通過(guò)酶的ph-穩(wěn)定化來(lái)提高產(chǎn)率的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及提高來(lái)源于親本酶的變體酶的產(chǎn)率或生產(chǎn)力的方法，所述方法包括選擇產(chǎn)生變體酶的宿主細(xì)胞的步驟，該變體酶至少具有該親本酶的酶比活性以及在5?9的pH范圍內(nèi)的提高的pH?穩(wěn)定性。
【專利說(shuō)明】通過(guò)酶的PH-穩(wěn)定化來(lái)提高產(chǎn)率
[0001] 對(duì)序列表的引用
[0002] 本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。該計(jì)算機(jī)可讀形式通過(guò)引用結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及提高來(lái)源于親本酶的酶變體的產(chǎn)率或生產(chǎn)力的方法，所述方法包括選 擇產(chǎn)生酶變體的宿主細(xì)胞的步驟，該酶變體至少具有親本酶的酶比活性以及在5-9的pH范 圍內(nèi)的提高的pH-穩(wěn)定性。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 長(zhǎng)期以來(lái)，酶被蛋白質(zhì)工程化以便產(chǎn)生人工變體，以提供或調(diào)節(jié)某些感興趣的特 性，例如，pH依賴性活性、熱穩(wěn)定性、底物裂解模式、裂解比活性、底物特異性和/或底物結(jié)合 (W0 0151620 A2)。
[0006] 鑒定適合作為蛋白質(zhì)工程化的靶標(biāo)以提高感興趣的酶的產(chǎn)率或生產(chǎn)力的篩選特 性對(duì)于酶的工業(yè)化制造而言將是非常令人感興趣的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在于此提供的實(shí)例中，出人意料地顯示出酶的pH穩(wěn)定性的增加（即，酶在一定pH水 平下經(jīng)過(guò)一些時(shí)間之后保留其活性的能力的增加)與產(chǎn)率和/或生產(chǎn)力的顯著提高相關(guān)。 [0008]因此，在本發(fā)明的第一方面提供了提高酶的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)力的方法，所述方法包 括以下步驟：
[0009] a)提供宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包括編碼感興趣的親本酶的一種或多種變體的突變 多核苷酸的表達(dá)基因文庫(kù)，其中與親本酶相比，該一種或多種變體包括至少一個(gè)氨基酸改 變；
[0010] b)在有益于產(chǎn)生該一種或多種變體酶的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；
[0011] c)選擇產(chǎn)生變體酶的宿主細(xì)胞，該變體酶至少具有親本酶的酶比活性以及在5-9 的pH范圍內(nèi)的提高的pH-穩(wěn)定性，其中與親本的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)力相比，該變體酶的產(chǎn)率和/ 或生產(chǎn)力得到提高;并且任選地
[0012] d)回收該變體酶。
[0013] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0014]圖1示出了實(shí)例1的枯草芽孢桿菌MDT99(包括染色體整合親本普魯蘭酶編碼基因 的極低蛋白酶(S-l 1)菌株）的普魯蘭酶表達(dá)水平，其與枯草芽孢桿菌HyGe380(具有染色體 整合變體8編碼基因的相同背景宿主菌株）的普魯蘭酶表達(dá)水平進(jìn)行比較。結(jié)果顯示變體8 具有提尚的表達(dá)。
[0015] 發(fā)明詳述
[0016] 本發(fā)明的第一方面提供了提高酶的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)力的方法，所述方法包括以下 步驟：
[0017] a)提供宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包括編碼感興趣的親本酶的一種或多種變體的突變 多核苷酸的表達(dá)基因文庫(kù)，其中與親本酶相比，該一種或多種變體包括至少一個(gè)氨基酸改 變；
[0018] b)在有益于產(chǎn)生該一種或多種變體酶的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；
[0019] c)選擇產(chǎn)生變體酶的宿主細(xì)胞，該變體酶至少具有親本酶的酶比活性以及在5-9 的pH范圍內(nèi)的提高的pH-穩(wěn)定性，其中與親本的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)力相比，該變體酶的產(chǎn)率和/ 或生產(chǎn)力得到提高;并且任選地
[0020] d)回收該變體酶。
[0021] 編碼序列：術(shù)語(yǔ)"編碼序列"或"編碼……的多核苷酸"意指直接指定多肽氨基酸序 列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般由開(kāi)放閱讀框架決定，該開(kāi)放閱讀框架從起始密碼子 (如ATG、GTG或TTG)開(kāi)始并且以終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結(jié)束。編碼序列可以是基因組 DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0022]控制序列：術(shù)語(yǔ)"控制序列"意指對(duì)于表達(dá)編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必 需的核酸序列。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼該多肽的多核苷酸來(lái)說(shuō)可以是天然的（即，來(lái)自相同 基因）或外源的（即，來(lái)自不同基因），或相對(duì)于彼此是天然的或外源的。此類控制序列包括 但不限于前導(dǎo)子、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少， 控制序列包括啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。出于引入有利于將這些控制序列與編碼多 肽的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，這些控制序列可以提供有多個(gè) 接頭。
[0023] 表達(dá):術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修 飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。
[0024] 表達(dá)載體:術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"意指線性或環(huán)狀DNA分子，該分子包括編碼多肽的多核 苷酸并且該多核苷酸可操作地與提供用于其表達(dá)的控制序列相連接。
[0025] 突變的多核苷酸:編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的修飾對(duì)于合成基本上類似于該多 肽的多肽可以是必需的。術(shù)語(yǔ)"基本上類似"于該多肽是指該多肽的非天然存在的形式。這 些多肽可能以某種工程化方式而不同于從其天然來(lái)源分離的多肽，例如在比活性、熱穩(wěn)定 性、最適pH等方面不同的變體。這些變體可以基于以SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3或SEQ ID NO: 15的成熟多肽編碼序列(例如其子序列)形式呈現(xiàn)的多核苷酸，和/或通過(guò)引入不會(huì)改變 該多肽的氨基酸序列，但對(duì)應(yīng)于預(yù)期用于產(chǎn)生該酶的宿主有機(jī)體的密碼子用法的核苷酸取 代，或通過(guò)引入可能產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代來(lái)構(gòu)建。對(duì)于核苷酸取代的一般描 述，參見(jiàn)例如福德（Ford)等人，1991，蛋白質(zhì)表達(dá)與純化（Protein Expression and Purification)2:95-107。
[0026] 可以做出單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用誘變、重組和/或改組 的已知方法進(jìn)行測(cè)試，隨后進(jìn)行相關(guān)篩選程序，如由里德哈爾-奧爾森(Reidhaar-Olson)和 薩奧爾（Sauer )，1988，科學(xué)（Science) 241:53-57;博維(Bowie)和薩奧爾，1989，美國(guó)國(guó)家科 學(xué)院院刊（Proc .Natl .Acad· Sci .USA)86:2152-2156 ;W0 95/17413;或W0 95/22625披露的 那些?？梢允褂玫钠渌椒òㄒ族e(cuò)PCR、噬菌體展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物 化學(xué)(Biochemistry)30:10832-10837;美國(guó)專利號(hào)5,223,409;TO 92/06204)以及區(qū)域定向 誘變(德比什爾（Derbyshire)等人，1986,基因（Gene)46:145;內(nèi)爾（Ner)等人，1988，DNA 7: 127)。
[0027] 可以結(jié)合誘變/改組方法與高通量自動(dòng)化篩選方法來(lái)檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆 的、誘變的多肽的活性（內(nèi)斯(Ness)等人，1999,自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology) 17: 893-896)。編碼活性多肽的誘變的DNA分子可以回收自宿主細(xì)胞，并且使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方 法對(duì)其進(jìn)行迅速測(cè)序。這些方法允許迅速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。
