促血管發(fā)生的肽和肽綴合物的制作方法
【專利摘要】提供了源自內(nèi)皮分化基因3(EDG3)的7次跨膜受體的第2個環(huán)的短的生物活性序列，以及包含滲透性增強(qiáng)部分的肽綴合物，所述短的生物活性序列可用于刺激血管發(fā)生。還提供了包含所述肽的藥物組合物，以及在其中發(fā)生血液供應(yīng)不足或與內(nèi)皮功能異常相關(guān)的狀況中的使用方法，所述狀況諸如外周血管疾病、冠狀動脈疾病、腦血管疾病、糖尿病和延遲的傷口愈合、肺病、眼病以及與嚴(yán)重感染相關(guān)的病理狀況。
【專利說明】促血管發(fā)生的化和化綴合物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及源自內(nèi)皮分化基因 3化DG3)的7次跨膜受體的第2個環(huán)的短的生物活性 膚，W及包含滲透性增強(qiáng)部分的膚綴合物，所述短的生物活性膚可用于刺激血管發(fā)生和血 管完整性。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 人類基因組中最大的受體家族之一是7次跨膜受體（7l:ransmembrane receptor; 7-TMR)超家族，也被稱為G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，計約2000種蛋白。G蛋白偶聯(lián)受體調(diào)節(jié)許多 重要的生理過程。至少40%的已經(jīng)開發(fā)的處方藥具有與運(yùn)些受體相關(guān)的作用。運(yùn)些藥物的 大多數(shù)通過干擾在細(xì)胞外發(fā)生的與受體結(jié)合的配體起作用。
[0004] 在科學(xué)界存在持續(xù)的努力，W定義阻斷受體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)伴侶G蛋白之間的細(xì)胞 內(nèi)相互作用的化合物。
[0005] 已知7TMR受體的第二個細(xì)胞內(nèi)的環(huán)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，因?yàn)樵搮^(qū)域中的 突變引起7TMR相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的擾亂。例如，曾試圖（Benovic等化.J.Clin.Pharmac.，30:3s-12s，1990)通過施用相應(yīng)于該受體的第二個完整的環(huán)的膚來干擾把腎上腺素受體信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)。但是，運(yùn)些結(jié)果非常不令人滿意。
[0006] 血管發(fā)生是重要的天然過程，其發(fā)生在胚胎發(fā)生期間W及成人健康身體的傷口愈 合的過程中，并且導(dǎo)致血液恢復(fù)流回到受傷的組織中。在女性中，血管發(fā)生還發(fā)生在每月的 生殖周期期間W逐漸形成子宮內(nèi)膜并且在排卵期間支持卵母細(xì)胞的成熟；W及發(fā)生在妊娠 期，當(dāng)胎盤形成時，建立母體和胎兒間的循環(huán)的過程中。健康的身體通過血管發(fā)生刺激生長 因子和血管發(fā)生抑制物的相互作用來控制血管發(fā)生，并且兩者之間的平衡決定血管發(fā)生被 刺激還是被抑制。
