包含多支架的人造多纖維素酶體及其在生物質(zhì)降解中的用圖
【專利摘要】本申請?zhí)峁┌瑸橛行д隙鄠€碳水化合物?活性酶設計的支架亞基陣列的多酶復合物。
【專利說明】包含多支架的人造多纖維素酶體及其在生物質(zhì)降解中的用途 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明設及包含為有效整合多個碳水化合物-活性酶設計的支架亞基陣列的人造 多纖維素酶體復合物。運樣的復合物對于纖維素生物質(zhì)的水解是特別有利的。
[0002] 發(fā)明背景 植物細胞壁是地球上生物聚合物的最豐富的可再生資源。它是由各種多糖(主要是纖 維素和半纖維素)和木質(zhì)素組成。它降解為可溶性糖對于轉(zhuǎn)化為所需的化學品和生物燃料， 如乙醇具有重大意義。由于纖維素的高度有序的、不溶性的、結晶性質(zhì)，極少數(shù)的微生物具 有必需的酶系統(tǒng)W有效地降解纖維素底物為可溶性糖。
[0003] 纖維素的水解是由一組稱為纖維素酶的酶進行的。它們典型地分為幾類：1)外切 葡聚糖酶，其只能在線性纖維素鏈的末端順序地裂解(一次2-4個葡萄糖單位），且因此具有 隧道樣的活性位點；2)內(nèi)切葡聚糖酶，其裂解纖維素鏈的中間（暴露新的個別鏈末端），通 常具有溝或裂口，其可適合線性鏈的任何部分;和3)加工性內(nèi)切葡聚糖酶，被認為是一個 中間類，其像內(nèi)切葡聚糖酶，可在纖維素鏈中間裂解，但在初步裂解后，可類似外切葡聚糖 酶繼續(xù)依次降解纖維素鏈。另一個典型類是e-葡糖巧酶，其將纖維糊精的末端非-還原性e-D-葡萄糖殘基(特別是纖維二糖，其是纖維素降解的主要末端產(chǎn)物之一)水解為單糖。
[0004] 半纖維素被一類稱為半纖維素酶的酶降解，半纖維素酶可細分成兩個主要類型： 裂解主鏈骨架的那些(木聚糖酶，其隨機裂解木聚糖的e-l，4連鍵W產(chǎn)生木寡糖，其被0-1，4 木糖巧酶進一步水解為木糖）；和降解側鏈取代基或短端產(chǎn)物的那些(例如阿拉伯巧喃糖巧 酶和乙酷醋酶）。需要兩種類型的酶(纖維素酶和半纖維素酶）W達到完全的植物細胞壁降 解。
[0005] 植物細胞壁-降解微生物采用兩種主要策略：需氧真菌和細菌通常產(chǎn)生大量的游 離植物細胞壁-降解酶，然而幾種厭氧細菌通常分泌稱為多纖維素酶體的多酶復合物。多纖 維素酶體復合物的基本結構包括稱為支架蛋白的非-催化亞基，所述支架蛋白經(jīng)由纖維素-特異性碳水化合物-結合模塊(CBM)結合不溶性底物。支架蛋白亞基也作為復合物中各種酶 促亞基的整合劑起作用-它通常含有一組亞基-結合模塊，稱為黏結蛋白（COhesin)，其通 過與存在于各個酶促亞基中的稱為錯定蛋白（dockerin)的互補結合模塊相互作用，介導酶 促亞基特異性結合和組織到復合物中。
[0006] 多纖維素酶體首先在熱纖梭菌(Clostridium thermocelIum)中被發(fā)現(xiàn)，其提出了 基于主要支架蛋白分子的基本結構，主要支架蛋白分子經(jīng)由CBM附接于底物并經(jīng)由特異性 高-親和性黏結蛋白-錯定蛋白相互作用結合不同的酶。熱纖梭菌(C. thermocellum)的多 纖維素酶體經(jīng)由主要支架蛋白和錯定支架蛋白之間的黏結蛋白-錯定蛋白相互作用結合到 細胞表面。介導酶結合到復合物中的黏結蛋白-錯定蛋白配偶體不同于介導細胞錯定的那 些，W致在它們之間基本上沒有交叉特異性，從而確保細胞表面附著和多纖維素酶體裝配 的可靠機制。錯定支架蛋白經(jīng)由化H (S-層同源性）模塊，連接復合物至細胞（Bayer等， 2004, Annual Review of Microbiology, 58: 21-554)。
[0007] 在過去二十年間，更復雜的多纖維素酶體結構的存在被發(fā)現(xiàn)，例如在解纖維素醋 弧菌（Acetivibrio cellulolyticus) (Xu等，2003, J Bacteriol, 185(15): 4548-57; Xu等，2004， J Bacteriol, 186(17): 5782-9;Ding等，1999， J Bacteriol, 181(21): 6720-9)、黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens) (Saluzzi等，2001, FEMS Microbiol Ecol, 36(2-3): 131-137;Rincon等，2004， J Bacteriol，186(9): 2576-85)、溶纖維素擬桿菌（Bacteroides cellulosolvens) (Xu等，2004, J Bacteriol, 186: 968-977;Ding 等，2000，J Bacteriol, 182:4915-4925)中和最近在 Clostridium clariflavum (Izquierdo等，2012, Stand Genomic Sci, 6(1): 104-15)中的多纖維素 酶體。
[0008] 各種支架蛋白模塊組織成功能性多膚通過互連不同的長度和組成的接頭完成。自 然存在的接頭長度表現(xiàn)出極大的多樣性，范圍從幾個氨基酸至多達數(shù)百個氨基酸。在一些 支架蛋白中，相鄰的黏結蛋白可完全不被接頭分開，例如來自溶纖維素擬桿菌（B. cellulosolvens)的ScaB中的第一和第二或第S和第四黏結蛋白（Bayer等，2009,我們可 結晶多纖維素酶體嗎？（Can we crys化Ilize a cellulosome?)在:木質(zhì)纖維素降解和生 物質(zhì)利用的生物技術（In: Biotechnology of Ii即ocellulose degradation and biomass utilization).由Sakka K, Karita S, Kimura T, Sakka M, Matsui H, Miyake H, Tanaka A編輯：Ito Print Publishing Division;183-205)〇Molinie;r等， 2011，JMol Biol, 405:143-157描述含有支架蛋白的混合多纖維素酶體的協(xié)同效應、結 構和構象靈活性，所述支架蛋白由兩個黏結蛋白模塊組成，顯示各種黏結蛋白間接頭。
[0009] 設計者(Designer)多纖維素酶體是允許植物細胞壁降解酶的受控制結合的人造 納米器件，因此代表加工生物質(zhì)為生物燃料的潛在平臺。它是W來自相同物種的黏結蛋白 和錯定蛋白模塊之間極高的親和性和特異性相互作用為基礎的。設計者多纖維素酶體典型 地包括含有CBM和源自不同物種的具有趨異特異性的幾個黏結蛋白模塊的嵌合體支架蛋 白。所述復合物還包括植物細胞壁-降解酶，每個具有介導選擇性結合于趨異黏結蛋白之一 的互補性和特異性錯定蛋白模塊。
[0010] 使用設計者支架蛋白的先前報告導致各種頑固底物降解的活性增強(例如，Caspi 等，2008, Journal of Biotechnology, 135: 351-357;Caspi等，2009, Applied and Elnveronmental Microbiology,75: 7335-7342;Morai：s等，2010, mBio, I: e00285-10; Morals等，2011，mBio, 2: e00233-ll)。在大多數(shù)的運些報告中，設計者多纖維素酶體的 構象模仿熱纖梭菌的簡單的整體構造。更復雜的結構描述于例如Mingardon等，2007， Applied and Environmental Microbiology, 73: 7138-7149中。
[0011] 迄今報道的最大形式的同源人造多纖維素酶體之一描述于Morais等，2012， MBio, 3(6)中，其含有具有6個趨異黏結蛋白的嵌合體支架蛋白，整合了6個攜帶錯定蛋白 的纖維素分解酶(木聚糖酶和纖維素酶）。
[0012] Fan等，2012，PNAS U.S.A，109(33): 13260-13265,描述酵母的工程改造 W通 過在釀酒酵母(Saccharomyces cereviSiae)細胞表面上呈現(xiàn)由兩個獨立的微小-支架蛋白 組成的微小-多纖維素酶體，直接轉(zhuǎn)化纖維素(特別是微晶纖維素)為生物乙醇。
[0013] Tsai等，2013，ACS Synth. Biol., 2:14-21，描述在酵母表面通過自適應裝配 的復合多纖維素酶體的功能顯示。
[0014] 化en等的US 2011/0306105公開用于纖維素物質(zhì)的有效水解和更特別是用于生成 乙醇的設計者多纖維素酶體。
[0015] Fierobe等的WO 2012/055863公開共價多纖維素酶體及其用途。特別是公開了具 有增加的酶促活性的酶構建體(基于互連催化模塊的間隔基的使用），和編碼運些構建體的 多核酸。
[0016] 化zana等，2013, Biotechnol Biofuels. 6(1):182,由本發(fā)明的一些發(fā)明人，在 本申請的優(yōu)先權日后發(fā)表，研究了支架蛋白亞基的空間組織及其通過設計重組=價設計者 支架蛋白的組合文庫對纖維素水解的影響，所述=價設計者支架蛋白含有碳水化合物-結 合模塊(CBM)和3個趨異黏結蛋白模塊。
[0017] 對改進纖維素生物質(zhì)的降解的組合物和方法仍有需求。例如，具有允許整合大量 的協(xié)同和有效地工作的纖維素分解酶，W達到更有效地水解纖維素物質(zhì)的多酶復合物，將 是非常有益的。
[001引發(fā)明概述 本發(fā)明提供用于有效降解纖維素生物質(zhì)的人造多酶復合物。更特別地，本發(fā)明提供包 含支架亞基陣列的人造多酶復合物，其允許整合與先前描述的復合物比較的增加數(shù)目的 酶，同時維持復合物中各個酶的有效活性，并實現(xiàn)整體協(xié)同作用和鄰近效應。
[0019] 本發(fā)明還提供包含多酶復合物的組合物，和利用所述組合物水解纖維素物質(zhì)的方 法和系統(tǒng)。
[0020] 本發(fā)明的多酶復合物包含至少兩個支架亞基，其中每個亞基包含用于整合多個攜 帶匹配錯定蛋白模塊的碳水化合物活性酶的多個黏結蛋白模塊。每個亞基的黏結蛋白模塊 由至少5個氨基酸，優(yōu)選5-50個氨基酸的接頭隔開，運被發(fā)現(xiàn)導致復合物的活性增加，如在 本文下面所舉例說明的。支架亞基也經(jīng)由具有不同于連接各個支架及其酶的結合特異性的 結合特異性的黏結蛋白-錯定蛋白相互作用，彼此相互作用，從而生成結合大量的酶的精制 結構。
[0021] 有利地，復合物中各個酶的精確位置可通過使用包含不同特異性的黏結蛋白模塊 (其可與酶上的它們的匹配錯定蛋白模塊相互作用）的支架控制。
[0022] 具有趨異結合特異性的黏結蛋白-錯定蛋白對的數(shù)量有所限制。使用由如本文描 述的多支架亞基組成的結構可克服此種限制:相同特異性的黏結蛋白模塊可在不同的支架 上使用。各個支架在支架本身經(jīng)反應W形成完整復合物之前，可分別地與其酶相互作用。一 旦形成單獨的復合物，則它們就是穩(wěn)定的，因此，各個酶的特定位置得到維持。本文公開的 多酶復合物在黏結蛋白模塊的選擇和酶組成和裝配的控制中允許較高的靈活性。生成的復 合物在允許最佳活性和協(xié)同作用的構象中結合多個酶。
[0023 ]根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供人造纖維素分解的多酶復合物，其包含： 第一支架多膚，其包含多個被包含5-50個氨基酸的接頭隔開的黏結蛋白模塊，至少兩 個所述黏結蛋白模塊具有對錯定蛋白模塊的不同結合特異性;和錯定蛋白模塊； 第二支架多膚，其包含多個被包含5-50個氨基酸的接頭隔開的黏結蛋白模塊，至少兩 個所述黏結蛋白模塊具有對錯定蛋白模塊的不同結合特異性，其中至少一個黏結蛋白模塊 具有對第一支架多膚的錯定蛋白的結合特異性;和 多個碳水化合物活性酶，每個碳水化合物活性酶包含具有對第一支架、第二支架或兩 者的黏結蛋白的結合特異性的錯定蛋白模塊， 其中第一和第二支架經(jīng)由第一支架的錯定蛋白和具有對所述錯定蛋白的結合特異性 的第二支架的黏結蛋白結合，和 其中多個碳水化合物活性酶經(jīng)由具有相互結合特異性的錯定蛋白-黏結蛋白模塊，結 合于第一和第二支架多膚，和 其中第一支架、第二支架或兩者還包含碳水化合物結合模塊(CBM)。