[0028] 保守取代的實(shí)例是在下組的范圍內(nèi)：堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸及組氨酸）、酸性 氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸(亮氨酸、 異亮氨酸及纈氨酸）、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨 酸、絲氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸）。一般不會(huì)改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的并且 例如由H.諾伊拉特(Neurath)和R.L.希爾(Hill)，1979，在蛋白質(zhì)（The Proteins)，學(xué)術(shù)出 版社(Academic Press)，紐約中描述。常見(jiàn)的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Se;r、 Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/ Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及 Asp/Gly。
[0029] 可替代地，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)：改變多肽的物理化學(xué)特性。例如，氨基酸 改變可以改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適pH等。
[0030] 可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的程序，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變（坎寧漢 (Cunningham)和威爾斯(Wells)，1989,科學(xué)（Science)244:1081-1085)來(lái)鑒定多肽中的必 需氨基酸。在后一項(xiàng)技術(shù)中，在該分子中的每個(gè)殘基處引入單個(gè)丙氨酸突變，并且對(duì)所得突 變體分子的酶活性進(jìn)行測(cè)試以鑒定對(duì)于該分子的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。還參見(jiàn)，希 爾頓(Hilton)等人，1996,生物化學(xué)雜志:4699-4708。也可結(jié)合假定接 觸位點(diǎn)氨基酸的突變，如通過(guò)以下技術(shù)例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記進(jìn) 行確定，對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理學(xué)分析，從而確定酶的活性位點(diǎn)或其他生物學(xué)相互作用。參見(jiàn)例 如，德沃斯(de Vos)等人，1992,科學(xué)（Science)255:306-312;史密斯(Smith)等人，1992,分 子生物學(xué)雜志(11〇1.8丨〇1.)224 :899-904;烏樂(lè)達(dá)維爾(11〇(1&￥6〇等人，1992，歐洲生化學(xué) 會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(FEBS Lett.)309:59-64。還可以從與相關(guān)多肽的比對(duì)推斷鑒定必需氨基酸。 [0031]具有酶活性的多肽的來(lái)源
[0032] 本發(fā)明的具有酶活性的多肽可以從任何屬的微生物中獲得。出于本發(fā)明的目的， 如在此結(jié)合給定的來(lái)源使用的術(shù)語(yǔ)"從…中獲得"應(yīng)意指由多核苷酸編碼的多肽是由該來(lái) 源或者由其中已經(jīng)插入來(lái)自該來(lái)源的多核苷酸的菌株產(chǎn)生的。在一方面，從給定來(lái)源中獲 得的多肽被分泌到細(xì)胞外。
[0033] 該多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，該多肽可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽，如具有[酶]活 性的芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、腸球菌屬(Enterococcus)、土芽孢桿 菌屬(Geobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、海洋芽抱桿菌 屬(Oceanobacillus)、葡萄球菌屬（Staphylococcus)、鏈球菌屬（Streptococcus)或鏈霉菌 屬(Streptomyces)多肽;或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如彎曲桿菌屬(Campylobacter)、大腸桿 菌（E. coli)、黃桿菌屬（Flavobacterium)、梭桿菌屬（Fusobacterium)、螺桿菌屬 (Helicobacter)、泥桿菌屬（Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬（Neisseria)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、沙門(mén)氏菌屬（Salmone 11a)或脈原體屬(Ureaplasma)多肽。
[0034] 在一方面，該多肽是嗜酸性普魯蘭芽孢桿菌(Bacillus acidopullulyticus)、嗜 喊芽抱桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、 短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌 (Bacillus clausii)、凝結(jié)芽抱桿菌（Bacillus coagulans)、脫支芽抱桿菌（Bacillus deramificans)、堅(jiān)強(qiáng)芽抱桿菌（Bacillus firmus)、燦爛芽抱桿菌（Bacillus lautus)、遲 緩芽抱桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽抱桿菌 (Baci 1 lus megaterium)、短小芽孢桿菌（Baci 1 lus pumi lus )、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtil is)、或蘇云金桿菌 (Bacillus thuringiensis)多肽。
[0035] 在另一方面，該多肽是似馬鏈球菌（Streptococcus equisimilis)、釀膿鏈球菌 (Streptococcus pyogenes)、乳房鏈球菌（Streptococcus uberis)、或馬鏈球菌獸痕亞種 (Streptococcus equi subsp·Zooepidemicus)多月太。
[0036] 在另一方面，該多肽是不產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces achromogenes)、除蟲(chóng)鏈霉菌 (Streptomyces a vermi til is)、天藍(lán)鏈霉菌（Streptomyces coelicolor)、灰色鏈霉菌 (Streptomyces griseus)、或淺青紫鏈霉菌（Streptomyces lividans)^|i：〇
[0037] 該多肽可以是真菌多肽。例如，該多肽可以是酵母多肽，如假絲酵母屬(Candida)、 克魯弗酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母 屬(5(31112083(3(31^1'01117〇68)、或耶氏酵母屬(￥31'1'0￥13)多肽;或絲狀真菌多肽，例如枝頂孢 霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格抱屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短 梗霉屬(Aureobasidium)、葡萄座腔菌屬（Botryospaeria)、擬錯(cuò)菌屬（Ceriporiopsis)、毛 口彖殼屬（Chaetomidium)、金孢子菌屬（Chrysosporium)、麥角菌屬（Claviceps)、旋孢腔菌屬 (Cochliobolus)、鬼傘屬（Coprinopsis)、乳白蟻屬（Coptotermes)、棒囊殼屬 (〇0巧1^8(3118)、隱叢赤殼菌屬（(^7口110116(^1'13)、隱球菌屬（(^7口七0(30(3(3118)、色二抱屬 (Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、線黑粉酵母屬(Filibasidium)、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬 (Gibberella)、全鞭毛蟲(chóng)屬（Holomast igotoides )、腐質(zhì)霉屬（Humicola)、祀齒菌屬 (Irpex)、香燕屬（Lentinula)、小腔球菌屬（Leptospaeria)、梨孢菌屬(Magnaporthe)、黑果 菌屬（Melanocarpus)、亞灰樹(shù)花菌屬（Meripilus)、毛霉屬（Mucor)、毀絲霉屬 (]\^061；!_(^1^110^)、新美鞭菌屬(心00311；!_11^8^1)、鏈抱菌屬（心111'08口0^)、擬青霉屬 (Paecilomyces)、青霉菌屬（Penicillium)、平革菌屬（Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬 (Piromyces)、Poitrasia、假黑盤(pán)菌屬（Pseudoplectania)、假披發(fā)蟲(chóng)屬 (卩8611(1〇丨1'；!_(311〇町11^1^)、根毛霉菌屬（1?1112〇11111(3〇1')、裂糟菌屬（3(31112(^1171111111)、柱頂抱屬 (Scytalidium)、籃狀菌屬（Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus)、梭孢殼霉屬 (Thielavia)、彎頸霉屬（Tolypocladium)、木霉屬（Tri choderma )、長(zhǎng)毛盤(pán)菌屬 (1'1'：[(3110卩11&6&)、輪枝孢屬（\^1^;!_(3；!_11;!_11111)、小包腳燕屬（￥01￥&1^611&)、或炭角菌屬 (Xylaria)多肽。