[0007] 在若干治療領(lǐng)域中，對控制血管發(fā)生存在增長的興趣。在一方面，目標(biāo)是控制或減 少在疾病諸如癌癥、糖尿病性失明、年齡相關(guān)的黃斑變性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癖W及另 外的狀況中發(fā)生的過量的和病理性血管發(fā)生。在運(yùn)些病理狀況中，新的血管供給患病組織 例如腫瘤組織，為其提供必需的氧氣和營養(yǎng)物，從而使其能夠病理性生長。在一些情況中， 病理性血管發(fā)生多次破壞正常組織。此外，例如在腫瘤組織中形成的新的血管，使腫瘤細(xì)胞 能夠逃逸到循環(huán)系統(tǒng)中并且轉(zhuǎn)移到其他器官。通常，當(dāng)患病的細(xì)胞產(chǎn)生異常量的血管發(fā)生 生長因子、壓倒存在于身體中的天然血管發(fā)生抑制物的作用時，發(fā)生過量的血管發(fā)生。
[000引現(xiàn)今開發(fā)的抗血管發(fā)生療法目的在于通過祀向并中和促進(jìn)新的血管形成的任何 刺激物來預(yù)防新的血管生長。
[0009]調(diào)節(jié)血管發(fā)生的另一個目標(biāo)是刺激在其中發(fā)生血液供應(yīng)不足，導(dǎo)致組織缺血的狀 況中的新血管形成的產(chǎn)生。通常，運(yùn)些狀況是諸如冠狀動脈疾病、外周動脈疾病、中風(fēng)和延 遲的傷口愈合(例如在潰瘍性病變中）的疾病。在運(yùn)些狀況中，當(dāng)充足的血管生長和循環(huán)未 被適當(dāng)?shù)鼗謴?fù)時，由于血液流動不足，存在組織死亡的風(fēng)險。通常，當(dāng)組織不產(chǎn)生充足量的 血管發(fā)生生長因子時，發(fā)生血液供應(yīng)不足，并且治療性血管發(fā)生目的在于通過使用生長因 子或它們的模擬物刺激新血管的生長。
[0010] 血管發(fā)生促進(jìn)療法的主要目標(biāo)是通過誘導(dǎo)身體建立新的側(cè)支血管，產(chǎn)生生物旁 路-即物理地繞開患病的或堵塞的動脈。
[0011] 已經(jīng)顯示1-憐酸銷氨醇（SlP)是血清中主要的促血管發(fā)生因子化nglish等， Cardiovasc Resovasc Res.2001 ;49:588-599) eSlP在血小板活化后從其釋放，并且有助于 傷口愈合過程。其產(chǎn)生由銷氨醇激酶催化，而降解經(jīng)由裂解產(chǎn)生棟桐醒和憐酸乙醇胺或通 過去憐酸化。SlP通過引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移W及毛細(xì)管形態(tài)發(fā)生，并穩(wěn)定新形成的內(nèi) 皮毛細(xì)管(通過增強(qiáng)細(xì)胞-細(xì)胞接觸和招募平滑肌細(xì)胞），而在血管發(fā)生反應(yīng)中作為關(guān)鍵要 素。SlP還能夠與內(nèi)皮分化基因化DG)G-蛋白偶聯(lián)受體家族的成員（即，也被稱為SlPl的 EDG1，也被稱為S1P3的邸G3,也被稱為肥18、AGR16或S1P2的邸G5,也被稱為S1P4的邸G6和也 被稱為S1P5的EDG8)結(jié)合，W引起生物響應(yīng)。運(yùn)些受體經(jīng)由6(1)、6(9)、6(12/13)和1^〇與多 效應(yīng)器系統(tǒng)區(qū)別地偶聯(lián)，所述多效應(yīng)器系統(tǒng)包括腺巧酸環(huán)化酶、憐脂酶C和憐脂酶D、細(xì)胞外 信號調(diào)節(jié)激酶、C-Jun N末端激酶、p38絲裂原活化蛋白激酶和非受體酪氨酸激酶。運(yùn)些信號 傳導(dǎo)途徑與轉(zhuǎn)錄因子活化、細(xì)胞骨架蛋白、粘附分子表達(dá)、半脫天冬酶活性等相關(guān)聯(lián)。因此， 1-憐酸銷氨醇能夠經(jīng)由受體依賴性機(jī)制影響多種生物響應(yīng)，包括有絲分裂發(fā)生、分化、遷移 和細(xì)胞調(diào)亡。另外，已提出SlP發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)作用，例如在Ca(2+)移動中發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)作用。近 期，顯示化elIer等2014化1:ure Communications ,5,5215)SlP通過S1P3信號傳導(dǎo)在成人中 的骨形成中發(fā)揮重要作用。