[0024] 如本文所用的，術語"不同特異性"，當指黏結蛋白模塊的結合特異性時，可與"趨 異特異性"互換使用并表示各個黏結蛋白模塊識別不同的錯定蛋白模塊。在一些實施方案 中，不同結合特異性的黏結蛋白模塊源自不同的微生物物種。依據(jù)運些實施方案，源自一個 物種的黏結蛋白模塊識別(結合)源自相同物種的錯定蛋白模塊，但不識別源自不同的物種 的錯定蛋白模塊。
[0025] 類似地，當術語"不同特異性"和"趨異特異性"指錯定蛋白模塊的結合特異性時， 它們表示各個錯定蛋白模塊識別不同的黏結蛋白模塊。
[0026] 如本文所用的，術語"相互的"，當指錯定蛋白-黏結蛋白相互作用時，表示兩個模 塊是彼此互補的，即彼此具有結合特異性。
[0027] 在一些實施方案中，第一和第二支架多膚的每一個包含3-10個黏結蛋白模塊。在 一些實施方案中，第一和第二支架多膚的每一個包含3-6個黏結蛋白模塊。
[0028] 在一些實施方案中，第一支架多膚的所有黏結蛋白模塊具有不同結合特異性。在 另外的實施方案中，第二支架多膚的所有黏結蛋白模塊具有不同結合特異性。依據(jù)運些實 施方案，第一支架具有一組趨異黏結蛋白模塊，和第二支架具有另一組趨異性黏結蛋白模 塊。在一些實施方案中，在兩組中的所有黏結蛋白彼此不同。在其它實施方案中，每組包括 趨異黏結蛋白，但一個(或多個)黏結蛋白在兩組中可被發(fā)現(xiàn)。因此，在一些實施方案中，第 一支架的至少一個黏結蛋白模塊與第二支架的黏結蛋白模塊具有相同結合特異性。如上所 述的，酶的位置可通過分別形成各個支架-酶復合物，并且然后混合預形成的復合物W生成 完整復合物，依然維持在各個支架內(nèi)。
[0029] 在其它實施方案中，第一支架多膚或第二支架多膚包含二個或更多個具有相同結 合特異性的黏結蛋白模塊。在一些實施方案中，兩個支架多膚均包含二個或更多個具有相 同特異性的黏結蛋白模塊，即每個支架多膚包含二個或更多個具有相同結合特異性的黏結 蛋白模塊。運樣的實施方案對于例如在復合物內(nèi)多個位置的特定酶的整合可W是有用的。
[0030] 在一些實施方案中，黏結蛋白模塊源自一種或多種產(chǎn)生多纖維素酶體的微生物。 在一些實施方案中，產(chǎn)生多纖維素酶體的微生物選自熱纖梭菌（Clostridium thermocel Ium)、解纖維素醋弧菌（Acetivibrio CeIluloIytiCUS )、黃色瘤胃球菌 (Ruminococcus f Iavefaciens)、溶纖維素擬桿菌（Bacteroides CeIlulosolvens)、閃爍古 生球菌(Archaeoglobus fulgidus)和解纖維梭菌(Clostridium cellulol}fticum)。依據(jù)運 些實施方案，黏結蛋白模塊選自來自熱纖梭菌的黏結蛋白、來自解纖維素醋弧菌（A. celIulolyticus)的黏結蛋白、來自黃色瘤胃球菌(R. fIavefaciens)的黏結蛋白、來自溶 纖維素擬桿菌的黏結蛋白、來自閃爍古生球菌(A. fulgidus)的黏結蛋白、來自解纖維梭菌 (C. celIulol^ic皿)的黏結蛋白及其組合。
[0031] 在一些實施方案中，黏結蛋白模塊源自一種或多種無-多纖維素酶體的微生物。
[0032] 在一些實施方案中，錯定蛋白模塊源自一種或多種產(chǎn)生多纖維素酶體的微生物。 在一些實施方案中，產(chǎn)生多纖維素酶體的微生物選自熱纖梭菌、解纖維素醋弧菌、黃色瘤胃 球菌、溶纖維素擬桿菌、閃爍古生球菌和解纖維梭菌。依據(jù)運些實施方案，錯定蛋白模塊選 自來自熱纖梭菌的錯定蛋白、來自解纖維素醋弧菌的錯定蛋白、來自黃色瘤胃球菌、溶纖維 素擬桿菌的錯定蛋白，來自閃爍古生球菌的錯定蛋白、來自解纖維梭菌的錯定蛋白及其組 厶 1=1 O
[0033] 在一些實施方案中，錯定蛋白模塊源自一中或多中無-多纖維素酶體的微生物。
[0034] 在一些實施方案中，第一和第二支架多膚均包含CBM。
[0035] 在一些實施方案中，第一支架多膚、第二支架多膚或兩者的CBM是內(nèi)部的。在一些 實施方案中，第一支架多膚、第二支架多膚或兩者的CBM位于支架多膚的末端。
[0036] 在一些實施方案中，當兩個支架多膚包含CBM時，第一和第二支架多膚的CBM是相 同的。在其它實施方案中，第一和第二支架多膚的CBM是不同的。
[0037] 在一些實施方案中，接頭包含5-40個氨基酸。在一些實施方案中，接頭包含15-35 個氨基酸。
[0038] 在一些實施方案中，多個碳水化合物活性酶包含糖巧水解酶、多糖裂解酶、糖醋酶 或其組合。
[0039] 在一些實施方案中，糖巧水解酶選自纖維素酶、木聚糖酶、0-葡糖巧酶及其組合。
[0040] 在一些實施方案中，碳水化合物-活性酶源自非-多纖維素酶體的酶。
[0041] 在一些實施方案中，碳水化合物-活性酶源自多纖維素酶體的酶。
[0042] 在一些實施方案中，碳水化合物-活性酶是細菌酶。在一些實施方案中，細菌選自 Thermobifidafusca和熱纖梭菌。依據(jù)運些實施方案，多酶復合物包含多個來自T. fUsca、 熱纖梭菌或兩者的碳水化合物-活性酶。
[0043] 在一些實施方案中，多酶復合物還包含一個或多個支架多膚，其中多個碳水化合 物結合酶與其結合，所述多個碳水化合物結合酶結合于第一支架多膚、第二支架多膚或兩 者。
[0044] 依據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種降解纖維素物質(zhì)的組合物，其包含本發(fā)明的多酶 復合物。
[0045] 依據(jù)又一方面，本發(fā)明提供一種降解纖維素物質(zhì)的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含本發(fā)明的 多酶復合物。
[0046] 依據(jù)又一方面，本發(fā)明提供一種降解纖維素物質(zhì)的方法，該方法包括使所述纖維 素物質(zhì)暴露于本發(fā)明的多酶復合物。
[0047] 本發(fā)明的運些和其它方面和特征將從下文的附圖、詳細描述、實施例和權利要求 書而變得顯而易見。
[004引附圖簡述 圖1.為檢查模塊間接頭的長度對支架-酶復合物活性的影響而構建的支架庫的示意 圖。黏結蛋白模塊(Ac、Bc和Ct)和碳水化合物結合模塊(CBM)的二十四（24)種不同的排列在 3個子庫中示出：給定的嵌合體支架的無-接頭、短-接頭和長-接頭版本。左邊的欄目表示各 個支架組的編號及其組成(CBM和趨異黏結蛋白的位置）。十四（14)個全組，表示42個克隆和 表達的支架，被成功地克隆和表達，并用于進一步的研究。包括在最終庫中的42個成功克隆 和表達的支架蛋白顯示為灰度色標示意圖。
[0049] 圖2.微晶纖維素(Avicel) (A)和預處理的富含纖維素的麥桿(B)經(jīng)14組設計者 多纖維素酶體的比較水解。每一組模塊組成和支架蛋白編號在X-軸上指示。上面的小圖：設 計者支架蛋白的CBM模塊是在內(nèi)部位置。下面的小圖：設計者支架蛋白的CBM模塊是在N-或 C-末端位置。各個設計者-多纖維素酶體組用長模塊間接頭支架蛋白、短模塊間接頭支架蛋 白和無模塊間接頭支架蛋白的任何一種裝配。對照："游離"：對應于Cel48S-ct、Cel9K-ac 和Cel8A-bc的合并活性。"CBM-Coh":對應于前巧巾酶的活性，每個獨立地附接于融合于CBM 的其匹配黏結蛋白模塊。反應對微晶纖維素(Avicel)進行72 h和對預處理的富含纖維素的 麥桿進行3 h。酶促活性用mM還原糖定義，如通過葡萄糖標準曲線確定的。所有的反應按一 式=份進行并重復3次。至少3次實驗的標準誤差被顯示。
[0050] 圖3.對微晶纖維素(Avicel)比較a-9A、b-48A和5A-t的活性分析為：（i)結合于 銜接子支架CBM-黏結蛋白A-B-T-DockII ("Scad ABT"); (ii)結合于銜接子支架DockII-A-B-T，其還結合于匹配黏結蛋白-CBM微小-支架（"Ad ABT");(iii)游離酶（"游離"）的混 合物;和(iv)結合于匹配黏結蛋白-CBM微小-支架的酶的混合物("CBM-恢復的"）。
[0051] 圖4.含有六價主要支架、=價銜接子支架和8個酶促亞基的多酶復合物的示意 圖。
[0052] 圖5.于50°C用不同的嵌合體酶促合劑和多纖維素酶體的構型溫育48小時后的麥 桿降解。各個組分在各種反應溶液中的存在在表中指定。
[0053] 圖6.在0葡糖巧酶(來自T. fusca的BglC)的存在或不存在下，麥桿經(jīng)W下物質(zhì)降 解的動力學（5(TC):(i)提取的熱纖梭菌的天然多纖維素酶體；（ii)設計者多纖維素酶 體，其含有附接于具有總共8個嵌合體酶的六價支架的銜接子支架;和（iii)對應8種野生 型酶的混合物。
[0054] 發(fā)明詳述 本發(fā)明設及具有由兩個(并且可能更多個)相互作用的支架亞基組成的精制結構的設 計者多纖維素酶體。本發(fā)明的支架亞基被設計W使得它們允許有效整合酶促亞基至復合 物，并促進接近纖維素底物和有效降解纖維素底物的祀向效應。
[0055] 在一些實施方案中，本文提供人造纖維素分解的多酶復合物，其包含：（i)第一多 種碳水化合物活性酶，每個包含結合于第一支架多膚的錯定蛋白模塊，其中所述第一支架 多膚包含多個被包含5-50個氨基酸的接頭隔開并具有對酶的錯定蛋白模塊的結合特異性 的黏結蛋白模塊、碳水化合物結合模塊(CBM)和錯定蛋白模塊；（ii)第二多種碳水化合物 活性酶，每個包含結合于第二支架多膚的錯定蛋白模塊，其中所述第二支架多膚包含多個 被包含5-50個氨基酸的接頭隔開的黏結蛋白模塊，其中至少一個黏結蛋白模塊具有對第一 支架的錯定蛋白的結合特異性，而剩余的黏結蛋白模塊具有對第二多種酶的錯定蛋白模塊 的結合特異性，其中第一和第二支架經(jīng)由第一支架的錯定蛋白和具有對所述錯定蛋白的結 合特異性的第二支架的黏結蛋白結合。
[0056] 如本文所用的，術語"人造的"，當指本發(fā)明的酶促復合物時，表示復合物經(jīng)人造 地/合成地制得且不在自然界中出現(xiàn)。要理解天然存在的多纖維素酶體復合物從本發(fā)明的 范圍排除。
[0057] 如本文所用的，術語"酶"指具有對某個底物或某些底物的催化活性的多膚。
[0058] 如本文所用的，術語"模塊"描述在一種蛋白質(zhì)內(nèi)的單獨折疊部分。如本文所用的" 酶的催化模塊"或"酶促-活性模塊"指將催化活性賦予蛋白質(zhì)的模塊。所述術語指它們對模 塊酶的常規(guī)解釋，對此催化模塊可容易地在酶多膚序列內(nèi)鑒定。運樣的模塊酶在本發(fā)明的 范圍內(nèi)。
[0059] 如本文所用的術語"復合物"指優(yōu)選通過非-共價相互作用，或通過共價鍵連接的 組分的協(xié)調(diào)或關聯(lián)性。
[0060] 如本文所用的術語"多酶復合物"表示包含多種酶的復合物，即至少兩種酶且優(yōu)選 更多的酶。本發(fā)明的多酶復合物還包括非-催化組分，例如結構組分和底物-結合組分。
[0061] 如本文所用的，術語"多個"表示至少兩個。
[0062] 如本文所用的，術語"支架多膚"或"支架亞基"可互換使用并指提供對酶促和/或 非-酶促蛋白組分的多個結合位點的骨架亞基。因此，支架多膚作為整合組分(酶和非-酶促 蛋白組分)的平臺起作用。支架多膚通常是非-催化的。支架多膚可包括一個或多個底物-結 合模塊。