[0038] 在另一方面，該多肽是卡氏酵母（Saccharomyces car lsber gens is)、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母（Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母 (Saccharomyces douglasii)、克魯弗酵母（Saccharomyces kluyveri)、諾地酶母 (Saccharomyces norbensis)、或卵形酉孝母(Saccharomyces oviformis)多月太。
[0039] 在另一方面，該多肽是解纖維枝頂孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉 (Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori )、臭曲霉（Aspergillus foetidus)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢 曲霉（Aspergillus nidulans)、黑曲霉（Aspergillus niger)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、狹邊金孢子菌（Chrysosporium inops)、嗜角質(zhì)金孢子菌（Chrysosporium keratinophilum)、盧克諾文思金抱子菌（Chrysosporium lucknowense)、類狀金抱子菌 (Chrysosporium merdarium)、毯金抱子菌（Chrysosporium pannicola)、昆士蘭金抱子菌 (Chrysosporium queenslandicum)、熱帶金抱子菌（Chrysosporium tropicum)、帶紋金抱 子菌（Chrysosporium zona turn)、桿抱狀鏡抱（Fu sari um bactr id io ides )、禾谷鏡抱 (Fusarium cerealis)、庫(kù)威鏡抱（Fusarium crookwellense)、黃色鏡抱菌（Fusarium culmorum)、禾谷鏡抱菌（Fusarium graminearum)、禾赤鏡抱(Fusarium graminum)、異抱鏡 抱(Fusarium heterosporum)、合歡木鏡抱(Fusarium negundi)、尖抱鏡抱菌（Fusarium oxysporum)、多枝鏡抱(Fusarium reticulatum)、粉紅鏡抱菌(Fusarium roseum)、接骨木 鏡抱（Fusarium sambucinum)、膚色鏡抱（Fusarium sarcochroum)、擬枝抱鏡抱菌 (Fusarium sporotrichioides)、硫色鏡抱菌（Fusarium sulphureum)、圓鏡抱（Fusarium torulo sum)、擬絲抱鏡抱菌（Fusarium trie ho thecioides)、鑲片鏡抱菌（Fusarium venenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)、疏棉狀腐質(zhì) 霉(Humicola lanuginosa)、白囊耙齒菌（Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜熱 毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糖脈抱菌（Neurospora crassa)、繩狀青霉菌 (Penicillium funiculosum)、產(chǎn)紫青霉（Penicillium purpurogenum)、黃抱原毛平革菌 (Phanerochaete chrysosporium)、無(wú)色梭抱殼（Thielavia achromatica)、成層梭抱殼菌 (Thielavia albomyces)、白毛梭抱殼(Thielavia albopilosa)、澳洲梭抱殼(Thielavia australeinsis)、類梭抱殼(Thielavia fimeti)、小抱梭抱殼(Thielavia microspora)、卵 孢梭孢殼（Thielavia ovispora)、秘魯梭孢殼（Thielavia peruviana)、毛梭孢殼 (Thielavia setosa)、瘤抱梭抱殼（Thielavia spededonium)、耐熱梭抱殼（Thielavia subthermophi la)、土生梭抱殼（Thielavia terrestris)、哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、康寧木霉（Trichoderma koningii )、長(zhǎng)枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉（Trichoderma reesei)、或綠色木霉（Trichoderma viride) 多肽。
[0040]將理解的是，對(duì)于以上提到的物種而言，本發(fā)明涵蓋完全狀態(tài)和不完全狀態(tài) (perfect and imperfect states)二者、以及其他分類學(xué)等效物，例如無(wú)性型，而不管它們 已知的物種名稱是什么。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地識(shí)別適當(dāng)?shù)刃锏纳矸荨?br>[0041]這些物種的菌株可以容易地在許多培養(yǎng)物保藏中心為公眾所獲得，如美國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心（ATCC)、德國(guó)微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷蘭菌種保藏中心（Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美國(guó)農(nóng)業(yè)研究服務(wù)專利培養(yǎng)物保藏中心北方地區(qū)研究 中心(NRRL)〇
[0042]可以使用以上提到的探針從其他來(lái)源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等等） 分離的微生物或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)獲得的DNA樣品鑒定和獲得該 多肽。用于從自然生活環(huán)境中直接分離微生物和DNA的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。然后可以通過(guò) 類似地篩選另一微生物的基因組DNA或cDNA文庫(kù)或混合的DNA樣品來(lái)獲得編碼該多肽的多 核苷酸。一旦用一種或多種探針檢測(cè)到編碼多肽的多核苷酸，就可以通過(guò)使用本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員已知的技術(shù)分離或克隆該多核苷酸（參見(jiàn)例如，薩姆布魯克（Sambrook)等人， 1989,同上）。
[0043] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該親本酶是一種選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成:水解 酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶;優(yōu)選地，該親本酶是半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酶、木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化 氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、 內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變位酶(mutanase)、 氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、普魯蘭酶、核糖核酸 酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶;更優(yōu)選地，該親本酶是普魯蘭酶GH13_14;并且最優(yōu)選地，該 親本酶是來(lái)自芽孢桿菌屬的普魯蘭酶。
[0044] 序列一致性:兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性通過(guò)參數(shù)"序 列一致性"來(lái)描述。
[0045] 出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件套件， 賴斯(Rice)等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(shì)(Trends Genet ·) 16:276-277)(優(yōu)選5 · 0 · 0版或更新版 本)的尼德?tīng)?Needle)程序中所實(shí)施的尼德?tīng)柭?翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德?tīng)柭?(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970,分子生物學(xué)雜志(J.Mol .Biol. )48:443-453)來(lái)確定兩 個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開(kāi)放罰分10,空位延伸罰分0.5,以 及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版）取代矩陣。尼德?tīng)枠?biāo)注的"最長(zhǎng)的一致性"的輸出（使 用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得)被用作百分比一致性，并且計(jì)算如下：
[0046](一致的殘基X 100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)）