[0012] 顯示7次跨膜受體S1P3(也被稱為抓G3)的第2個環(huán)參與血管發(fā)生。Licht等2003 (Blood, 102,2099-2107)表明促血管發(fā)生信號傳導(dǎo)W及與已知的血管發(fā)生因子的協(xié)同作用 被具有源自抓G3的第2個環(huán)的C末端（殘基143-151)的序列肉豆違基-Gly-Met-Arg-Pro-Ty;r-Asp-Ala-Asn-Lys-Arg(SEQ ID NO: 1)的9氨基酸膚誘導(dǎo)。在該出版物中未公開更短的 序列。
[0013] WO 01/81408和其US對應(yīng)申請US 6,864,229公開了源自某些G-蛋白偶聯(lián)受體(蛋 白酶激活受體1 (PAR 1)、PAR2、PAR4、CCKB、CCKA、SSTR2和MC4)的第S個細(xì)胞內(nèi)環(huán)的膚和膚綴 合物。運(yùn)些文件未提供源自G-蛋白偶聯(lián)受體的第二個環(huán)的膚的序列和/或活性，運(yùn)些文件也 未公開或暗示源自S1P3/EDG3G-蛋白偶聯(lián)受體的膚或綴合物。
[0014] WO 2004/022576提出了源自7次跨膜受體抓G3的第2個環(huán)的至少5個氨基酸的膚和 類似物，所述膚和類似物可用于刺激血管發(fā)生。公開的膚包含天然序列的至少6個氨基酸或 者是運(yùn)些膚的類似物，例如源自天然抓G3序列的序列Met-Arg-Pr〇-Tyr-Asp-Ala(SEQ ID ^:3)的化合物^6-4'旨斗'〇-了7'-4311-41曰(569 10^:2)。由于長的膚序列的影響活性和 選擇性的柔性構(gòu)象，并且它們包含膚酶的多個裂解位點(diǎn)，因此長的膚序列不是作為治療劑 的最理想的。
[0015] 設(shè)及人類前列腺相關(guān)絲氨酸蛋白酶（prostate-associated serine protease; PRASP)的US 6，075，136描述了用于測量PRASP活性的測定，所述測定測量作為膜凝乳蛋白 酶樣絲氨酸蛋白酶(包括PSA)的通用底物的合成膚甲基-0-班巧酷-Arg-Pro-Tyr-NH-P-硝 基苯胺的水解（Qiristensson,A.等 1990,Eur .J.Biochem. 194:755-763)。
[0016] 因此，對提供更適合作為用于在其中發(fā)生血液供應(yīng)不足的狀況中刺激血管發(fā)生的 藥物候選物的改進(jìn)的膚存在未滿足的需求。
[0017] 發(fā)明概述
[0018]本發(fā)明首次提供了可用于刺激血管生長和用于改進(jìn)內(nèi)皮功能異常、特別是與過量 滲漏相關(guān)的內(nèi)皮功能異常的情況的短的合成膚和膚綴合物。所提供的膚為作為用于治療其 中血管生長是期望的血管素亂諸如外周血管疾病、屯、肌缺血、外周動脈疾病、組織移植和糖 尿病，W及用于通過1-憐酸銷氨醇(SlP)受體介導(dǎo)的其他素亂和狀況的治療劑的候選物。 [00 19]現(xiàn)在公開了與內(nèi)皮分化基因3化DG3)的7次跨膜受體的細(xì)胞內(nèi)的第2個環(huán)的序列共 有僅3個氨基酸同源性的新型膚，所述新型膚有效刺激血管發(fā)生，并且在刺激血管發(fā)生中與 其他血管發(fā)生刺激物協(xié)同地發(fā)揮作用。