[0063] 如本文所用的，術語"碳水化合物活性酶"指催化碳水化合物和糖綴合物的分解的 酶。該術語涵蓋催化碳水化合物和糖綴合物的分解的酶的酶促-活性部分。一組廣泛的碳水 化合物活性酶被分成酶類并根據(jù)標準分類系統(tǒng)進一步分類為酶家族（Cantarel等2009 Nucleic Acids Res 37:0233-238)。根據(jù)運個分類系統(tǒng)，定義了3類設及碳水化合物和糖綴 合物的分解的酶，即（i)糖巧水解酶，其水解兩個或更多個碳水化合物之間或碳水化合物 和非-碳水化合物部分之間的糖巧鍵，包括例如，纖維素酶、木聚糖酶、CtA-阿拉伯巧喃糖巧 酶、纖維素二糖水解酶、e-葡糖巧酶、e-木糖巧酶、e-甘露糖巧酶和甘露聚糖酶；（ii)多糖 裂解酶，其催化多糖中的碳-氧鍵的裂解，導致不飽和的產(chǎn)物并除去醇，例如，果膠酸裂解酶 和褐藻酸裂解酶;和（ii)糖醋酶，其催化取代的糖的de-0或de-N-酷基化，例如，乙酷基木 聚糖醋酶、果膠甲基醋酶、果膠乙酷醋酶和阿魏酸醋酶。碳水化合物活性酶的信息和更新的 分類可在碳水化合物-活性酶(CA巧)服務器(WWW. cazy. org)上獲得。
[0064] 隨同分類系統(tǒng)一起，指定不同的催化模塊和不同的碳水化合物活性酶的統(tǒng)一方案 被提出并已得到廣泛采用。催化模塊是由其酶類和家族編號指定的。例如，具有分類在家族 10中的催化模塊的糖巧水解酶被指定為"GH10"。酶由活性的類型、它所屬的家族和通常附 加的字母指定。例如，來自某些生物的、具有分類為家族5糖巧水解酶的催化模塊的纖維素 酶，其是首先報告的來自該生物的G冊纖維素酶，被指定為"Cel5A"。
[0065] 術語"多膚"、"膚"和"蛋白"在本文可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。
[0066] 術語"多核巧酸"或"寡核巧酸"在本文可互換使用，指核酸的聚合物。
[0067] 如本文所用的，術語"野生型"指天然存在的DNA/蛋白。術語"衍生物"、"變體"、"修 飾的"可互換使用并指由于引入序列的一個或多個氨基酸取代，和/或一個或多個缺失/添 加而不同于野生型氨基酸序列的多膚。要理解為了類似的目的，衍生物/變體一般保留野生 型中觀察到的特性或活性至衍生物可用作野生型形式的程度。例如，當該術語指黏結蛋白 或錯定蛋白時，它們表示野生型序列已得到修飾，而無不利地影響其分別識別匹配黏結蛋 白/錯定蛋白的能力。通常，相關對應物的識別位點，也稱為結合位點，得到維持。當指酶時， 所述術語表示野生型序列已被修飾，而沒有不利地影響其催化活性。通常，催化結構域被維 持。
[006引多酶復合物 黏結蛋白和錯定蛋白 根據(jù)本發(fā)明的實施方案，多酶復合物的裝配通過兩個模塊-黏結蛋白和錯定蛋白之間 的蛋白-蛋白相互作用介導。
[0069] 在天然多纖維素酶體系統(tǒng)中，黏結蛋白和錯定蛋白模塊控制整合酶進入支架蛋白 亞基，W及多纖維素酶體附著于產(chǎn)生多纖維素酶體的微生物(在一些產(chǎn)生多纖維素酶體的 微生物中）的表面。
[0070] 黏結蛋白是大約140個氨基酸殘基的模塊，其通常作為結構支架蛋白亞基的部分 重復出現(xiàn)。有3個主要類型的黏結蛋白模塊，i、n和HI型，其基于氨基酸序列同源性和蛋白 拓撲結構分類。給定的黏結蛋白的分類可通過與已知的黏結蛋白序列的序列比對來進行。 II型黏結蛋白結構域的序列W在I型黏結蛋白結構域中未發(fā)現(xiàn)的兩個插入為特征。在拓撲 學上，所有黏結蛋白類型分享共同的具有薄卷餅型拓撲結構的9-鏈0-夾層的結構。I型黏結 蛋白僅包括基礎薄卷餅型結構。n型黏結蛋白模塊的結構具有類似于I型結構的整體折疊， 但包括特有的添加:兩個中斷鏈4和8的'0-瓣(flaps)'和在蛋白模塊頂上的a-螺旋。III型 黏結蛋白模塊的結構類似于II型的結構，即它包含兩個中斷鏈4和8的'0-瓣'和a-螺旋，但 Ct-螺旋的位置不同于II型的位置。此外，III型W廣泛的N-末端環(huán)為特征。
[0071] 錯定蛋白是大約60-70個氨基酸殘基的模塊，W兩個雙復制的C. 22-殘基區(qū)段，通 常由9-18個殘基的接頭隔開為特征。兩個重復包括巧-結合環(huán)和"F-螺旋"基序。錯定蛋白根 據(jù)與它們相互作用的黏結蛋白被分類為各種類型，并類似地包括1、11和III型。錯定蛋白的 系統(tǒng)發(fā)生圖在很大程度上反映了它們的黏結蛋白對應物的系統(tǒng)發(fā)生圖，W致與I型黏結蛋 白相互作用的錯定蛋白被嚴密地分組，而與II型黏結蛋白相互作用的錯定蛋白也被分組并 與第一組相差甚遠。
[0072] 在I型模塊中的相互作用一般觀察到黏結蛋白-錯定蛋白系統(tǒng)的交叉物種嚴格性， W致不能期望一個微生物物種的I型黏結蛋白識別來自不同的微生物物種的I型錯定蛋白。 然而，在給定的物種內(nèi)，I型相互作用傾向于為非-特異性的，W致在主要支架蛋白上的所有 黏結蛋白趨向于類似地結合于攜帶不同酶的錯定蛋白。因此，在給定的物種內(nèi)，用于酶結合 的黏結蛋白模塊一般具有類似的特異性。在II型模塊中相互作用的物種間特異性似乎是比 對I型觀察到的特異性的嚴格性要低得多，且交叉物種相互作用有時被觀察到?；静淮嬖?I和II型黏結蛋白-錯定蛋白配偶體之間的交叉-特異性。
[0073] 黏結蛋白模塊構成支架亞基。對于要整合進復合物的酶，選擇具有對應的結合特 異性的錯定蛋白模塊。為了整合酶至精確位置的支架亞基的構建，應選擇趨異特異性的黏 結蛋白。例如，每個黏結蛋白可源自不同的微生物。作為另一個實例，可選擇來自相同物種， 但不同類型的黏結蛋白。
[0074] 關于黏結蛋白和錯定蛋白模塊的分類的信息可例如，在Albar等（ 2009) Proteins, 77:699-709;Noach等（2005) J. Mol. Biol. ：348， 1-12， Xu等（2003) J. Bacteriol. 185: 4548-4557;Baye;r等（2004) Annu. Rev. Microbiol. 58:521-54;Peer 等（2009) FEMS Microbiol Lett.，291(1): 1-16中發(fā)現(xiàn)。
[0075] 關于在I型和II型黏結蛋白和錯定蛋白中物種間或物種內(nèi)的特異性的信息可例 如，在化imovitz等（2008) Proteomics, 8, 968-979中發(fā)現(xiàn)。
[0076] 根據(jù)本發(fā)明的實施方案，可用于構建多酶復合物的、具有相互的結合特異性的黏 結蛋白-錯定蛋白對的非-限制性實例詳細說明于下表A中：
另外的黏結蛋白-錯定蛋白對的實例可在科學文獻中獲得并是本領域技術人員已知 的。
[0077] 相互作用的黏結蛋白和錯定蛋白對可從天然產(chǎn)生多纖維素酶體的細菌，例如，從 熱纖梭菌、解纖維梭菌、嗜纖維梭菌(C. Ce 1 Iulovorans)、約氏梭菌(C. josui)、溶紙莎草 梭菌（C. papy;rosolvens)、C. cla;r;Lflavum、溶纖維素擬桿菌、解纖維醋弧菌 (A. cel Iulolyticus)中發(fā)現(xiàn)的支架蛋白和/或酶獲得。
[0078] 相互作用的黏結蛋白和錯定蛋白對也可從無-多纖維素酶體的細菌和古細菌獲 得。無-多纖維素酶體的黏結蛋白-錯定蛋白相互作用首次描述于Bayer等，1999, FEBS Lett. 463: 277-280中。運樣的無-多纖維素酶體的黏結蛋白和錯定蛋白模塊的非-限制性 列表可在化er等，2009，F(xiàn)EMS Microbiol Lett. 291: 1-16的支持信息中發(fā)現(xiàn)。
[0079] 在一些實施方案中，本發(fā)明的支架多膚包括2-10個黏結蛋白模塊，例如2-8個黏結 蛋白模塊，例如3-8,例如3-6個。在一些實施方案中，整合酶并附接于主要支架(第二支架） 的銜接子支架(第一支架)包含3-4個黏結蛋白模塊。銜接子支架典型地還包含用于附著于 主要支架上的黏結蛋白的錯定蛋白模塊。在一些實施方案中，主要支架多膚，其整合酶和/ 或銜接子支架，包含4-6個黏結蛋白模塊。支架之間的結合特異性不同于支架和酶的結合特 異性。
[0080] 在一些實施方案中，銜接子支架包含多個黏結蛋白模塊，其中至少兩個黏結蛋白 模塊具有對錯定蛋白模塊的不同結合特異性。依據(jù)運些實施方案，銜接子支架包含兩個趨 異黏結蛋白模塊，每個識別不同的錯定蛋白。可存在于銜接子支架中的其它黏結蛋白模塊 可具有不同或相同結合特異性。在一些實施方案中，銜接子支架的所有黏結蛋白模塊具有 不同的結合特異性，意味著銜接子支架上的各個黏結蛋白識別不同的錯定蛋白。
[0081] 本發(fā)明的主要支架包含多個黏結蛋白模塊，其中至少一個黏結蛋白模塊具有對銜 接子支架的錯定蛋白的結合特異性。
[0082] 在一些典型的實施方案中，本發(fā)明的主要支架還包含一個或多個用于整合酶的黏 結蛋白模塊。那些黏結蛋白模塊通常W不同于用于結合銜接子支架的黏結蛋白模塊的結合 特異性的結合特異性為特征。在一些實施方案中，用于酶整合的黏結蛋白模塊具有不同結 合特異性，W致各個黏結蛋白識別不同的錯定蛋白。
[0083] 在一些實施方案中，主要支架包含多個黏結蛋白模塊，其中多個黏結蛋白模塊包 含具有對銜接子支架的錯定蛋白的結合特異性的黏結蛋白模塊，和具有對并非銜接子支架 的錯定蛋白的錯定蛋白的結合特異性的黏結蛋白模塊。
[0084] 在一些實施方案中，銜接子支架的至少一個黏結蛋白模塊具有與主要支架的黏結 蛋白模塊相同的結合特異性，意味著具有特定的結合特異性的至少一個黏結蛋白模塊在主 要支架和銜接子支架二者上發(fā)現(xiàn)。
[0085] 在一些實施方案中，本發(fā)明的支架多膚還包含一個或多個碳水化合物結合模塊 (CBM)。在一些實施方案中，CBM是纖維素-結合CBM。在其它實施方案中，CBM是木聚糖-結合 CBM。在一些實施方案中，CBM分類在選自家族1、2和3的CBM家族中，如在CAZY服務器和/或如 上所詳述的CAZYpedia中所定義的。在一些實施方案中，CBM源自熱纖梭菌CBM。在一些示例 性實施方案中，熱纖梭菌CBM是支架亞基CipA的CBM3a (GenBank登錄號ABN54273)。
[0086] 在一些實施方案中，本發(fā)明的多酶復合物包含用于整合酶的主要和銜接子支架的 陣列，其中銜接子支架是結合各種酶并且還附接于主要支架的中間支架。
[0087] 在一些實施方案中，提供多酶復合物，其含有:主要支架、結合于主要支架的第一 組酶，和具有第二組酶的銜接子支架，銜接子支架結合于主要支架。
[0088] 在一些示例性實施方案中，本發(fā)明的第一(銜接子)支架多膚包含來自熱纖梭菌的 II型錯定蛋白、來自解纖維素醋弧菌的黏結蛋白、來自溶纖維素擬桿菌的黏結蛋白、來自熱 纖梭菌的黏結蛋白和來自熱纖梭菌的CBM。在一些實施方案中，運些模塊由15-40個氨基酸， 例如25-40個氨基酸的接頭隔開。
[0089] 在一些示例性實施方案中，本發(fā)明的第二(主要)支架多膚包含來自解纖維梭菌的 黏結蛋白、來自解纖維素醋弧菌的黏結蛋白、來自熱纖梭菌的I型黏結蛋白、來自閃爍古生 球菌的黏結蛋白、來自黃色瘤胃球菌(R. flavefacien)的黏結蛋白、來自熱纖梭菌的II型黏 結蛋白和來自熱纖梭菌的CBM。在一些實施方案中，運些模塊由15-40個氨基酸，例如25-40 個氨基酸的接頭隔開。
[0090] 在一些實施方案中，銜接子支架包含與SEQ ID NO: 31中提出的序列具有至少80% 的同一性的序列，例如，與SEQ ID NO: 31中提出的序列具有至少85%、至少90、至少95%、至 少97%的同一性。在一些示例性實施方案中，銜接子支架包含在SEQ ID NO: 31中提出的序 列。
[0091] 在一些實施方案中，主要支架包含與SEQ ID NO: 43中提出的序列具有至少80%的 同一性的序列，例如，與SEQ ID NO: 43中提出的序列具有至少85%、至少90%、至少95%、至少 97%的同一性。在一些示例性實施方案中，主要支架包含SEQ ID NO: 43中提出的序列。