[0047]出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件套件， 賴斯等人，2000,同上）（優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德?tīng)柍绦蛑兴鶎?shí)施的尼德?tīng)柭?翁施 算法(尼德?tīng)柭臀淌?970,同上)來(lái)確定兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性。所 使用的參數(shù)是空位開(kāi)放罰分1 〇，空位延伸罰分〇 . 5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS 版)取代矩陣。尼德?tīng)枠?biāo)注的"最長(zhǎng)的一致性"的輸出（使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得)被用作百分比 一致性，并且計(jì)算如下：
[0048](一致的脫氧核糖核苷酸X 100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)）
[0049] 優(yōu)選地，該親本酶是由與SEQIDN0:1、SEQIDN0:3或SEQIDN0:15的多核苷酸 序列具有至少60%序列一致性的多核苷酸編碼的普魯蘭酶和/或該親本酶是與SEQ ID N0: 2、SEQIDN0:4或SEQIDN0:16的多肽序列具有至少60%序列一致性的普魯蘭酶。優(yōu)選地， 該親本酶是由以下多核苷酸編碼的普魯蘭酶，該多核苷酸與SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3或 SEQ ID NO: 15的多核苷酸序列具有至少65%序列一致性；或更優(yōu)選地至少70%序列一致 性，75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列一致性。優(yōu)選地，該親本酶是與SEQ IDN0 :2、SEQIDN0:4或SEQIDN0:16的多肽序列具有至少60%序列一致性 ；或更優(yōu)選地 至少70%序列一致性，75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列一致性的普魯蘭 酶。
[0050]宿主細(xì)胞:術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"意指易于用包括本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變 而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0051 ] 本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，這些重組宿主細(xì)胞包括本發(fā)明的多核苷酸，該多核 苷酸可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制序列，該一個(gè)或多個(gè)控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的產(chǎn) 生。將包括多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入宿主細(xì)胞中，這樣使得該構(gòu)建體或載體被維持作 為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如早前所描述。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"涵蓋由 于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大 程度上取決于編碼該多肽的基因及其來(lái)源。
[0052]宿主細(xì)胞可以是有用于重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的任何細(xì)胞，例如原核細(xì)胞。
[0053]原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但 不限于芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌 屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬以及鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于彎曲桿菌屬、大腸 桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門(mén)氏菌屬、以 及脲原體屬。
[0054] 細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞，包括但不限于嗜酸性普魯蘭芽孢桿 菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽 孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小 芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及蘇云金桿菌細(xì)胞。
[0055] 細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞，包括但不限于似馬鏈球菌、釀膿鏈球 菌、乳房鏈球菌以及馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。
[0056] 細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞，包括但不局限于不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲(chóng) 鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌、以及淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。
[0057]將DNA引入芽孢桿菌屬細(xì)胞中可通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見(jiàn)例如，張 (Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遺傳學(xué)與基因組學(xué)(Mol ·Gen ·Genet ·) 168:111-115)、感 受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（參見(jiàn)例如，楊格（Young)和斯皮宰曾（Spizizen)，1961，細(xì)菌學(xué)雜志 (J.Bacteriol ·)81:823-829 ;或杜拜努（Dubnau)以及大衛(wèi)杜夫-阿貝爾森（Davidoff-Abelson)，1971，分子生物學(xué)雜志（J.Mol. Biol. )56: 209-221)、電穿孔（參見(jiàn)例如，茂川 (Shi gekawa)和道爾（Dower )，1988，生物技術(shù)(Bio techniques )6:742-751 )、或者接合（參見(jiàn) 例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987,細(xì)菌學(xué)雜志169:5271-5278)。將DNA引入大腸 桿菌細(xì)胞中可通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn):原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如，哈納汗(Hanahan)，1983,分子生 物學(xué)雜志（J.Mol .Biol .)166:557-580)或電穿孔（參見(jiàn)例如，道爾（Dower)等人，1988,核酸 研究(Nucleic Acids Res. )16:6127-6145)。將DNA引入鏈霉菌屬細(xì)胞中可通過(guò)以下來(lái)實(shí) 現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔（參見(jiàn)例如，貢（Gong)等人，2004,葉線形微生物學(xué)（Folia Microbiol.) (Praha(布拉格））49: 399-405)、接合（參見(jiàn)例如，馬佐迪耶(Mazodier)等人， 1989,細(xì)菌學(xué)雜志（J.Bacteriol .)171:3583-3585)、或轉(zhuǎn)導(dǎo)（參見(jiàn)例如，伯克（Burke)等人， 2001，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl .Acad. Sci.USA)98:6289-6294)。將DNA引入假單孢 菌屬細(xì)胞中可通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn):電穿孔(參見(jiàn)例如，蔡(Choi)等人，2006,微生物學(xué)方法雜志 (J.Microbiol.Methods)64:391_397)或接合（參見(jiàn)例如，皮內(nèi)多（Pinedo)和斯梅茨 (Smets)，2005,應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl. Environ .Microbiol .)71:51-57)。將DNA引入鏈 球菌屬細(xì)胞中可通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)：天然感受態(tài)（參見(jiàn)例如，佩里（Perry)和藏滿 (Kuramitsu)，1981，感染與免疫（Infect · Immun. )32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例 如，凱特(Catt)和喬力克(Jollick)，1991，微生物學(xué)(Microbios)68:189-207)、電穿孔(參 見(jiàn)例如，巴克利(Buckley)等人，1999，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl .Environ.Microbiol ·) 65:3800-3804)、或者接合（參見(jiàn)例如，克萊威爾（Cl ewell)，1981，微生物學(xué)評(píng)論 (Microbiol. Rev. )45:409-436)。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的用于將DNA引入宿主細(xì)胞中 的任何方法。