[0020]根據(jù)一方面，本發(fā)明提供了一種3-10個氨基酸的膚，所述膚包含核屯、序列RPY，其 中R是精氨酸殘基或修飾的精氨酸殘基，P是脯氨酸殘基或修飾的脯氨酸殘基，Y是酪氨酸殘 基或修飾的酪氨酸殘基，其中所述膚共有與具有序列Met-Arg-Pr〇-Tyr-Asp(SEQ ID N0:4) 的內(nèi)皮分化基因受體3化DG3)的相應(yīng)殘基143-147的那些氨基酸相同的不超過3個氨基酸。 [0021 ]根據(jù)一些實(shí)施方案，所述膚由3-9個氨基酸組成。
[0022] 根據(jù)又其他實(shí)施方案，所述膚由4-8個氨基酸組成。
[0023] 根據(jù)一些特定的實(shí)施方案，所述膚由4、5或6個氨基酸組成。每個可能性代表本發(fā) 明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0024] 根據(jù)一個實(shí)施方案，所述膚能夠促進(jìn)血管的生長。根據(jù)特定的實(shí)施方案，所述膚能 夠刺激血管發(fā)生。根據(jù)另一個實(shí)施方案，所述膚能夠改善內(nèi)皮功能，特別是減少功能異常的 內(nèi)皮的滲漏。
[0025] 根據(jù)一個實(shí)施方案，所述膚還包含經(jīng)由直接的鍵或經(jīng)由接頭與所述膚共價地連接 的滲透性增強(qiáng)部分(permeability-enhancing moiety)，W形成膚綴合物。根據(jù)本發(fā)明的滲 透性增強(qiáng)部分可與活性膚的任何游離基團(tuán)連接。
[00%]根據(jù)一些實(shí)施方案，所述接頭由1-5個氨基酸殘基組成。
[0027] 根據(jù)一些特定的實(shí)施方案，所述接頭由甘氨酸殘基組成。
[0028] 根據(jù)一些特定的實(shí)施方案，所述滲透性部分是脂肪酸并且所述接頭是甘氨酸殘 基。
[0029] 根據(jù)另一些實(shí)施方案，所述RPY序列選自由W下組成的組：
[0030] Arg-Pro-Tyr；
[0031] Arg-Pr〇-35(HTyr;
[0032] hArg-Pro-Tyr；
[0033] Mrg-Pr〇-35dITyr 和
[0034] hArg-4Hyp-Tyr；
[0035] 其中hArg是高精氨酸，35dITyr是3，5-二艦酪氨酸并且4Hyp是4?基脯氨酸。每個 可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0036] 根據(jù)其他實(shí)施方案，本發(fā)明提供了按照式I的膚綴合物：
[0037] Z-X-R-P-Y-B (式I)
[0038] 其中Z表示經(jīng)由直接的鍵或經(jīng)由接頭共價地連接的能夠增加滲透性的部分，X表示 除了甲硫氨酸之外的天然的或合成的氨基酸殘基，或X可不存在，R是精氨酸殘基或修飾的R 殘基，P是脯氨酸殘基或修飾的脯氨酸殘基，Y是酪氨酸殘基或修飾的酪氨酸殘基，并且B表 示末端簇酸基、酷胺基、醋基或醇基。
[0039] 根據(jù)一些實(shí)施方案，膚綴合物中的膚選自由W下組成的組：
[0040] Gly-Arg-Pr〇-Tyr-B(SEQ ID NO.5)；
[0041] Gly-Nle-Arg-Pr〇-Tyr-B(SEQ ID NO.6)；
[0042] Gly-Nle-Arg-Pr〇-35(HTyr-B(SEQ ID N0.7);
[0043] Gly-Nle-hArg-Pr〇-Tyr-B(SEQ ID NO.8)；
[0044] 617-饑6-114巧斗的-35(1口7尸8(569 10備.9);和
[0045] Gly-Nle-Mrg-4HyP-Tyr(沈Q ID NO.IO)。
[0046] 每個可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0047] 根據(jù)一些實(shí)施方案，所述接頭由1-5個氨基酸殘基組成。
[004引根據(jù)一些特定的實(shí)施方案，X是正亮氨酸(Nle)殘基。