[0092] 要理解，引入在SEQ ID NOs. 31和43中提出的序列中的變化不應在對應于黏結蛋 白與它們各自的錯定蛋白的結合位點的區(qū)域中進行，所述區(qū)域?qū)τ谶\種相互作用是重要 的。
[0093] 接頭 本發(fā)明的支架多膚的不同模塊通過包含5個氨基酸或更多，通常為5-50個氨基酸，例如 5-35個氨基酸、15-50個氨基酸、20-50個氨基酸、25-50個氨基酸、20-40個氨基酸、25-45個 氨基酸、25-40U5-35個氨基酸的接頭互連。各種可能性代表本發(fā)明的一個單獨的實施方 案。
[0094] 在一些實施方案中，與特定的支架多膚的模塊互連的接頭是相同的。在一些實施 方案中，不同的接頭在一個支架多膚內(nèi)不同組分之間使用。
[00M]接頭區(qū)域一般由一組的限制性氨基酸組成一一通常脯氨酸和蘇氨酸是普遍的，其 中另外類型的氨基酸不太豐富。
[0096] 可選擇用于接頭的氨基酸組成，例如，W包括鄰近用來構成嵌合體支架亞基的模 塊（即，黏結蛋白、CBM等）的接頭序列（或其部分）。用于構建本發(fā)明的支架多膚的接頭序列 可例如源自在Bayer等，2009,我們可結晶多纖維素酶體嗎？（Can we C巧Stallize a cellulosome?)在：木質(zhì)纖維素降解和生物質(zhì)利用的生物技術（In: Biotechnology of Iignocellulose degradation and biomass utilization). Sakka K, Karita S, Kimura T, Sakka M, Matsui H, Miyake H, Tanaka A編車茸：Ito Print Publishing Division; 183-205)中評述的列表。示例性接頭序列在W下的實施例章節(jié)中提供。
[0097] 產(chǎn) 根據(jù)^些實施方案，本發(fā)明的支架多膚介導多個碳水化合物活性酶或其酶促-活性部 分整合到復合物中。各個酶，或其酶促-活性部分，包含用于整合到特異性匹配黏結蛋白中 的錯定蛋白模塊。
[0098] 在一些實施方案中，整合到復合物中的酶包含異源性錯定蛋白模塊。異源性錯定 蛋白模塊表示不同于天然存在的酶的錯定蛋白的錯定蛋白，或引入并非天然包括錯定蛋白 的多膚的錯定蛋白，即它是一種工程改造的源自不包含錯定蛋白模塊的野生型序列的酶。 因此，野生型不能結合到復合物例如多纖維素酶體中。然而，工程改造的酶，被設計為包括 錯定蛋白模塊，因而能夠整合到本發(fā)明的復合物中。
[0099] 通常，碳水化合物活性酶W多-模塊組織為特征，其中催化模塊與一個或多個調(diào)節(jié) 酶活性的輔助性(ancillary)的輔助化elper)模塊相結合。每個模塊包含連續(xù)部分的多膚 鏈并形成獨立折疊、結構和功能上不同的單位。主要輔助性模塊之一是碳水化合物-結合模 塊。在一些實施方案中，異源性錯定蛋白結構域替代至少一個最初在酶結構中發(fā)現(xiàn)的輔助 性模塊。在其它實施方案中，除了原始輔助性模塊，還引入異源性錯定蛋白結構域。
[0100] 在一些實施方案中，碳水化合物活性酶選自糖巧水解酶、多糖裂解酶和糖醋酶。在 一些實施方案中，使用糖巧水解酶、多糖裂解酶和糖醋酶的組合。
[0101] 如上所述的"糖巧水解酶"是水解二個或更多個碳水化合物之間或碳水化合物和 非-碳水化合物部分之間的糖巧鍵的酶。糖巧水解酶可催化0-、N-和/或S-連接的糖巧的水 解。糖巧水解酶有時被稱為糖巧酶和糖基水解酶。糖巧水解酶的非-限制性實例包括纖維素 酶、木聚糖酶、Q-L阿拉伯巧喃糖巧酶、纖維素二糖水解酶、0-葡糖巧酶、0-木糖巧酶、0-甘露 糖巧酶和甘露聚糖酶。有關在碳水化合物分子中發(fā)現(xiàn)的糖巧鍵和其它類型的鍵的信息可例 如，在M. L. Sinnott (2007)碳水化合物化學和生物化學：結構和機制（Carbohydrate Chemistry and Biochemistry: Structure and mechanism)，第一片反，Royal Society of Qiemistry 中找到。
[0102] 在一些特定實施方案中，本發(fā)明的復合物的糖巧水解酶選自纖維素酶、木聚糖酶 和e-葡糖巧酶。在一些實施方案中，使用纖維素酶、木聚糖酶和e-葡糖巧酶的組合。
[0103] 如上文進一步指出的，"多糖裂解酶"指一組催化多糖中的碳-氧鍵的裂解，導致不 飽和的產(chǎn)物和除去醇的碳氧裂解酶。通常，多糖裂解酶經(jīng)由e-消除機制裂解含糖醒酸多糖 鏈，W生成不飽和的己締糖醒酸殘基和新的還原端。多糖裂解酶的非-限制性實例包括果膠 酸裂解酶和褐藻酸裂解酶。
[0104] 如上文進一步指出的，"糖醋酶"指水解糖醋的酶。通常，糖醋酶催化取代的糖的 de-o或de-N-酷基化。糖醋酶的非-限制性實例包括乙酷基木聚糖醋酶、果膠甲基醋酶、果膠 乙酷基醋酶和阿魏酸醋酶。
[0105] 在一些實施方案中，碳水化合物-活性酶是多纖維素酶體的酶。術語"多纖維素酶 體的酶"指在自然界中通常作為多纖維素酶體復合物的部分發(fā)現(xiàn)的酶。
[0106] 在一些實施方案中，碳水化合物-活性酶是非-多纖維素酶體的酶。術語"非-多纖 維素酶體的酶"指在自然界中作為游離酶，通常分泌到環(huán)境中的活性酶。運樣的酶通常不具 有錯定蛋白模塊。
[0107] 在一些實施方案中，碳水化合物-活性酶是細菌酶。在一些實施方案中，細菌選自 T. fUsca和熱纖梭菌。在其它實施方案中，碳水化合物-活性酶是真菌酶。
[0108] 碳水化合物活性酶的類型已在上文描述。在一些實施方案中，碳水化合物活性酶 包括木聚糖酶。木聚糖酶被分類為例如糖巧水解酶家族5、8、10、11、26和43。在一些實施方 案中，木聚糖酶是細菌木聚糖酶。
[0109] 在一些實施方案中，碳水化合物活性酶包括纖維素酶。纖維素酶可選自外切葡聚 糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和加工性內(nèi)切葡聚糖酶。纖維素酶被分類為例如糖巧水解酶家族5、6、 7、8、9、12、26、44、45、48、51、61和74。在一些實施方案中，纖維素酶是細菌纖維素酶。
[0110] 在一些實施方案中，碳水化合物活性酶包括0-葡糖巧酶。0-葡糖巧酶被分類為例 如糖巧水解酶家族1、3、9、30和116。在一些實施方案中，0-葡糖巧酶是細菌0-葡糖巧酶。
[0111] 在一些示例性實施方案中，結合于支架多膚的多個碳水化合物活性酶包含外切葡 聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和加工性內(nèi)切葡聚糖酶。
[0112] 在一些實施方案中，本發(fā)明的多酶復合物包含至少兩個纖維素酶，例如=個纖維 素酶、四個纖維素酶或更多個纖維素酶。各個可能性代表本發(fā)明的一個獨立的實施方案。
[0113] 在一些實施方案中，本發(fā)明的多酶復合物包含至少兩個木聚糖酶，例如木聚糖酶 纖維素酶、木聚糖酶纖維素酶，或更多。各個可能性代表本發(fā)明的一個獨立的實施方案。
[0114] 在一些示例性實施方案中，本發(fā)明的多酶復合物包含4個纖維素酶和4個木聚糖 酶。
[0115] 在一些特定的示例性實施方案中，多個碳水化合物活性酶包含來自熱纖梭菌的外 切葡聚糖酶Cel48S、來自熱纖梭菌的內(nèi)切葡聚糖酶CelSA和來自熱纖梭菌的加工性內(nèi)切葡 聚糖酶Cel9K的至少一個。
[0116] 在另外的特定示例性實施方案中，多個碳水化合物活性酶包含來自T. fusca的外 切葡聚糖酶Cel48A、來自T. fusca的內(nèi)切葡聚糖酶Cel5A和來自T. fusca的加工性內(nèi)切葡 聚糖酶Cel9A的至少一個。
[0117] 在另外的特定示例性實施方案中，多個碳水化合物活性酶包含來自T. fusca的木 聚糖酶乂711434心711114心711108和乂711104的至少一個。
[0118] 在一些示例性實施方案中，結合于支架多膚的多個碳水化合物活性酶包含木聚糖 酶和外切葡聚糖酶。
[0119] 在一些特定的示例性實施方案中，多個碳水化合物活性酶包含來自T. fusca的木 聚糖酶Xyn43A、XynllA、XynlOB和XynlOA,和來自T. fusca的外切葡聚糖酶Cel5A。
[0120] 具有合適的錯定蛋白的示例性酶促亞基在W下實施例章節(jié)中提供。
[0121] 對于某些酶的組合，在復合物內(nèi)的排列或相對次序具有對整體活性的影響。復合 物活性的排列的作用可由本領域技術人員容易地確定。
[0122] 在一些典型的實施方案中，支架多膚和存在于本發(fā)明的多酶復合物中的各個碳水 化合物活性酶是非-共價連接的。在另外的典型實施方案中，它們經(jīng)由黏結蛋白和錯定蛋白 之間的相互作用連接。在其它實施方案中，支架多膚和各個纖維素分解酶是共價連接的。在 另外的或備選的實施方案中，支架多膚和各個纖維素分解酶是交聯(lián)的。
[0123] 典型地，多酶復合物的不同組分在宿主細胞中重組地和分別地生產(chǎn)、純化，并且然 后在溶液中混合在一起W形成復合物。
[0124] 因此，多酶復合物通常未附接于微生物細胞的外層表面。
[01巧]本文描述的多膚可通過如本領域已知的重組方法產(chǎn)生。例如： 重組表達 本發(fā)明的多膚可通過在宿主細胞(例如，用核酸分子轉(zhuǎn)化的微生物細胞）中表達編碼多 膚的多核巧酸分子來合成。
[0126]編碼所需的多膚的多核巧酸的合成可如在W下實施例中所述的進行。編碼野生型 多膚的DNA序列可從產(chǎn)生它們的微生物的任何株或亞型，使用本領域熟知的各種方法分離 (見例如Sambrook等，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∕olecular Cloning: A LaboratoiT Manual),第S版，Cold Spring化rbor, N.Y.，（2001))。例如，編碼野生型多膚的DNA可 通過聚合酶鏈反應(PCR)，使用在已知野生型序列的核巧酸序列的基礎上構建的特異性引 物，從適宜的微生物的基因組DNA擴增?；蚪MDNA可從細菌細胞提取，然后使用本領域已知 的各種方法擴增，見例如，Marek P. M等，"Cloning and expression in Escherichia coli of Clostridium thermocellum DNA encoding p-glucosidase activity", Enzyme and Microbial Technology Volume 9，Issue 8,1987年8月，474-478頁。編碼野生型多膚 的分離的多核巧酸可被克隆到載體中，例如祀T28a質(zhì)粒。
[0127]用所需序列產(chǎn)生多核巧酸的一種可供選擇的方法是使用合成的基因。編碼本發(fā)明 的多膚的多核巧酸可W例如使用亞氨基憐酸醋方法經(jīng)合成制備（見，Beaucage等，Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2001 年5 月；第3 章：3.3 單元；Caruthers 等，Methods Enzymol.1987， 154:287-313)。
[01%]如此產(chǎn)生的多核巧酸然后可經(jīng)受進一步的處理，包括W下的一個或多個處理：純 化、復性、連接、擴增、通過限制性內(nèi)切酶消化并克隆到適宜的載體中。多核巧酸可首先連接 進入克隆載體，或直接進入適合于其在特定的宿主細胞類型中表達的表達載體。
[0129] 多核巧酸可包括非-編碼序列，包括例如，非-編碼5'和3'序列，例如轉(zhuǎn)錄的非-翻 譯序列、終止信號、核糖體結合位點、穩(wěn)定mRNA的序列、內(nèi)含子和多聚腺巧酸化信號。多核巧 酸可包含與變體多膚異源的另外氨基酸的編碼序列，特別是標記序列，例如多聚-His標簽， 其促進呈融合蛋白形式的多膚的純化。