[0058]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該宿主細(xì)胞是原核宿主細(xì)胞，優(yōu)選革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌;更優(yōu)選 地是選自下組的屬的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，該組由以下各項(xiàng)組成:芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌 屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬以及鏈霉 菌屬;并且最優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞屬于選自下組的物種，該組由以下各項(xiàng)組成：嗜酸性普魯 蘭芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿 菌、凝結(jié)芽孢桿菌、脫支芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢 桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、以及蘇云金桿菌。
[0059] 表達(dá)載體
[0060] 本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)的重組 表達(dá)載體、構(gòu)建體或基因文庫(kù)。不同的核苷酸和控制序列可以連接在一起以產(chǎn)生一個(gè)重組 表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制酶切位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)處 插入或取代編碼該多肽的多核苷酸?？商娲兀摱嗪塑账峥梢酝ㄟ^(guò)將該多核苷酸或包括 該多核苷酸的核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中來(lái)表達(dá)。在產(chǎn)生該表達(dá)載體時(shí)，該編 碼序列位于該載體中，這樣使得該編碼序列與該供表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。
[0061] 重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《荆?，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA程 序，并且能夠引起多核苷酸的表達(dá)。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載體 的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。
[0062] 該載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染 色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體或人工染色體。該載體可包含任何用以保證 自我復(fù)制的要素。可替代地，該載體可以是這樣一種載體，當(dāng)它被引入該宿主細(xì)胞中時(shí)，被 整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個(gè)或多個(gè)染色體一起復(fù)制。此外，可以使用單 一載體或質(zhì)粒或兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒(這些載體或質(zhì)粒共同含有待引入宿主細(xì)胞的基 因組中的總DNA)或轉(zhuǎn)座子。
[0063] 該載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞等細(xì) 胞的選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是這樣一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒 抗性、重金屬抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。
[0064]細(xì)菌性選擇性標(biāo)記的實(shí)例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因，或賦予抗生 素抗性(例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素或四環(huán)素抗性)的標(biāo)記。
[0065] 載體優(yōu)選含有允許載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因 組自主復(fù)制的一個(gè)或多個(gè)元件。
[0066] 對(duì)于整合到該宿主細(xì)胞基因組中，該載體可以依靠編碼該多肽的多核苷酸序列或 者用于通過(guò)同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件。可替代地，該 載體可以包含用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中的一個(gè)或多個(gè)染色體中 的一個(gè)或多個(gè)精確位置處的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置整合的可能性，這些整 合元件應(yīng)包含足夠數(shù)量的核酸，例如100至10，〇〇〇個(gè)堿基對(duì)、400至10,000個(gè)堿基對(duì)、以及 800至10，000個(gè)堿基對(duì)，這些堿基對(duì)與對(duì)應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重 組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的靶序列同源的任何序列。此外， 這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，該載體可以通過(guò)非同源 重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
[0067]對(duì)于自主復(fù)制，該載體可以進(jìn)一步包括使該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中自主 復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù) 語(yǔ)"復(fù)制起點(diǎn)（origin of replication)"或"質(zhì)粒復(fù)制子(plasmid replicator)"意指使得 質(zhì)粒或載體可在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。
[0068]細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、 以及PACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，以及允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060、 以及ρΑΜβ 1的復(fù)制起點(diǎn)。
[0069] 可以將本發(fā)明的多核苷酸的多于一個(gè)的拷貝插入到宿主細(xì)胞中以增加多肽的產(chǎn) 生。通過(guò)將序列的至少一個(gè)另外的拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中或者通過(guò)包括與該多核苷 酸一起的可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因可以獲得多核苷酸的增加的拷貝數(shù)目，其中通過(guò)在適當(dāng) 的選擇性試劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞可以選擇包含選擇性標(biāo)記基因的經(jīng)擴(kuò)增的拷貝的細(xì)胞，以 及由此該多核苷酸的另外的拷貝。
[0070] 用于連接以上所描述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的程序是本領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)例如，薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989,同上）。
[0071] 核酸構(gòu)建體
[0072] 本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，這些核酸構(gòu)建體包括可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制 序列的本發(fā)明的多核苷酸，在與控制序列相容的條件下，這些控制序列指導(dǎo)編碼序列在合 適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
[0073] 該多核苷酸可以按多種方式操縱，以提供該多肽的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在多核 苷酸插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操縱可以是令人希望的或必需的。用于利用重組DNA方法修飾 多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
[0074] 該控制序列可以是啟動(dòng)子，即，被宿主細(xì)胞識(shí)別以對(duì)編碼本發(fā)明的多肽的多核苷 酸進(jìn)行表達(dá)的多核苷酸。該啟動(dòng)子包含轉(zhuǎn)錄控制序列，這些序列介導(dǎo)該多肽的表達(dá)。該啟動(dòng) 子可以是在宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變型、截短型及雜合型啟 動(dòng)子，并且可以由編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。