[00例修飾的精氨酸殘基的非限制性實(shí)例是:高精氨酸化ArgKN-甲基精氨酸(醒eArg)、 瓜氨酸、2-氨基-3-脈基丙酸、N-亞氨基乙基A-鳥氨酸、N CO -單甲基A-精氨酸、N CO -硝基-心精氨酸、D-精氨酸、2-氨基-3-脈基丙酸、N O，O -二甲基-心精氨酸、N O -硝基-D-精氨酸。 每個可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0050] 修飾的脯氨酸殘基的非限制性實(shí)例是：高脯氨酸化omop;roline，hP;ro)、（4-徑基） Pro(4HyP)、（3-^基)Pro(3HyP)、丫-芐基-脯氨酸、丫-(2-氣-芐基)-脯氨酸、丫-(3-氣-節(jié) 基)-脯氨酸、丫-(4-氣-芐基)-脯氨酸、丫-(2-氯-芐基)-脯氨酸、丫-(3-氯-芐基)-脯氨酸、 丫-(4-氯-芐基)-脯氨酸、丫-(2-漠-芐基)-脯氨酸、丫-(3-漠-芐基)-脯氨酸、丫-(4-漠-節(jié) 基)-脯氨酸、丫 -(2-甲基-芐基)-脯氨酸、丫 -(3-甲基-芐基)-脯氨酸、丫 -(4-甲基-芐基)-脯氨酸、丫-(2-硝基-芐基)-脯氨酸、丫-(3-硝基-芐基)-脯氨酸、丫-(4-硝基-芐基)-脯氨 酸、丫-(1-糞甲基)-脯氨酸、丫-(2-糞甲基)-脯氨酸、丫-(2,4-二氯-芐基)-脯氨酸、丫-(3， 4-二氯-芐基)-脯氨酸、丫-(3,4-二氣-芐基)-脯氨酸、丫-(2-;氣-甲基-芐基)-脯氨酸、 丫-(3-立氣-甲基-芐基)-脯氨酸、丫-(4-立氣-甲基-芐基)-脯氨酸、丫-(2-氯基-芐基)-脯 氨酸、丫 -(3-氯基-芐基)-脯氨酸、丫 -(4-氯基-芐基)-脯氨酸、丫 -(2-艦-芐基)-脯氨酸、 丫-(3-艦-芐基)-脯氨酸、丫-(4-艦-芐基)-脯氨酸、丫-(3-苯基-締丙基-芐基)-脯氨酸、 丫-(3-苯基-丙基-芐基)-脯氨酸、丫-(4-叔-下基-芐基)-脯氨酸、丫-二苯甲基-脯氨酸、 丫-(4-聯(lián)苯-甲基)-脯氨酸、丫-(4-嚷挫基-甲基)-脯氨酸、丫-(3-苯并嚷吩基-甲基)-脯氨 酸、丫-(2-嚷吩基-甲基)-脯氨酸、丫-(3-嚷吩基-甲基)-脯氨酸、丫-(2-巧喃基-甲基)-脯 氨酸、丫-(2-化晚基-甲基)-脯氨酸、丫-(3-化晚基-甲基)-脯氨酸、丫-(4-化晚基-甲基)-脯氨酸、丫-締丙基-脯氨酸、丫-丙烘基-脯氨酸、O-修飾的脯氨酸殘基、贓晚酸、氮雜環(huán)下 燒-3-簇酸。每個可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0051] 修飾的酪氨酸殘基的非限制性實(shí)例是:3,5-二艦酪氨酸(35dITyr)、3,5-二漠酪氨 酸(35地Tyr )、高酪氨酸、D-酪氨酸、3-氨基-心酪氨酸、3-氨基-D-酪氨酸、3-艦-心酪氨酸、 3-艦-D-酪氨酸、3-甲氧基-心酪氨酸、3-甲氧基-D-酪氨酸a-甲狀腺素、D-甲狀腺素、心甲 狀腺原氨酸、D-甲狀腺原氨酸、0-甲基-心酪氨酸、0-甲基-D-酪氨酸、D-甲狀腺原氨酸、0-乙 基-心酪氨酸、0-乙基-D-酪氨酸、3，5，3 ' -S艦-1^-甲狀腺原氨酸、3，5，3 ' -S艦-D-甲狀腺原 氨酸、3，5-二艦-1^-甲狀腺原氨酸、3，5-二艦-D-甲狀腺原氨酸、D-間-酪氨酸、k間-酪氨酸、 D-鄰-酪氨酸、1^-鄰-酪氨酸、苯丙氨酸、取代的苯丙氨酸、N-硝基苯丙氨酸、P-硝基苯丙氨 酸。每個可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0052] 根據(jù)特定的實(shí)施方案，Z是豆違酷-甘氨酸(Myr-Gly)，X是正亮氨酸(Nle)，R選自由 精氨酸殘基、高精氨酸殘基化ArgKNa-甲基精氨酸殘基(NMeArg)、瓜氨酸殘基、2-氨基-3-脈基丙酸殘基組成的組;P是脯氨酸殘基或4徑基脯氨酸殘基(4HyP)，并且Y選自由酪氨酸殘 基、3,5二艦酪氨酸殘基(35d口yr)、3,5二漠酪氨酸殘基(35地Tyr)和高酪氨酸殘基組成的 組。每個可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0053] 根據(jù)一些實(shí)施方案，膚綴合物選自由W下組成的組：