[0130] 多膚可生產(chǎn)為帶標簽的蛋白，例如W幫助提取和純化。標簽構建體的非-限制性實 例是化S-標簽(6個連續(xù)的組氨酸殘基），其可通過常規(guī)方法分離和純化。包括在標簽部分和 目的蛋白序列之間的蛋白水解的裂解位點W允許除去標簽，例如凝血酶裂解位點，也可W 是方便的。
[0131] 編碼多膚的多核巧酸可結合到各種類型的表達載體中，其可轉(zhuǎn)化到各種類型的宿 主細胞中。宿主細胞可W是原核或真核的。
[0132] 將多核巧酸引入宿主細胞可通過熟知的方法，例如化學轉(zhuǎn)化(如氯化巧處理）、電 穿孔、接合、轉(zhuǎn)導、憐酸巧轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)介、微注射、陽離子脂質(zhì)-介導的 轉(zhuǎn)染、刮裝、彈道導入和感染來進行。
[0133] 在一些實施方案中，細胞是原核細胞。適宜的原核宿主的代表性的、非-限制性實 例包括細菌細胞，例如大腸桿菌化scherictabia col i )和枯草芽胞桿菌（Baci 1 Ius SUbt i 1 i S)的細胞。在其它實施方案中，細胞是真核細胞。在一些示例性實施方案中，細胞是 真菌細胞，例如酵母。適宜的酵母細胞的代表性的、非-限制性實例包括釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)和己斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。在另外的示例性實 施方案中，細胞是植物細胞。
[0134] 多膚可W在適合于表達的任何載體中表達。適宜的載體根據(jù)選擇的宿主細胞確 定。用于在大腸桿菌化.coli)中表達蛋白的載體，例如，包括，但不限于，pET、pK233、pT7和 入pSKF。其它表達載體系統(tǒng)是基于0-半乳糖巧酶(pEX);麥芽糖結合蛋白（pMAL);和谷脫甘膚 S-轉(zhuǎn)移酶(pGST)。
[0135] 用所需載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇可使用包括在對非-轉(zhuǎn)化的細胞有毒的選擇培 養(yǎng)基中生長的標準選擇方案實現(xiàn)。例如，大腸桿菌可在含有抗生素選擇劑的培養(yǎng)基中生長； 用還提供抗生素抗性基因的表達載體轉(zhuǎn)化的細胞，將在選擇培養(yǎng)基中生長。
[0136] 在合適的宿主細胞轉(zhuǎn)化，和在適宜于蛋白表達的條件下繁殖時，可在轉(zhuǎn)化的細胞 的細胞提取物中鑒定所需多膚。表達目的多膚的轉(zhuǎn)化的宿主可通過使用SDS-PAGE分析由宿 主表達的蛋白，并比較該凝膠與從用相同載體轉(zhuǎn)化但不含編碼目的蛋白的核酸序列的宿主 獲得的SDS-PAGE凝膠來鑒定。
[0137] 目的蛋白也可通過其它已知的方法例如使用合適的抗體的免疫印跡分析、總細胞 提取物的斑點印跡、有限的蛋白水解、質(zhì)譜分析及其組合來鑒定。
[0138] 目的蛋白可通過常規(guī)方法，包括硫酸錠或乙醇沉淀、酸提取、鹽分級、離子交換色 譜、疏水性相互作用色譜、凝膠滲透色譜、親和色譜及其組合來分離和純化。
[0139] 可使用本領域已知的方法，其中一些在下文描述，分析分離的目的蛋白的各種特 性，例如特異性活性和熱穩(wěn)定性。
[0140] 進行上述程序W及其它有用的方法的條件由本領域普通技術人員容易地確定(見 例女曰，Current Protocols in Protein Scienc, 1995 John Wiley & Sons)。
[0141] 在特定實施方案中，本發(fā)明的多膚可在沒有它們的起始密碼子（甲硫氨酸或鄉(xiāng)氨 酸)和/或沒有它們的前導(信號)膚的情況下被生產(chǎn)和/或使用，W利于重組多膚的生產(chǎn)和 純化。已知在沒有編碼前導膚的序列的情況下克隆基因?qū)⑾拗贫嗄w于宿主細胞的胞漿并將 促進它們的回收(見例如，Glick, B. R.和化Sternak, J. J. (1998)在"分子生物技術:重 組DNA的原理和應用（Molecular biotechnology : Principles and applications of recombinant DNA)",第2版，ASM Press, Washington D.C., p. 109-143中）。
[0142] 本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的多酶復合物的組合物，用于生物質(zhì)降解。
[0143] 本發(fā)明還提供能夠生產(chǎn)本發(fā)明的多酶復合物的基因修飾細胞。運些細胞能夠生 產(chǎn)，并且通常分泌復合物的不同組分。
[0144] 在一些實施方案中，基因修飾細胞選自原核和真核細胞。各個可能性代表本發(fā)明 的一個獨立的實施方案。
[0145] 本發(fā)明提供用于生物轉(zhuǎn)化纖維素物質(zhì)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含本發(fā)明的多酶復合物。
[0146] 方法和用途 本發(fā)明的多酶復合物，包含所述多酶復合物的組合物和生產(chǎn)所述多酶復合物的細胞可 用于將纖維素物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化為降解產(chǎn)物。
[0147] "纖維素物質(zhì)"和"纖維素生物質(zhì)"指含有纖維素的材料，特別是自含有纖維素的植 物來源獲得的材料。纖維素物質(zhì)涵蓋含有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的木質(zhì)-纖維素物質(zhì)。 纖維素物質(zhì)可包括自然植物生物質(zhì)并且還包括廢紙等。合適的纖維素物質(zhì)的實例包括，但 不限于，麥桿、柳枝稷、玉米棒、玉米賴桿、高梁賴桿、棉花賴桿、甘薦渣、能源甘薦、硬木紙、 軟木紙，或其組合。
[0148] 生成的糖可用于醇例如乙醇、丙醇、下醇和/或甲醇的生產(chǎn);燃料如，生物燃料例如 合成液體或氣體，如合成氣的生產(chǎn);和其它發(fā)酵產(chǎn)物，如班巧酸、乳酸或乙酸的生產(chǎn)。
[0149] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本文提供一種將纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為降解產(chǎn)物的方法，該 方法包括使所述纖維素物質(zhì)暴露于本發(fā)明的多酶復合物。
[0150] 在一些實施方案中，多酶復合物在與纖維素物質(zhì)接觸之前的裝配包括W下步驟： (i)在第一溶液中使第一支架多膚與其對應的酶混合，得到第一支架-酶復合物；（ii)在 第二溶液中使第二多膚與其對應的酶混合，形成第二支架-酶復合物;和(iii)混合第一和 第二溶液，得到第一和第二支架的結合，從而獲得本發(fā)明的多酶復合物。
[0151] 根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，本文提供一種將纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為降解產(chǎn)物的方法， 該方法包括使所述纖維素物質(zhì)暴露于能夠生產(chǎn)本發(fā)明的多酶復合物的基因修飾細胞。
[0152] 降解產(chǎn)物通常包含單糖、二糖和寡糖，包括，但不限于葡萄糖、木糖、纖維二糖、木 二糖、纖維=糖、纖維四糖、阿拉伯糖、木=糖。
[0153] 本發(fā)明的多酶復合物可加入到生物轉(zhuǎn)化和其它工業(yè)過程，例如，連續(xù)、分批或補料 分批方法中。備選地或另外地，本發(fā)明的多酶復合物可重復利用。通過緩解木聚糖內(nèi)切酶和 夕F/內(nèi)切葡聚糖酶的終產(chǎn)物抑制（例如木二糖和纖維二糖），它可W能夠進一步提高纖維素 物質(zhì)的水解。
[0154] 提出W下實施例W更全面地舉例說明本發(fā)明的某些實施方案。然而，它們決不應 該被解釋為限制本發(fā)明的廣泛范圍。本領域技術人員可容易地設計本文公開的原理的許多 變化和修飾，而不背離本發(fā)明的范圍。 實施例
[0155] 實施例1 -支架多膚中接頭長度的影響 支架多膚的組合文庫的制備： 制備重組=價設計者支架多膚的組合文庫。從W下4個模塊制備支架庫： -碳水化合物結合模塊(稱為"CBM"):來自熱纖梭菌的CipA的CBM3a (GenBank登錄號 ABN54273)(沈Q ID NO: 1) -=個(3)不同特異性的趨異黏結蛋白模塊： (i) 來自熱纖梭菌的黏結蛋白（來自熱纖梭菌的CipA的第二黏結蛋白，稱為"Ct"或" T") (GenBank登錄號ABN54273)(沈Q ID NO: 2) (ii) 來自溶纖維素擬桿菌的黏結蛋白（來自溶纖維素擬桿菌的ScaB的第S黏結蛋白， 稱為"Be"或"B") (GenBank登錄號AAT79550)(沈Q ID NO: 3) (iii) 來自解纖維素醋弧菌的黏結蛋白（來自解纖維素醋弧菌的ScaC的第S黏結蛋 白，稱為"Ac"或"A") (GenBank登錄號AAP48996)(沈Q ID NO: 4) 設計庫W使不同的模塊被0 ("無接頭"）、5 ("短")或27-35 ("長")個氨基酸的接頭隔 開。用于該工作的不同接頭的氨基酸含量示于表1。 郵]表1 -用于克隆的模塊間接頭的組 指示各個接頭的在前模塊。
[0157] 原則上，4個模塊可被改組W產(chǎn)生24個不同的排列，每個具有隔開模塊的3個不同 長度的接頭。因此，從基礎支架模板，可潛在地產(chǎn)生72個可能的組合。十四（14)個全組，表示 42個克隆和表達的支架蛋白，被成功地克隆和表達，且被用于進一步的研究。圖1指定72個 可能的組合。只有完全的組在模塊示意圖中示出。
[0158] 關于在庫中不同支架多膚的克隆、表達和純化的細節(jié)在下文("材料和方法"）中給 出。
[0159] 設計者多纖維素酶體的裝配: 為裝配設計者多纖維素酶體，使用W下來自熱纖梭菌的3個模型纖維素酶:與其天然錯 定蛋白一起的外切葡聚糖酶Cel48S (稱為"48S-t")、融合至來自溶纖維素擬桿菌的ScaA的 錯定蛋白模塊的內(nèi)切葡聚糖酶CelSA (稱為"8A-b")，和融合至來自解纖維素醋弧菌的ScaB 的錯定蛋白模塊的加工性內(nèi)切葡聚糖酶Cel9K (稱為"9K-a")。
[0160] 重組酶的構建在下文描述。
[0161] 48S-t的氨基酸序列在SEQ ID NO: 13中提出。錯定蛋白模塊對應于該序列的殘基 652-715。編碼48S-t的多核巧酸序列在沈Q ID NO: 14中提出。
[0162] 8A-b的氨基酸序列在SEQ ID NO: 15中提出。錯定蛋白模塊對應于該序列的殘基 389-459。編碼8A-b的多核巧酸序列在沈Q ID NO: 16中提出。
[0163] 9K-a的氨基酸序列在SEQ ID NO: 17中提出。錯定蛋白模塊對應于該序列的殘基 808-878。編碼9K-a的多核巧酸序列在沈Q ID NO: 18中提出。
[0164] 簡言之，測試W下多-酶構型： -支架包含： 來自熱纖梭菌、溶纖維素擬桿菌和解纖維素醋弧菌的黏結蛋白模塊； CBM； 其中不同的模塊由O (無接頭）、5或27-35個氨基酸的接頭隔開。
[01化]-酶； Cel48S (熱纖梭菌）+來自熱纖梭菌的錯泊(稱為"48S-t") CelSA (熱纖梭菌）+來自溶纖維素擬桿菌的錯泊(稱為"8A-b") Cel9K (熱纖梭菌）+來自解纖維素醋弧菌的錯泊(稱為"9K-a") 黏結蛋白-錯定蛋白相互作用的特異性通過如將于下文詳述的基于親和力的化ISA驗 證。嵌合體支架被發(fā)現(xiàn)與它們的匹配錯定蛋白特異性地相互作用。同樣地，纖維素酶與它們 的匹配黏結蛋白特異性地相互作用。