[0075] 用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是 從以下基因中獲得的啟動(dòng)子:解淀粉芽孢桿菌淀粉酶基因 （amyQ)、地衣芽孢桿菌α-淀粉 酶基因 （amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因 （penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基 因 （amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因 （sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、蘇云金 桿菌cry 11IA基因 （阿蓋塞（Agaisse )和勒爾克呂（Lereclus)，1994,分子微生物學(xué) (Molecular Microbiology) 13 :97-107)、大腸桿菌lac操縱子、大腸桿菌trc啟動(dòng)子(埃貢 (Egon)等人，1988,基因 （Gene)69:301-315)、天藍(lán)鏈霉菌瓊脂水解酶基因 （dagA)、以及原核 內(nèi)酰胺酶基因（維拉-卡馬洛夫（Villa-Kamaroff)等人，1978,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊 (Proc.Natl .Acad. Sci.USA)75:3727-3731)以及tac啟動(dòng)子(德波爾（DeBoer)等人，1983,美 國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊80: 21-25)。其他啟動(dòng)子描述在吉爾伯特(Gilbert)等人，1980,科學(xué)美國(guó) 人（Scientific American)242:74-94的"來(lái)自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)（Useful proteins from recombinant bacteria)" ；以及在薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989，同上。串聯(lián)啟動(dòng) 子的實(shí)例披露在W0 99/43835中。
[0076]控制序列還可以是由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止子。該終止子可操作地 連接到編碼該多肽的多核苷酸的3'_末端。在該宿主細(xì)胞中起作用的任何終止子都可以用 于本發(fā)明中。
[0077]用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprH)、地衣芽 孢桿菌α-淀粉酶(amyL)以及大腸桿菌核糖體RNA( rrnB)的基因獲得。
[0078] 控制序列還可以是啟動(dòng)子下游和基因的編碼序列上游的mRNA穩(wěn)定子區(qū)，它增加該 基因的表達(dá)。
[0079] 適合的mRNA穩(wěn)定子區(qū)的實(shí)例是從以下獲得的：蘇云金桿菌crylllA基因 （W0 94/ 25612)和枯草芽孢桿菌SP82基因 （化（Hue)等人，1995,細(xì)菌學(xué)雜志（Journal of Bacteriology)177:3465-3471)〇
[0080] 控制序列也可以是編碼與多肽的N-末端連接并指導(dǎo)多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌通路的 信號(hào)肽的信號(hào)肽編碼區(qū)。多核苷酸的編碼序列的5'_端可以固有地包含在翻譯閱讀框中與 編碼多肽的編碼序列的區(qū)段天然地連接的信號(hào)肽編碼序列?？商娲?，編碼序列的5'_端可 以包含對(duì)于該編碼序列而言是外源的信號(hào)肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信號(hào)肽編 碼序列的情況下，可能需要外源信號(hào)肽編碼序列。可替代地，外源信號(hào)肽編碼序列可簡(jiǎn)單地 替換天然的信號(hào)肽編碼序列以便增強(qiáng)該多肽的分泌。然而，可以使用指導(dǎo)所表達(dá)多肽進(jìn)入 宿主細(xì)胞的分泌通路的任何信號(hào)肽編碼序列。
[0081] 用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是從以下各項(xiàng)的基因獲得的信號(hào)肽編 碼序列:芽孢桿菌屬NCIB 11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢 桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、 nprM)以及枯草芽孢桿菌prsA。西蒙納（Simonen)和帕爾瓦（Palva)，1993，微生物學(xué)評(píng)論 (Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信號(hào)肽。
[0082] 該控制序列還可以是編碼位于多肽的N-末端處的前肽的前肽編碼序列。生成的多 肽被稱為前體酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情況下被稱為酶原（zymogen))。多肽原通 常是無(wú)活性的并且可以通過(guò)催化切割或自身催化切割來(lái)自多肽原的前肽而轉(zhuǎn)化為活性多 肽。前肽編碼序列可以從以下各項(xiàng)的基因獲得:枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢 桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(W0 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以 及釀酒酵母α_因子。
[0083] 在信號(hào)肽序列和前肽序列二者都存在的情況下，該前肽序列定位成緊鄰多肽的Ν-末端并且該信號(hào)肽序列定位成緊鄰該前肽序列的Ν-末端。
[0084] 還可能希望地是添加調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序列相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)多肽 的表達(dá)。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例是使得基因的表達(dá)響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)節(jié)化合物的存 在)而開(kāi)啟或關(guān)閉的那些。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)序列包括lac、tac以及trp操縱子系統(tǒng)。調(diào)節(jié)序 列的其他實(shí)例是允許基因擴(kuò)增的那些。
[0085]可以按迭代方式使用本發(fā)明的方法，其中在一個(gè)循環(huán)中步驟(d)的變體酶被用作 后續(xù)循環(huán)中的起點(diǎn)或親本酶。優(yōu)選地，步驟(a)至(d)被重復(fù)至少一次，其中每個(gè)循環(huán)或重復(fù) 的步驟(d)中的變體酶充當(dāng)后續(xù)循環(huán)中的親本酶。
[0086]提高的產(chǎn)率
[0087]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"提高的產(chǎn)率"或"提高的生產(chǎn)力"意指生產(chǎn)的產(chǎn)物最終 量/添加的底物量被提高或者通過(guò)較短培養(yǎng)期獲得相同的產(chǎn)物量。
[0088]優(yōu)選地，該變體酶的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)力被提高至少10% ;優(yōu)選地至少20% ;更優(yōu)選 地至少30% ;仍更優(yōu)選地至少40%并且最優(yōu)選地至少50%，以上優(yōu)選地在每個(gè)循環(huán)中。 [0089]還優(yōu)選的是該變體酶在5-9的pH范圍內(nèi)的pH-穩(wěn)定性被提高至少10% ;優(yōu)選地至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或100%;并且最優(yōu)選地至少120%，以上優(yōu) 選地在每個(gè)循環(huán)中。
[0090]另外，優(yōu)選的是該變體酶的pH-穩(wěn)定性如在此的實(shí)例3中進(jìn)行確定并且被提高至少 10%;優(yōu)選地至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或100%;并且最優(yōu)選地至 少120%，以上優(yōu)選地在每個(gè)循環(huán)中。
[0091]此外，優(yōu)選的是該變體酶在pH 7和/或8下具有比親本酶提高的pH穩(wěn)定性，如在此 的實(shí)例4中所確定的;優(yōu)選地提高至少10 % ;優(yōu)選地至少20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、 80%、90%、或100% ;并且最優(yōu)選地至少120%。
[0092] 優(yōu)選地，該變體酶在6-8的pH范圍內(nèi)；更優(yōu)選地在6-7的pH范圍內(nèi)或在6.5-7.5的pH 范圍內(nèi)具有提高的pH-穩(wěn)定性。
[0093]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，如在此的實(shí)例3或4中所確定的，與其親本酶相比，該變體酶 在pH 5下、在pH 6下、在pH 7下、在pH 8下或在pH 9下具有提高的pH穩(wěn)定性;最優(yōu)選地，該變 體酶在pH 7下具有提高的pH穩(wěn)定性。
[0094]最后，優(yōu)選的是該變體酶在5-9的pH范圍內(nèi)；優(yōu)選地在6-9的pH范圍內(nèi)；更優(yōu)選地 6.5-9的pH范圍；更優(yōu)選地7-9的pH范圍；并且最優(yōu)選地7-8的pH范圍內(nèi)具有提高的pH-穩(wěn)定 性。
[0095] 實(shí)例
