批量處理進(jìn)行的。
16．一種食物產(chǎn)品，其包含由按照權(quán)利要求1-15之任一的方法獲得的蛋白質(zhì)分離物。
全文摘要
本發(fā)明涉及從含蛋白質(zhì)的植物材料分離蛋白質(zhì)的方法。更具體地說,本發(fā)明提供了一種用于從含蛋白質(zhì)的植物材料分離蛋白質(zhì)的方法,該方法包括以下步驟:使含蛋白質(zhì)的植物材料受到一種或多種糖類降解酶的作用,由此獲得包含蛋白質(zhì)和水解的糖類的混合物;并且對步驟(i)的混合物進(jìn)行分離處理,以使蛋白質(zhì)與水解的糖類分離。
文檔編號C07K1/00GK1230965SQ9719798
公開日1999年10月6日 申請日期1997年8月28日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月16日
發(fā)明者P·M·尼爾森, O·R·漢森 申請人:諾沃挪第克公司