[0166] 設計者-多纖維素酶體復合物的形成首先通過非-變性PAGE分析。各個酶的完全相 互作用的摩爾比用來自支架組的幾個代表性支架確定。運些預定的摩爾比被用于3種酶與 完整的42個支架蛋白組相互作用，非-變性PAGE被用來評價生成的復合物。每個復合物作為 一個主要的帶在凝膠上遷移，從設計者多纖維素酶體的各個組分的帶遷移，指示在每一種 情況下的有生產(chǎn)力的接近完成或完全的相互作用。此外，設計者多纖維素酶體復合物用尺 寸排阻色譜法分析，由此各個單一組分被分開評價，和它們的保留體積被用作分析設計者 多纖維素酶體復合物的標記物。多纖維素酶體復合物洗脫比單一酶和支架更快，作為一個 主要的峰出現(xiàn)。合并來自設計者多纖維素酶體復合物的各部分，濃縮，然后經(jīng)SDS-PAGE分 析。顯示主要峰由所有巧巾酶與嵌合體支架一起組成。
[0167] 活性分析: 在一個初步分析中，對重組酶降解憐酸溶脹纖維素(PASC)或微晶纖維素(Avicel)的能 力進行測試，并將們的活性與野生型酶的活性進行比較。
[0168] 設計者多纖維素酶體的活性使用微晶纖維素 (Avicel)作為純微晶纖維素底物和 含有90%纖維素、5%半纖維素和5%木質(zhì)素的預處理的富含纖維素的麥桿作為自天然來源獲 得的模型底物來檢查。
[0169] 進行一種代表性支架組的初步動力學分析，W確定在任一底物上的纖維素水解反 應的終點。
[0170] 其次，在單一時間點（通過動力學分析預先確定的），測試由庫中各個支架組成的 設計者多纖維素酶體的纖維素水解。對于微晶纖維素 (Avicel),在72小時測試活性，因為較 短溫育時間具有低于5%的轉(zhuǎn)化率。對于預處理的麥桿，3小時后動力學反應達到約20%的轉(zhuǎn) 化，因此較長的溫育時間是不必要的。
[0171] 測試W下組合的活性： a.巧巾游離狀態(tài)的酶的混合物。
[0172] b.巧中游離狀態(tài)的酶的混合物，其中各個酶結合于由匹配黏結蛋白模塊和CBM (" CBM-Coh")組成的微小-支架。因此，酶未整合到一個復合物中，但各個酶分別祀向底物。
[0173] C.結合于來自庫的支架的3個酶的復合物。測試了 14個不同的支架排列（組)與3 種纖維素酶組合對微晶纖維素 (Avicel)和預處理的麥桿的活性;對于各個排列，對模塊間 接頭的長度（即無接頭、5個氨基酸或平均30.5 (27-35)個氨基酸)變化的3個支架進行了測 試。
[0174] 結果示于圖2A (微晶纖維素）和圖2B (預處理的麥桿）。在A和B二者中，上面的小 圖顯示具有支架組與內(nèi)部CBM的多纖維素酶體的活性，和下面的小圖提供多纖維素酶體與 在末端攜帶CBM的支架的結果。
[0175] 設計者支架的模塊排列和模塊間接頭長度的所有組合在兩種底物上產(chǎn)生活性的 =價設計者多纖維素酶體裝配。設計者多纖維素酶體顯示出一種協(xié)同作用并具有比游離酶 W及祀向酶(經(jīng)由CBM-Cohs)更高的活性。
[0176] 結果也掲示隨著模塊間接頭長度從完全無接頭至5個殘基的短接頭，和從短的接 頭至長的接頭的增加，對兩種底物呈現(xiàn)增加活性的趨勢。相互作用的雙向ANOVA被用于統(tǒng)計 學驗證，長度和14個支架蛋白排列作為因子;對任一底物[微晶纖維素 (P = 0.16)、預處理 的麥桿(P = 0.0595)]未發(fā)現(xiàn)有相互作用，指示接頭長度對活性確實具有顯著的作用。因 此，由長接頭、短接頭和無-接頭支架顯示的活性對于兩種底物，在大多數(shù)組中觀察到彼此 顯著不同。
[0177] 用于=價設計者支架蛋白的優(yōu)選的模塊排列對于用于該研究的巧巾酶未觀察到， 指示運巧巾酶可在設計者多纖維素酶體的任何位置整合，而對纖維素-降解活性沒有顯著作 用。
[017引材料和方法 1.纖維素酶的克隆 重組野生型家族-48外切型纖維素酶Cel48S-ct，分別用W下正向和反向引物從熱纖梭 菌ATCC 27405基因組DNA擴增：5' CAGTCCATGGGTCCTACAAAGGCACCTAC 3'（沈Q ID NO: 19) 和5' CGCGAAGCTTTTAATGGTGATGGTGATGGTGG 3'（沈Q ID NO: 20) (Nco巧口HindIII限制性 位點W黑體表示），運允許結合到pET28a中。類似地，重組野生型家族-8內(nèi)切型纖維素酶 Cel8A-bc CelSA，分別用W下正向和反向引物從熱纖梭菌的基因組DNA克?。?' CAGTCCATGGGTGTGCCTTTTAACACAAA 3' (SEQ ID NO: 21)和5' CACGCTCGAGATAAGGTAGGTGGGGTATGC 3'（沈Q ID NO: 22)，（化01和化01 限制性位點 W黑體 表示）。同樣地，重組野生型家族-9內(nèi)切型纖維素酶Cel9K-ct，分別使用無限制性(RF)方法 (Unger等，2010, J Struct Biol, 172:34-44)，用W下正向和反向引物，從熱纖梭菌基因 組DNA擴增并克隆到祀T28a載體中：5' GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCATCACCATCAC CATCACTTAGAAGACAAGTCTCCAAAGTTGCCGGAT 3，(SEQ ID NO: 23)和5， GAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTTATTTATGTGGCAATACATCTATCTCTTTAAG 3' （沈Q ID NO: 24)，（基因特異性序列加下劃線，質(zhì)粒特異性序列用普通字體顯示，His-標簽W黑體表 示）。對于具有來自解纖維素醋弧菌的趨異錯定蛋白的Cel9K-ac的克隆，從解纖維素醋弧菌 的基因組DNA擴增錯定蛋白并用于使用RF克隆方法，分別用W下正向和反向引物，同時插入 趨異錯定蛋白和缺失野生型錯定蛋白進入野生型Cel9K-ct質(zhì)粒：5' CTCGATGAAATTGACTTAATAACACCGCCAGGTACCAAATTTATATATGGTGATGTTGATGGTAATG 3' （SEQ ID NO: 25)和5' GAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTTATTCTTCTTTCTCTTCAACAGGGAATAAA AATATC 3' (SEQ ID NO: 26)(基因特異性序列加下劃線，質(zhì)粒特異性序列用普通字體顯 示）。對于具有熱纖梭菌CelSA催化模塊和來自溶纖維素擬桿菌的趨異錯定蛋白的嵌合體酶 Cel8A-bc的克隆，CelSA的催化模塊分別用W下正向和反向引物，從熱纖梭菌ATCC 27405基 因組DNA擴增：5' ATTCAACCATGGGTGTGCCTTTTAACACAAAATAC 3'（SEQ ID NO: 27)和5' ATATTGCTCGAGTAATGTGGTACCAATGAAGGTGTCGGATTCGACG 3' （沈Q ID NO: 28) (NcoI、KpnI 和化Ol限制性位點W黑體表示）dPCR產(chǎn)物被克隆到用NcoI和趾Ol限制性酶線性化的祀T28a 質(zhì)粒中，得到P8A-CD。錯定蛋白分別用W下正向和反向引物，從溶纖維素擬桿菌基因組DNA 擴增：5' ACTTTAGGTACCTCCAAAAGGCACAGCTAC 3' (SEQ ID NO: 29)和5' ATTAATCTCGAGCGCTTTTTGTTCTGCTGG 3'（沈Q ID NO: 30)化pnl和化01 限制性位點W黑體 表示）。生成的DNA被克隆到用KpnI和化01線性化的P8A-CD中，得到p8A-bc。
[0179] 2.短接頭和無-接頭支架的高-通量計算機輔助克隆 一種用于組合DNA庫設計和生產(chǎn)的計算機輔助自動方法被用于失去模塊間接頭或者含 有短的（5 aa)模塊間接頭的支架的構建和克隆。使用運種途徑的支架的設計和合成使用計 算機輔助方法進行W指定、可視化和規(guī)劃和執(zhí)行所需DNA文庫的實際生產(chǎn)化inshiz等， 2008，Mol Syst Biol, 4:191;和Siabi等，2010，Syst Synth Biol, 4:227-236)。
[0180] 在運種方法中的核屯、遞歸構建步驟需要4個基礎酶促反應:憐酸化、延伸、PCR和入 核酸外切，并如由上面提到的Linshiz先前描述的，使用為此目的設計的一組引物進行。
[0181] 通過第二組引物，根據(jù)位于各個支架構建體的5'和3'的模塊，擴增PCR產(chǎn)物W產(chǎn)生 足夠量的DNA用于隨后的克隆。擴增的產(chǎn)物經(jīng)NcoI和趾OI消化，并與NcoI-XhoI線性化 祀T28a載體連接(Novagene，Madison, WI)。陽性克隆通過菌落PCR選擇并通過測序驗證。
[0182] 3.長-接頭支架的無限制性(RF)克隆 第二途徑，設及DNA區(qū)段的無限制性多-組分裝配(Unger等，2010，J Struct Biol, 172:34-44)，被用于克隆具有長(27-35 aa)模塊間接頭的支架。為構建各個支架，設計8個 引物對。His-標簽被加入到各個構建體的C末端用于使用Ni-次氮基S乙酸(NTA)柱(Qiagen GmbH,化den, Germany)進一步純化。4個模塊通過PCR在對應于連接區(qū)域(或者用另一個連 接插入基因或者在需要時用表達載體)的5'和3'兩個末端上，用25-至30-bp突出端擴增。接 著，PCR產(chǎn)物作為特大-引物用于同時裝配載體(pET28a質(zhì)粒)和通過線性擴增插入，生成含 有編碼重組支架多膚(帶有4個模塊)的序列的線性質(zhì)粒(pET28a)。
[0183] 設計用于PCR擴增的引物組并使用化usion聚合酶(Thermo Scientific)進行隨后 的RF反應。
[0184] 4.纖維素酶和設計者支架的表達和純化 于37°C，使過度生產(chǎn)祀T28a-支架基因或纖維素酶的大腸桿菌化21 (DE3)細胞在補充 有50 g/ml 卡男 P 霉素（Sigma-Aldrich Chemical Co, St. Louis , Missouri)的Luria-Bertani肉湯中生長至Asoo = 0.8-1.0。使培養(yǎng)物冷卻至16°C，并基于預定的最佳實驗的結 果，通過添加0-1 mM異丙基-1-硫代-D-半乳糖巧-IPTG (Fermentas UAB Vilnius, Lithuania),誘導蛋白表達。于16°C溫育培養(yǎng)物另外16 h，細胞通過離屯、（3500 g, 15 min) 收獲，再次懸浮于補充有5 mM咪挫（Merck KGaA, Darmsta化，Germany)的IYis-緩沖鹽水 (TBS、137 ml化Cl、2.7 mM KCl、25 mM IYis-肥1，抑7.4)中并通過超聲破裂。加熱超聲裂 解物 20 min 至 60°C 并離屯、（20 ,OOOg, 30 min)。于 4°C，使上清液與 4 ml Ni-NTA 珠在 20-ml Econo-裝填柱中混合1 h用于批純化。柱用100 ml洗涂緩沖液(TBS、50 mM咪挫）的重力流洗 涂并用14 ml洗脫緩沖液(TBS, 250 mM咪挫)進行洗脫。為了純化支架，應用另外的親和-純 化步驟:于4°C，使洗脫的部分與10 ml憐酸溶脹纖維素(PASC) (0.75 mg/ml)，在50-ml試管 中解育1 h，W允許結合CBM。基質(zhì)用含有1 M NaCl的TBS洗涂3次，并用不加鹽的TBS洗涂3 次。支架用1%S乙胺洗脫并用1 M 2-(N-嗎嘟代）乙燒橫酸(MES)緩沖液(pH 5)中和。對于支 架和纖維素酶二者，緩沖液通過對TBS透析進行交換，支架樣品使用Amicon叫化a 15 ml 50,000 MWCO濃縮器濃縮(Millipore, Be壯ord, MA)。蛋白濃縮物通過在280 nm處的吸光 度估算。消光系數(shù)根據(jù)已知的各個蛋白的氨基酸組成，使用Pro證aram工具在EXPASY服務器 (http : //www. expasy. org/tools/protparam. html)上測定（Gasteiger等，2005 ,在 ExPASy服務器上的蛋白鑒定和分析工具（Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server))。