[0096]實(shí)例1:普魯蘭酶測(cè)定 [0097 ] 紅色普魯蘭測(cè)定(麥格酶公司(Megazyme))
[0098] 底物溶液
[0099] O.lg紅色普魯蘭(麥格酶公司）
[0100] 15ml 50mM乙酸鈉 ，pH 5
[0101] 通過(guò)將1〇μ1的酶樣品與80μ1的底物溶液混合在一起來(lái)制備反應(yīng)混合物并且在55 °C下孵育20min。將50μ1的乙醇添加至該反應(yīng)混合物中并且在3500rpm下離心10min。小心地 取出上清液并且讀取在A510處的吸光度。
[0102] 在麥格酶(Megazyme)普魯蘭酶測(cè)定中，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)將商業(yè)普魯蘭酶 Promozyrne' D2 (諾維信公司）用作標(biāo)準(zhǔn)，以確定普魯蘭酶活性單位。
[0103] 實(shí)例2:嵌合體普魯蘭酶變體的構(gòu)建
[0104] 將來(lái)自嗜酸性普魯蘭芽孢桿菌NCIB11777(編碼SEQ ID N0:2的SEQ ID N0:1)和脫 支芽孢桿菌（編碼SEQ ID N0:4的SEQ ID N0:3)的在三聯(lián)啟動(dòng)子系統(tǒng)（如在WO 99/43835中 所述)的控制下編碼普魯蘭酶的基因組DNA使用NucleoSpin?組織試劑盒(NudeoSpin?: Tissue kit)[馬歇雷-納高公司(MACHEREY-NAGEL)]根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行分離，所述三 聯(lián)啟動(dòng)子系統(tǒng)由來(lái)自地衣芽孢桿菌淀粉酶基因（amyL)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因 (amyQ)的啟動(dòng)子和蘇云金桿菌crylllA啟動(dòng)子(包括穩(wěn)定序列）組成。將編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn) 移酶(CAT)的基因與普魯蘭酶基因盒(描述于例如戴德瑞奇森(Diderichsen)，B.;波爾森 (Poulsen)，G.B·;約根森(Joergensen)，S.T.; "枯草芽孢桿菌的一種有用的克隆載體"（A useful cloning vector for Bacillus subtilis)質(zhì)粒（Plasmid)30:312(1993))相關(guān)聯(lián)， 并且用作選擇標(biāo)記(戴德瑞奇森等人，1983,質(zhì)粒30:312-315)。
[0105] 這些基因組包含如分別示于SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:3中的普魯蘭酶基因。將這 些基因組DNA用作PCR擴(kuò)增的模板，使用下面的正向引物和反向引物(變體1R-8R)在以下條 件下進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增。
[0106] PCR1 條件
[0107] 1·0μ1 模板
[0108] 4.8μ1 Η20
[0109] 4μ1 Phusion HF緩沖液
[0110] 1.6μ1 dNTP(2.5mM)
[0111] 〇·2μ1正向引物和反向引物(20μΜ)
[0112] 0.4 μL Phusion?高保真DNA聚合酶（賽默科技公司（ThermoScientific))
[0113] 98〇C/30sec
[0114] 30x(98°C/10sec，60°C/20sec，72°C/3min)
[0115] 72〇C/5min
[0126] 將PCR片段在0.7%瓊脂糖凝膠中分離并且通過(guò)凱杰凝膠提取試劑盒(Qiagen Gel extraction kit)回收，并且然后使用第一PCR片段作為正向引物和反向引物，使用芽孢桿 菌屬NCIB11777的基因組(針對(duì)變體1-4)和脫支芽孢桿菌NN18718的基因組(針對(duì)變體5-8) 作為模板進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。
[0127] PCR2 條件
[0128] 0.6μ1 模板
[0129] 0·3μ1 反向引物(20μΜ)
[0130] 3μ1 Phusion HF緩沖液
[0131] 1.56μ1 dNTP(2.5mM)
[0132] 0.36μ 1 Phusion?高保真DNA聚合酶(賽默科技公司）
[0133] 5.18μ1 Η20
[0134] 4·0μ1大引物（來(lái)自PCR1的150ng片段）
[0135] 98〇C/5min
[0136] 10x(98〇C/30sec,68〇C/15sec,72°C/6min)
[0137] 25x(98〇C/30sec,60〇C/5sec,72°C/6min)
[0138] 72〇C/10min
[0139] 將生成的具有普魯蘭酶基因與芽孢桿菌屬基因組側(cè)翼區(qū)的PCR片段和CAT基因整 合到枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞基因組中。
[0140] 實(shí)例3:通過(guò)MTP培養(yǎng)篩選提高的pH穩(wěn)定性
[0141] 將芽孢桿菌屬文庫(kù)或變體培養(yǎng)于包含兩種培養(yǎng)基的MTP中，所述培養(yǎng)基為培養(yǎng)基1 和培養(yǎng)基2,在2或3天培養(yǎng)之后其最終pH分別是8和6-7左右。
[0142] 培養(yǎng)基1; pH約8
[0144] 培養(yǎng)基 2; pH 約 6-7
[0145] Bacto? 胰蛋白胨 13.3g/L
[0146] Bacto? 酵母提取物 26.6g/L
[0147] 甘油 4.4g/L
[0148] 通過(guò)實(shí)例1中所描述的紅色普魯蘭測(cè)定測(cè)量普魯蘭酶活性并且確定培養(yǎng)基1與培 養(yǎng)基2之間的生產(chǎn)力比率;這些比率不受比活性變化的影響。選擇比親本普魯蘭酶具有更高 培養(yǎng)基1/培養(yǎng)基2比率的變體作為pH穩(wěn)定性提高的候選物。關(guān)于結(jié)果參見(jiàn)表1。選擇變體8用 于進(jìn)一步研究，編碼DNA序列提供于SEQ ID N0:15中并且編碼的氨基酸序列提供于SEQ ID N0:16 中。
[0149] 表1.提高的pH穩(wěn)定性，表示為培養(yǎng)基1與培養(yǎng)基2中的變體的普魯蘭酶生產(chǎn)力比 率。
[0151] 實(shí)例4:篩選pH穩(wěn)定性
[0152] 將在測(cè)定緩沖液（50mM琥珀酸、50mM HEPES、50mM CHES、50mM CABS、lmM CaC12、 75mM KCl、0.01%Triton X-100、全蛋白酶抑制劑混合物（羅氏應(yīng)用科學(xué)公司（Roche Applied Science))，用HC1或NaOH調(diào)節(jié)至pH值6.0、7.0和8.0)中在55°(：下孵育30分鐘之后 的殘余活性使用實(shí)例1中所描述的紅色普魯蘭測(cè)定來(lái)測(cè)量。確認(rèn)這些變體在pH 7和/或8下 具有比未本提尚的pH穩(wěn)定性，如在表2中所不。
[0153] 表2.在55°C下，在pH 6、7和8下30分鐘之后的pH穩(wěn)定性。
[0155] 實(shí)例5:枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主的構(gòu)建
[0156] 枯草芽孢桿菌MDT191是極低蛋白酶宿主菌株。其通過(guò)在以下基因中引入缺失而來(lái) 源于枯草芽抱桿菌A164(ATCC 6051A): sigF(spoIIAC)、nprE、aprE、amyE、srfAC、wprA、bpr、 vpr、mpr、epr、以及ispA〇
[0157]根據(jù)阿納格諾斯托普洛斯(Anagnostopoulos)和斯皮宰曾（5口12126]1)的程序(細(xì) 菌學(xué)雜志(1.8&(^64〇1.)1961.81:741-746)，用約叫8變體8基因組0嫩轉(zhuǎn)化]\?1'191。
[0158] 如下檢查氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體的普魯蘭酶活性。將轉(zhuǎn)化體鋪板于Difco胰蛋白胨血 瓊脂基質(zhì)(BD診斷公司（BD Diagnostics)，富蘭克林湖，新澤西州，美國(guó)）+5μg/ml氯霉素上， 并且將JPUL-008和MDT191鋪板于LB板上。將這些板在37°C下孵育過(guò)夜。然后用1%瓊脂+ 0.5%雷馬素(1^11^2〇1)艷藍(lán)染色的普魯蘭和10〇1111乙酸鈉覆蓋這些板。將這些板在50°(：下 孵育幾小時(shí)。變體8陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)化體兩者均在雷馬素艷藍(lán)染色的普魯蘭中產(chǎn)生指示普魯 蘭酶活性的透明區(qū)，然而宿主MDT191陰性對(duì)照沒(méi)有。選擇一個(gè)轉(zhuǎn)化體，命名為枯草芽孢桿菌 HyGe380〇
[0159] 實(shí)例6:罐發(fā)酵中的表達(dá)評(píng)估
[0160] 將表達(dá)親本普魯蘭酶以及變體8(HyGe380)的枯草芽孢桿菌菌株在1L罐中進(jìn)行發(fā) 酵。將每種芽孢桿菌屬菌株在包含葡萄糖、硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二鈉、硫酸鎂和金屬的 培養(yǎng)基中在37°C、pH 6.5下于1L實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐中伴隨著充分的攪拌和通氣培養(yǎng)3天。
[0161] 在發(fā)酵期間周期性地取培養(yǎng)物等分試樣。將這些樣品離心，并且上清液被用來(lái)通 過(guò)實(shí)例1中所描述的紅色普魯蘭測(cè)定測(cè)量普魯蘭酶生產(chǎn)力。
[0162] 其生產(chǎn)力列于下表中。還將上清液在SDS-PAGE(ATT0 e-PAGEL12.5%)中跑膠，并 且證實(shí)它們具有對(duì)應(yīng)于所測(cè)量的活性單位的條帶信號(hào)強(qiáng)度。
[0163] 表3.親本和嵌合變體8普魯蘭酶的普魯蘭酶生產(chǎn)力。
[0165] 實(shí)例7:普魯蘭酶文庫(kù)的構(gòu)建