[0054] Myr-Gly-Arg-Pro-Tyr-WH沈Q ID NO: 11);
[0055] Myr-Gly-Nle-Arg-Pro-Tyr-WH沈Q ID NO: 12);
[0056] Myr-Gly-Nle-Arg-Pr〇-35(HTyr-NH2(沈Q ID N0:13);
[0化7] Myr-Gly-Nle-Mrg-Pro-Tyr-NHs(沈Q ID NO: 14);
[0化引 ]?7尸617-饑6-114巧斗的-35(1口7尸畑2(沈9 10側(cè)：15);和
[0059] Myr-Gly-Nle-Mrg-4HyP-Tyr(沈Q ID N0:16)。
[0060] 每個可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0061] 根據(jù)特定的實(shí)施方案，提供了由通過任選的接頭與包含核屯、序列RPY的序列共價 地連接的細(xì)胞滲透性增強(qiáng)部分組成的促血管發(fā)生膚綴合物，其中R是精氨酸殘基或修飾的 精氨酸殘基，P是脯氨酸殘基或修飾的脯氨酸殘基，Y是酪氨酸殘基或修飾的酪氨酸殘基，其 中所述膚共有與邸G3的相應(yīng)殘基143-147的那些氨基酸相同的不超過3個氨基酸。
[0062] 之前公開的源自抓G3的膚的長度為至少6個氨基酸，并且包含與天然抓G3序列相 同或同源的至少5個殘基。已知最短的膚是具有序列Nle-Arg-P:r〇-Ty:r-Asn-Ala(SEQ ID NO: 2)的膚R002L106，它包含在其6個位置中的4個中的與天然邸G3序列Met-Arg-Pro-Tyr-Asp-Ala(SEQ ID N0:3)的那些殘基相同的殘基(加下劃線的），W及為存在于天然序列中的 殘基的保守取代的殘基(天冬酷胺代替天冬氨酸，斜體）。本發(fā)明的抓G3來源的序列更短，并 且包含與天然序列相同或同源的不超過3個連續(xù)殘基?，F(xiàn)在出乎意料地發(fā)現(xiàn)，負(fù)責(zé)血管生成 活性的核屯、序列是Arg-Pro-Tyr序列，并且比之前已知的膚更短的根據(jù)本發(fā)明的膚比較長 的序列更具活性，所述較長的序列與其所源自的天然序列具有更高的同源性。
[0063] 根據(jù)特定的實(shí)施方案，提供了包含核屯、序列RPY的膚綴合物，其中R是精氨酸殘基 或修飾的精氨酸殘基，P是脯氨酸殘基或修飾的脯氨酸殘基，Y是酪氨酸殘基或修飾的酪氨 酸殘基，所述膚綴合物還包含通過任選的接頭與膚偶聯(lián)的滲透性增強(qiáng)部分。
[0064] 根據(jù)一些實(shí)施方案，活性膚被綴合到S膚Asp-Arg-Tyr、或其同源序列。
[0065] 根據(jù)一些實(shí)施方案，膚的氨基末端被修飾，例如其可被酷化。根據(jù)另外的實(shí)施方 案，簇基末端被修飾，例如其可被酷化、酷胺化、還原或醋化。
[0066] 明確的理解的是，之前已知的膚被排除在本發(fā)明之外。
[0067] 本文中所公開的膚的環(huán)狀形式也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[006引本領(lǐng)域已知的主動地或被動地促進(jìn)化合物進(jìn)入細(xì)胞或增強(qiáng)化合物進(jìn)入細(xì)胞的滲 透性的任何部分可被用于與根據(jù)本發(fā)明的膚核屯、綴合。非限制性實(shí)例包括:疏水性部分，諸 如脂肪酸、類固醇和大的芳香族或脂肪族化合物;可具有細(xì)胞膜受體或載體的部分，諸如類 固醇、維生素和糖類、天然的和非天然的氨基酸W及轉(zhuǎn)運(yùn)體膚。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，疏水 性部分是脂質(zhì)部分或氨基酸部分。