[0185] 5.黏結蛋白-錯定蛋白特異性分析 對Barak等，2005，J Mol Recogit, 18:491-501 的程序進行微小修改。Maxisorp ELISA板(Nunc A/S, Roskilde, Denmark)用1 g/ml的各自含有錯定蛋白的酶Cel48S-ct、 Cel9K-ac和Cel8A-bc包被，然后與0.1-1000 ng/1 的其匹配CBM-黏結蛋白（CBM-CohCt A2、 CBM-CoMc C3和CBM-Coh-Bc B3)對應物相互作用。兔抗-CBM (在封閉緩沖液中按1:3000稀 釋)被用作檢測相互作用的第一抗體。為分析嵌合體支架，Maxiso巧ELISA板用1 g/ml嵌合 體支架包被，然后與0.1-1000 ng^的匹配Xyn-Doc蛋白（其如在上文注明的Barak等，2005 中所述制備）相互作用。運些蛋白包含融合于適宜特異性的錯定蛋白模塊的來自嗜熱脂肪 上芽抱桿菌（Geobaci 1 Ius Stearothermophi Ius)的木聚糖酶T-6。兔抗-木聚糖酶T-6抗體 (在封閉緩沖液中按1:10，〇〇〇稀釋)被用作檢測相互作用的第一抗體。加入按1:10，〇〇〇稀釋 的山羊-皿P-標記的抗兔抗體的第二抗體制劑。相互作用使用TMB底物-色原體(Dako A/S， Glostrup, DK)檢測，反應通過添加1 M出S化終止。吸光度于450皿處測量。
[0186] 6.非-變性PAGE 將等摩爾濃度的支架蛋白和匹配酶(各蛋白4-8 yg)混合并加入到類似的體積的相互 作用緩沖液(含10 HiM CaCb和0.05%吐溫20的TBS)中。將DDW加入至最終體積30iil。使蛋白 于37°C解育2 hW允許復合物形成。加入非-變性樣品緩沖液(192 mM甘氨酸、25 ml Tris), 且使用Bio-Rad power pack 300,使總共15 yl/道經(jīng)受PAGE (7.5-9%丙締酷胺凝膠）。使用 單一組分(支架和酶)作為標記物。剩余的15 被用于在SDS-PAGE上分析。
[0187] 7.尺寸排阻高效液相色譜化PLC) 等摩爾蛋白濃縮物(450皮摩爾支架或酶)在300 的加樣緩沖液(Tris緩沖鹽水pH = 7.4 (TBS)，補充有2 ml化CI2)中稀釋。為形成設計者多纖維素酶體復合物，將等摩爾濃度 的支架和酶與類似體積的相互作用緩沖液(含10 ml CaCb和0.05%吐溫20的TBS)于37°C解 育2 h，并將加樣緩沖液加入至最終體積300 yl。使用AKTA快速高效液相色譜系統(tǒng)（GE Healthcare, Uppsula, Sweden)并Wo.5 ml 的流速的加樣緩沖液，將反應物注入分 析型Superdex 200皿10/30柱中。于280皿檢測洗脫的蛋白，濃縮各部分(0.5 ml)并使用 SDS-PAGE凝膠分析。
[0188] 8.富含纖維素(預處理)麥桿的準備 將麥桿切成碎片并磨碎，得到具有平均粒徑1-3 mm的粉末。于115°C，將生成的粉末樣 品（20 g)用85 ml 5% (v/v)硝酸處理1 h。酸-處理的生物質(zhì)用DDW洗涂并于100°C用150 ml 1.5% v/v NaOH進一步處理1 h，用孤W洗涂，得到富含纖維素的底物。
[0189] 9.麥桿底物化學組成的測定 樣品的化學組成根據(jù)W下改進的TAPPI-方法測定。對于半纖維素含量，使樣品與2% HCl -起沸騰2 h，用DDW和乙醇洗涂并于105°C干燥至恒定重量（約2-3 h)。對于纖維素含 量，使樣品與乙醇HN03溶液一起沸騰I h，用孤W和乙醇洗涂，并于105°C干燥至恒定重量(約 2-3 h)。對于木質(zhì)素含量，于室溫下，使樣品在72%此S化中溶脹2 h，用DDW稀釋至8-10%的 酸，用沸騰的稀出S化（8-10%)水解2 h，用孤W和乙醇洗涂，并于105°C干燥至恒定重量(約2-3 h)?？偣腆w含量通過于105°C干燥樣品2 h測定。
[0190] 10.活性分析 水解反應W總體積200 進行，并由反應緩沖液（100 ml乙酸鋼緩沖液抑5.5,24 mM CaCl2、4 mM EDTA)、0.5 yM的各個蛋白和2% w/v微晶纖維素（Sigma-Aldrich 化emical Co, St. Louis, Missouri)或3.5 gr/L預處理（富含纖維素）的麥桿組成。在添加底物之 前，于37°C使每個支架用等摩爾量的3種酶與類似體積的相互作用緩沖液(含10 mM化C12 和0.05%吐溫20的TBS)解育2 h。反應于50°C進行24-72 h (微晶纖維素)或3-24小時(預處 理的麥桿)并通過浸沒在冰水中終止。底物經(jīng)W最大速度(20,800 X g，10-15 min)離屯、沉 淀，并將100 上清液轉(zhuǎn)移至新的試管中。加入二硝基水楊酸(DNS, 150 yl)，并將樣品沸 騰10 min。于540 nm測量吸光度并根據(jù)葡萄糖校準曲線測定還原糖。各個測定法按一式S 份重復3次。
[0191] 實施例2 -由主要和銜接子支架多膚組成的人造多纖維素酶體復合物的構建和 測試 銜接子支架的構建 制備包含由27-35個氨基酸的接頭隔開的W下模塊的銜接子支架:3種用于整合酶的來 自解纖維素醋弧菌(上文所述的ScaC的第S黏結蛋白，稱為"A")、溶纖維素擬桿菌（上文所 述的ScaB的第S黏結蛋白，稱為"B")和熱纖梭菌（上文所述的CipA的第二黏結蛋白，稱為" T")的趨異黏結蛋白模塊；用于附著于主要支架的來自熱纖梭菌(C. thermocelum)(來自 01口4，化1?'〇1邸/5*133斗'〇1登錄號946453，稱為"0〇。411")的11型錯定蛋白模塊；和來自 熱纖梭菌的CBM (上文所述的CipA的CBM3a，稱為"CBM")。銜接子支架的氨基酸序列在SEQ ID NO: 31中提出。編碼銜接子支架的多核巧酸序列在SEQ ID NO: 32中提出。
[0192] 銜接子支架被設計為與W下巧巾酶相互作用： -具有來自解纖維素醋弧菌的錯定蛋白（ScaA的錯定蛋白）的Cel9A (T.化sea)(加工 性內(nèi)切葡聚糖酶）（稱為"a-9A") -具有來自溶纖維素擬桿菌的錯定蛋白的Cel48A (T.化sea)(外切葡聚糖酶）（稱 為"b-48A") -具有來自熱纖梭菌的錯定蛋白（熱纖梭菌木聚糖酶XynlOZ的錯定蛋白）的Cel5A (T. fusca)(內(nèi)切葡聚糖酶）（稱為"5A-t")。
[0193] 重組Cel48A和Cel5A的構建描述于等，2008, Journal of Biotechnology, 135: p. 351-357;和Caspi等，2009, Applied and Environmental Microbiology, 75: p. 7335-7342。重組Cel9A通過移除野生型酶C-末端的CBM2和在N-末端添加來自解纖維素 醋弧菌（來自ScaB)的錯定蛋白模塊來構建。His-標簽在序列的開始添加。蛋白使用常規(guī)的 儀珠純化方案純化。
[0194] a-9A的氨基酸序列在SEQ ID NO: 33中提出。錯定蛋白模塊對應于序列的殘基16-86。編碼a-9A的多核巧酸序列在SEQ ID NO: 34中提出。
[0195] b-48A的氨基酸序列在SEQ ID NO: 35中提出。錯定蛋白模塊對應于序列的殘基 18-88。編碼b-48A的多核巧酸序列在SEQ ID NO: 36中提出。
[0196] 5A-t的氨基酸序列在SEQ ID NO: 37中提出。錯定蛋白模塊對應于序列的殘基 313-376。編碼5A-t的多核巧酸序列在沈Q ID NO: 38中提出。
[0197] 進行描述于實施例1中的使用九(9)個來自庫的支架多膚的初步實驗，其包括選擇 的上文所述的黏結蛋白和CBM模塊的不同排列，W確定提供更好的整體纖維素分解活性的 模塊排列。經(jīng)檢查的9個支架示于表2。各個支架與上文所述的巧巾酶相互作用并測試對微晶 纖維素的活性。另外的試驗用包括來自熱纖梭菌(C. thermocellum)的錯定蛋白II型和來 自解纖維素醋弧菌、溶纖維素擬桿菌和熱纖梭菌的黏結蛋白I型，但缺乏CBM的銜接子支架 (稱為"Dockll-A-B-T")進行。運種支架經(jīng)由與含有融合于II型黏結蛋白的CBM的微小-支架 相互作用祀向底物，所述II型黏結蛋白與銜接子支架的II型錯定蛋白匹配。
[0198] 不同的銜接子-酶復合物的活性與游離酶的混合物和其中各個酶結合于黏結蛋 白-CBM微小-支架(匹配攜帶酶的錯定蛋白）的酶的混合物的活性比較。
[0199] 親2
在初步實驗后，選擇具有在SEQ ID NO: 31中提出的序列的銜接子支架用于進一步研 究。在運種銜接子支架中，模塊排列如下:CBM -黏結蛋白A-B-T - DockII (稱為"CBM-A-B-T-Dockll")。運種銜接子整合巧巾酶，W致Cel9A鄰近于位于支架一個末端的CBM，Cel48A在 中部，而Cel5A位于該支架蛋白的另一端，鄰近于II型錯定蛋白。
[0200] 關于微晶纖維素的活性分析顯示祀向和鄰近效應，導致與游離酶的混合物、結合 于匹配黏結蛋白-CBM微小-支架的酶的混合物、和結合于銜接子DockII-A-B-T (缺乏CBM) 的酶(其還結合于匹配黏結蛋白-CBM微小-支架)比較的改進的纖維素水解活性(圖3)。 [020。含有主要和銜接子支架的多酶復合物 制備主要支架，其能夠與上文描述的銜接子支架CBM-A-B-T-DockII相互作用。主要支 架被制備為含有可整合攜帶6個錯定蛋白的亞基的6個黏結蛋白模塊的六價支架。特別是， 六價支架被制備用于整合五(5)個碳水化合物活性酶和一個銜接子支架?？偠灾?，銜接子 和主要支架的復合物可整合八(8)個碳水化合物活性酶(5個在主要支架上和3個在銜接子 支架上）。
[020。主要六價支架: -支架: 支架從W下模塊制備： *來自解纖維梭菌的黏結蛋白（來自支架蛋白CipC的黏結蛋白I ,GenBank登錄號 U40345.3)(稱為"C")(沈Q ID NO: 39); *來自解纖維素醋弧菌的黏結蛋白（來自上文所述的支架蛋白C的黏結蛋白3)(稱為" A"); *來自熱纖梭菌的黏結蛋白（來自上文所述的多纖維素酶體的支架亞基CipA的黏結蛋 白3)(稱為"T"); *來自閃爍古生球菌的黏結蛋白（黏結蛋白2375, GenBank登錄號AE001112.1)(稱為" G")(沈Q ID NO: 40); *來自黃色瘤胃球菌(Ruminococcus化ve化ciens)的黏結蛋白（來自株17的支架蛋白B 的黏結蛋白！,GenBank登錄號AJ278969.4)(稱為"F") (SEQ ID NO: 41); *來自OlpB的熱纖梭菌的黏結蛋白II型(NCBI參照序列：YP_001039467 YP001039467 或UniProtKB登錄號Q06852)(稱為"Cohn")(沈Q ID NO: 42); * CBM (熱纖梭菌，上文所述的CipA的CBM3a)(稱為"CBM")。
[0203] 主要支架的氨基酸序列在SEQ ID NO: 43中提出。編碼主要支架的多核巧酸序列 在沈Q ID NO: 44中提出。在運種主要支架中，模塊排列如下:CohII-C-A-CBM -T -G- F。