[0166] 使用以下所示的與載體側(cè)翼和N-末端普魯蘭酶序列具有至少15mer同源的正向引 物，以及在一個(gè)或兩個(gè)位點(diǎn)具有飽和誘變的回復(fù)突變引物，用變體8的基因組DNA作為模板 進(jìn)行PCR。使用與配對(duì)的回復(fù)突變引物的區(qū)域具有至少15mer同源的正向引物以及以下所示 的與載體側(cè)翼具有至少15mer同源的反向引物進(jìn)行另一輪PCR。引物的設(shè)計(jì)遵循In-Fusion 克隆程序(CLONETECH公司）。
[0169] PCR 條件
[0170] Ι.ΟμΙ 模板
[0171] 4.8μ1 Η20
[0172] 4μ1 Phusion HF緩沖液
[0173] 1.6μ1 dNTP(2.5mM)
[0174] 0·2μ1正向引物和反向引物(20μΜ)
[0175] 0.4 μΙ Phusion?高保真DNA聚合酶(賽默科技公司）
[0176] 98〇C/30sec
[0177] 30x(98〇C/10sec,60〇C/20sec,72°C/3min)
[0178] 72〇C/5min
[0179] 將兩個(gè)PCR片段進(jìn)行凝膠純化并且在包括如描述于W0 99/43835中的遺傳元件的 表達(dá)載體中通過(guò)In-Fusion克隆(CL0NTECH公司），遵循其用戶手冊(cè)進(jìn)行克隆。通過(guò)這樣做， 將來(lái)自克勞氏芽孢桿菌的堿性蛋白酶(aprH)的信號(hào)肽如描述于W0 99/43835中與文庫(kù)基因 在框內(nèi)與編碼普魯蘭酶的DNA融合。
[0180] 將生成的In-Fusion連接溶液轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5a中并且從大腸桿菌文庫(kù)轉(zhuǎn)化體 中回收文庫(kù)質(zhì)粒。然后通過(guò)同源重組將質(zhì)粒文庫(kù)整合進(jìn)枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞基因組中。 在三聯(lián)啟動(dòng)子系統(tǒng)的控制下表達(dá)該基因（如描述于W0 99/43835中）。將編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn) 移酶的基因用作標(biāo)記物，如描述于狄代麗柯森(Diderichsen)等人，1993，質(zhì)粒(Plasmid) 30:312-315 中。
[0181] 將文庫(kù)克隆在包含補(bǔ)充有6mg//L氯霉素的培養(yǎng)基2的96孔MTP中在30°C_37°C下培 養(yǎng)1-3天。離心該板并且將培養(yǎng)物上清液用于普魯蘭酶測(cè)定。
[0182] 實(shí)例8:篩選提高的pH穩(wěn)定性
[0183]如實(shí)例4中所描述，測(cè)量培養(yǎng)物上清液的穩(wěn)定性，并且選擇在pH7下比親本普魯蘭 酶具有更高殘余活性的克隆。
[0184]表4.親本和合成變體75普魯蘭酶的普魯蘭酶生產(chǎn)力。
[0187] 使用NucleoSpin?組織試劑盒[馬歇雷-納高公司]，根據(jù)其程序分離所選擇變體 的基因組DNA，并且將普魯蘭酶編碼序列使用實(shí)例7中所描述的正向引物和反相引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增并且然后進(jìn)行測(cè)序以確定其序列。
[0188] 實(shí)例9:MTP中的表達(dá)評(píng)估
[0189] 將所篩選的枯草芽孢桿菌克隆，即實(shí)例8中所描述的變體75,在至少4個(gè)包含具有 6mg/L氯霉素的培養(yǎng)基1或培養(yǎng)基2的孔中在220rpm、37°C下發(fā)酵3天。離心培養(yǎng)物，并且將上 清液小心地取出用于普魯蘭酶測(cè)定，并且將平均表達(dá)水平與親本普魯蘭酶進(jìn)行比較，以確 認(rèn)在pH 7下具有較高穩(wěn)定性的變體在使用的任一培養(yǎng)基中顯示出較高表達(dá)水平。
[0190] 表5.變體75與其親本在不同培養(yǎng)基中的表達(dá)水平。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高酶的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)力的方法，所述方法包括以下步驟： a) 提供宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包括編碼感興趣的親本酶的一種或多種變體的突變多核 苷酸的表達(dá)基因文庫(kù)，其中與該親本酶相比，該一種或多種變體包括至少一個(gè)氨基酸改變； b) 在有益于產(chǎn)生該一種或多種變體酶的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞； c) 選擇產(chǎn)生變體酶的宿主細(xì)胞，該變體酶至少具有該親本酶的酶比活性以及在5-9的 pH范圍內(nèi)的提高的pH-穩(wěn)定性，其中與該親本的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)力相比，該變體酶的產(chǎn)率和/ 或生產(chǎn)力得到提高;并且任選地 d) 回收該變體酶。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該親本酶是一種選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組 成:水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶;優(yōu)選地，該親本酶是半乳糖 苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β_半乳糖苷酶、β_葡糖苷酶、β_木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、 過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖 核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變位酶、氧化 酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、普魯蘭酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn) 谷氨酰胺酶、或木聚糖酶;更優(yōu)選地，該親本酶是普魯蘭酶GHl 3_14;并且最優(yōu)選地，該親本 酶是來(lái)自芽孢桿菌屬的普魯蘭酶。3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該親本酶是由與SEQ ID NO: 1、SEQ ID Ν0:3或SEQ ID NO: 15的多核苷酸序列具有至少60%序列一致性的多核苷酸編碼的普魯蘭酶。4. 如任何以上權(quán)利要求所述的方法，其中該親本酶是與SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或 SEQ ID NO: 16的多肽序列具有至少60%序列一致性的普魯蘭酶。5. 如任何以上權(quán)利要求所述的方法，其中該宿主細(xì)胞是原核宿主細(xì)胞，優(yōu)選革蘭氏陽(yáng) 性細(xì)菌;更優(yōu)選地是選自下組的屬的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，該組由以下各項(xiàng)組成:芽孢桿菌屬、 梭菌屬、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球 菌屬以及鏈霉菌屬；并且最優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞屬于選自下組的物種，該組由以下各項(xiàng)組 成:嗜酸性普魯蘭芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、 克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、脫支芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿 菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、以及 蘇云金桿菌。6. 如任何以上權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(a)至(d)被重復(fù)至少一次，并且其中每 個(gè)循環(huán)的步驟(d)中的變體酶充當(dāng)后續(xù)循環(huán)中的親本酶。7. 如任何以上權(quán)利要求所述的方法，其中該變體酶的產(chǎn)率或生產(chǎn)力被提高至少10%; 優(yōu)選地至少20% ;更優(yōu)選地至少30% ;仍更優(yōu)選地至少40%并且最優(yōu)選地至少50%。8. 如任何以上權(quán)利要求所述的方法，其中該變體酶在5-9的pH范圍內(nèi)的pH-穩(wěn)定性被提 高至少 10%;優(yōu)選地至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或 100%;并且最優(yōu) 選地至少120 %。9. 如任何以上權(quán)利要求所述的方法，其中如在此的實(shí)例3中所確定的，該變體酶的pH-穩(wěn)定性被提高至少10% ;優(yōu)選地至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或 100% ;并且最優(yōu)選地至少120%。10. 如任何以上權(quán)利要求所述的方法，其中該變體酶在PH 7和/或8下具有比該親本酶 提高的P H穩(wěn)定性，如在此的實(shí)例4中所確定的；優(yōu)選地提高至少I(mǎi)O % ;優(yōu)選地至少2 O %、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或 100% ;并且最優(yōu)選地至少 120%。11.如任何以上權(quán)利要求所述的方法，其中該變體酶在5-9的pH范圍內(nèi)；優(yōu)選地在6-9的 pH范圍內(nèi)；更優(yōu)選地6.5-9的pH范圍；更優(yōu)選地7-9的pH范圍；并且最優(yōu)選地7-8的pH范圍內(nèi) 具有提尚的pH-穩(wěn)定性。
【文檔編號(hào)】C12N9/44GK105899660SQ201580004217
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2015年1月8日
【發(fā)明人】松井知子
【申請(qǐng)人】諾維信公司