[0204] -產(chǎn)； * Xyn43A (木聚糖酶）（T.化sea) +來自解纖維梭菌的錯定蛋白（來自支架蛋白A的 錯定蛋白）（稱為"Xyn43A-c") * XynllA (木聚糖酶）（T.化sea) +來自解纖維素醋弧菌的錯定蛋白（上文所述的 ScaB的錯定蛋白模塊）（稱為"XynllA-a") * XynlOB (木聚糖酶）（T.化sea) +來自熱纖梭菌的錯定蛋白（上文所述的Cel48S 的錯定蛋白）（稱為"XynlOB-t") * Cel6A (內(nèi)切葡聚糖酶）（T.化sea) +來自閃爍古生球菌的錯定蛋白2375 (稱為" 6A-g") * XynlOA (木聚糖酶）（T.化sea) +來自黃色瘤胃球菌的錯定蛋白（來自ScaA的錯 定蛋白）（稱為"XynlOA-f")。
[0205] Xyn43A-c、XynllA-a、XynlOB-t和XynlOA-f 的構建描述于Morais, S.等，2012， MBio, 3(6)中。重組6A-g通過用來自細菌閃爍古生球菌的錯定蛋白（蛋白源：2375)替代野 生型酶的CBM2而獲得。His-標簽被加入到該序列的末端。蛋白使用常規(guī)儀珠純化方案純化。
[0206] Xyn43A-c的氨基酸序列在SEQ ID NO: 45中提出。錯定蛋白模塊對應于該序列的 殘基564-623。編碼Xyn43A-c的多核巧酸序列在沈Q ID NO: 46中提出。
[0207] XynllA-a的氨基酸序列在SEQ ID NO: 47中提出。錯定蛋白模塊對應于該序列的 殘基329-399。編碼XynllA-a的多核巧酸序列在沈Q ID NO: 48中提出。
[0208] XynlOB-t的氨基酸序列在SEQ ID NO: 49中提出。錯定蛋白模塊對應于該序列的 殘基397-460。編碼XynlOB-t的多核巧酸序列在沈Q ID NO: 50中提出。
[0209] 6A-g的氨基酸序列在SEQ ID NO: 51中提出。編碼6A-g的多核巧酸序列在SEQ ID NO: 52中提出。
[0210] XynlOA-f的氨基酸序列在SEQ ID NO: 53中提出。錯定蛋白模塊對應于該序列的 殘基368-444。編碼XynlOA-f的多核巧酸序列在沈Q ID NO: 54中提出。
[0211] 銜接子S價支架(上文描述的CBM-A-B-T-DockII): -支架： *來自熱纖梭菌的II型錯定蛋白模塊； *來自解纖維素醋弧菌、溶纖維素擬桿菌、熱纖梭菌的黏結蛋白模塊； * CBM (熱纖梭菌，CipA的CBM3a); -酶： * Cel9A +來自解纖維素醋弧菌（A. Cellulolyticus)的錯定蛋白 * Cel48A +來自溶纖維素擬桿菌(B .cellulosolvens)的錯定蛋白 * Cel5A +來自熱纖梭菌的錯定蛋白 生成的多酶復合物的示意圖示于圖4。
[0212] 銜接子支架附著于主要支架的貢獻通過使用廣泛種類的對照得到證實，所述對照 清楚地顯示，兩個支架之間的接近對于復合物纖維素底物的最佳降解確實是重要的。
[0213]圖5提出不同的嵌合體酶促合劑的麥桿降解能力，運種能力作為于50°C溫育48小 時后釋放的還原糖的量來測量。試驗程序如在Morais等，2012, MBio., 3(6): e00508-12 中所述。酶濃度0.3 iiM (各個）。
[0214] 測試W下組合： -6個重組酶結合于六價支架的復合物:Xyn43-c、Xyn 11 A-a、Xyn 1 OB-t、Xyn 1 OA-f、6A-g 和b-48a (圖5的欄1)。
[0215] -游離的8種重組酶的混合物:Xyn43-c、XynllA-a、XynlOB-t、XynlOA-f、6A-g、b-48a、a-9A和5A-t (圖5的欄2)。
[0216] - 8種重組酶與匹配微小-支架的復合物，即由碳水化合物結合模塊(CBM)和單一 黏結蛋白模塊(匹配相互作用的酶的錯定蛋白模塊)組成的支架多膚(圖5的欄3)。
[0217] - 6個重組酶Xyn43-c、XynllA-a、XynlOB-t、XynlOA-f、6A-g和b-48a結合于六價支 架的復合物，和各自結合于含有匹配黏結蛋白的微小-支架的a-9A和5A-t的復合物的混合 物(圖5的欄4)。
[021 引-6個重組酶Xyn43-c、XynllA-a、XynlOB-t、XynlOA-f、6A-g和b-48a結合于六價支 架的復合物，和a-9A和5A-t結合于含有匹配a-9A和5A-t的錯定蛋白模塊的兩個黏結蛋白模 塊的二價支架的復合物的混合物(圖5的欄5)。
[0219] - 5個重組酶乂71143-。心711114-日^711108-1、64-旨和乂711104寸結合于六價支架 CohII-C-A-CBM-T-G-F的復合物(其含有一個與銜接子支架整合的黏結蛋白，因而僅整合5 個酶促亞基），和3個重組酶a-9A、b-48a和5A-9結合于S價支架的復合物(所述支架含有匹 配巧中酶的錯定蛋白模塊的黏結蛋白模塊)的混合物(圖5的欄6)。
[0220] -主要和銜接子支架與它們的結合酶的復合物:結合于主要支架蛋白CohII-C-A-CBM-T-G-F 的 5 個重組酶 Xyn43-c、Xynl lA-a、Xyn 1 OB-t、6A-g 和 Xyn lOA-f，和結合于銜接子支 架CBM-A-B-T-Dockn 的 3個重組酶a-9A、b-48a和5A-9 (圖 5 的欄7)。
[0221] -游離野生型酶乂71143心711114^711108心711104、〔6164、〔61484、〔6194和〔615八的 混合物（圖5的欄8)。
[0222] 通過比較欄4和6與欄7,有可能觀察到主要支架和銜接子支架之間的相互作用的 重要性。整合兩個支架導致與非-結合的主要和銜接子支架(各自具有其酶）的混合物比較 的顯著增加(大約2-倍增加）的活性。與單價支架-酶復合物(微小支架)混合的六價支架-酶 復合物比較，活性也得到提高。
[0223] 還在0葡糖巧酶(來自T. fusca的BglC)的存在或不存在下，在與熱纖梭菌的提取 的天然多纖維素酶體的比較中，評價了設計者多纖維素酶體復合物的效力。如在Morais等， 2012, MBio (上文所述的）中所述測試麥桿降解。于50°C進行溫育。
[0224] 結果概述于圖6。含有附接于主要支架蛋白的銜接子支架與總共8個嵌合體酶的設 計者多纖維素酶體顯示與天然多纖維素酶體比較的有利的降解動力學:雖然熱纖梭菌多纖 維素酶體的活性似乎在48小時后達到飽和，設計者多纖維素酶體甚至在72小時后保持其線 性增加。
[0225] 除了改進動力學外，進一步的分析顯示，與迄今已知的設計者多纖維素酶體，例 如，在Morais等，2012, MBio.(上文指出的）中描述的設計者多纖維素酶體比較，具有本 文描述的結合銜接子-主要支架的設計者多纖維素酶體顯示出改進的降解能力。在Morais 等中描述的設計者多纖維素酶體由六價支架與總共6個嵌合體酶Xyn43-c、XynllA-a、 XynlOB-t、XynlOA-f、g-5A和b-48a組成。當運種六價設計者多纖維素酶體與熱纖梭菌的天 然多纖維素酶體比較時，它僅顯示天然多纖維素酶體的約40%的活性，而本文描述的設計者 多纖維素酶體顯示天然多纖維素酶體的大約70%的活性(與在0-葡糖巧酶的存在下，在溫育 72小時后的麥桿降解比較）。
[0226] 因此，前面描述的具體實施方案充分地掲示了本發(fā)明的一般本質(zhì)，其他人應用當 前的知識，可W容易地修飾和/或修改運樣的具體實施方案的各種應用，而不進行過度的實 驗和不背離一般概念，因此，運樣的修改和修飾應該和意欲包括在所公開的實施方案的等 價物的意義和范圍內(nèi)。要理解本文采用的措辭或術語是為了描述而不是限制的目的。用于 進行各種公開的功能的工具、材料和步驟可采取各種可供選擇的形式而不背離本發(fā)明。
【主權項】
1. 一種人造纖維素分解的多酶復合物，其包含： (i) 第一支架多肽，其包含多個被包含5-50個氨基酸的接頭隔開的黏結蛋白模塊，至 少兩個所述黏結蛋白模塊具有對錨定蛋白模塊的不同結合特異性;和錨定蛋白模塊； (ii) 第二支架多肽，其包含多個被包含5-50個氨基酸的接頭隔開的黏結蛋白模塊，至 少兩個所述黏結蛋白模塊具有對錨定蛋白模塊的不同結合特異性，其中至少一個黏結蛋白 模塊具有對第一支架多肽的錨定蛋白的結合特異性;和 (i i i)多個碳水化合物活性酶，每個碳水化合物活性酶包含具有對第一支架、第二支 架或兩者的黏結蛋白的結合特異性的錨定蛋白模塊， 其中第一和第二支架經(jīng)由第一支架的錨定蛋白和具有對所述錨定蛋白的結合特異性 的第二支架的黏結蛋白結合， 其中所述多個碳水化合物活性酶經(jīng)由具有相互結合特異性的錨定蛋白-黏結蛋白模 塊，結合于第一和第二支架多肽，和 其中第一支架、第二支架或兩者還包含碳水化合物結合模塊(CBM)。2. 權利要求1的多酶復合物，其中第一和第二支架多肽的每一個包含3-10個黏結蛋白 豐旲塊。3. 權利要求2的多酶復合物，其中第一和第二支架多肽的每一個包含3-6個黏結蛋白模 塊。4. 權利要求1的多酶復合物，其中黏結蛋白模塊源自一種或多種產(chǎn)生多纖維素酶體的 微生物。5. 權利要求4的多酶復合物，其中產(chǎn)生多纖維素酶體的微生物選自熱纖梭菌 (Clostridium thermocellum)、解纖維素醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)、黃色瘤 胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、溶纖維素擬桿菌(Bacteroides cellulosolvens)、 閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)和解纖維梭菌（Clostridium cellulolyticum) 〇6. 權利要求1的多酶復合物，其中黏結蛋白模塊源自一種或多種無-多纖維素酶體的微 生物。7. 權利要求1的多酶復合物，其中錨定蛋白模塊源自一種或多種產(chǎn)生多纖維素酶體的 微生物。8. 權利要求7的多酶復合物，其中產(chǎn)生多纖維素酶體的微生物選自熱纖梭菌（C. thermocellum)、解纖維素醋弧菌（A. cellulolyticus)、黃色瘤胃球菌（R. flavefaciens)、溶纖維素擬桿菌(B. cellulosolvens)、閃爍古生球菌(A. fulgidus)和解 纖維梭菌(C. cellulolyticum)。9. 權利要求1的多酶復合物，其中錨定蛋白模塊源自一種或多種無-多纖維素酶體的微 生物。10. 權利要求1的多酶復合物，其中第一和第二支架多肽均包含CBM。11. 權利要求1的多酶復合物，其中所述接頭包含5-40個氨基酸。12. 權利要求1的多酶復合物，其中所述接頭包含15-35個氨基酸。13. 權利要求1的多酶復合物，其中多個碳水化合物活性酶包含糖苷水解酶、多糖裂解 酶、糖酯酶或其組合。14. 權利要求13的多酶復合物，其中糖苷水解酶選自纖維素酶、木聚糖酶、β-葡糖苷酶 及其組合。15. 權利要求1的多酶復合物，其中碳水化合物-活性酶是細菌酶。16. 權利要求15的多酶復合物，其包含來自T. fusca、熱纖梭菌(C. thermocellum)或 兩者的碳水化合物-活性酶。17. 權利要求1的多酶復合物，其還包含一個或多個支架多肽，其中多個碳水化合物結 合酶與其結合，所述多個碳水化合物結合酶結合于第一支架、第二支架或兩者。18. -種降解纖維素物質(zhì)的組合物，其包含權利要求1的多酶復合物。19. 一種降解纖維素物質(zhì)的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含權利要求1的多酶復合物。20. -種降解纖維素物質(zhì)的方法，該方法包括使所述纖維素物質(zhì)暴露于權利要求1的多 酶復合物。
【文檔編號】C12N9/42GK105874064SQ201480054636
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年8月3日
【發(fā)明人】E.A.巴耶, Y.瓦扎納, Y.巴拉克, J.斯特恩, H.吉拉里, S.莫拉伊斯
【申請人】耶達研究及發(fā)展有限公司