[0069]滲透性增強(qiáng)部分可與膚部分中的任何位置、優(yōu)選地與膚部分的氨基末端直接地或 通過間隔物或接頭連接。
[0070] 本發(fā)明的又另一個目標(biāo)是提供促進(jìn)血管和刺激血管發(fā)生的膚和綴合物，包括具有 另外提高的穩(wěn)定性和細(xì)胞滲透性特性的擬膚化合物。此類化合物的非限制性實(shí)例包括:選 擇的膚殘基的N-烷基化;選擇的膚殘基的側(cè)鏈修飾;非天然氨基酸;將氨基甲酸醋、脈、橫酷 胺和阱用于膚鍵替換；W及通過膚鍵或非膚鍵并入非膚部分，所述非膚部分包括但不限于 贓晚、贓嗦和化咯燒。根據(jù)本發(fā)明的擬膚中的氨基酸殘基之間的經(jīng)修飾的鍵可選自由W下 組成的組:酷胺鍵、脈鍵、氨基甲酸醋鍵、阱鍵或橫酷胺鍵。除非另有明確說明，否則氨基酸 殘基之間的鍵全部是酷胺鍵。
[0071] 根據(jù)一些實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的膚或膚綴合物包含至少一個非天然編碼的氨基 酸殘基。
[0072] 根據(jù)一些特定的實(shí)施方案，至少一個非天然的氨基酸殘基選自由W下組成的組： 正亮氨酸(Nle)、修飾的精氨酸(Arg)、修飾的脯氨酸(Pro)和修飾的酪氨酸(Tyr)。
[0073] 根據(jù)一些實(shí)施方案，核屯、序列RPY的至少一個殘基是非天然編碼的氨基酸殘基或 修飾的殘基。
[0074] 根據(jù)其他實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的膚綴合物包含至少一個非天然的滲透性增強(qiáng)部 分。
[0075] 在另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分 的至少一種W上定義的膚或膚綴合物，所述藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀 釋劑或載體。
[0076] 根據(jù)一些實(shí)施方案，RPY序列選自由W下列組成的組：
[0077] Arg-Pro-Tyr；
[007引 Arg-Pr0-35(HTyr;
[00 巧]Mrg-Pro-Tyr;
[0080] Mrg-Pr〇-35dITyr;和
[0081] hArg-4Hyp-Tyr〇
[0082] 根據(jù)其他實(shí)施方案，所述藥物組合物包含選自由W下組成的膚：
[0083] Gly-Arg-Pro-Tyr-WH沈Q ID NO.5);
[0084] Gly-Nle-Arg-Pro-Tyr-NHs(沈Q ID NO.6);
[00化]Gly-Nle-Arg-Pr〇-35(HTyr-NH2(沈Q ID N0.7);
[0086] Gly-Nle-Mrg-Pro-Tyr-WH沈Q ID NO.8);
[0087] 617-饑6-114巧斗的-35(1口7尸畑2(沈9 10側(cè).9);和
[0088] Gly-Nle-Mrg-4HyP-Tyr(沈Q ID N0.10)。
[0089] 每個可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0090] 根據(jù)一個實(shí)施方案，藥物組合物中包含的膚包含:經(jīng)由直接的鍵或經(jīng)由接頭與所 述膚共價地連接W形成膚綴合物的滲透性增強(qiáng)部分，藥學(xué)上可接受的載體。
[0091] 根據(jù)特定的實(shí)施方案，所述滲透性增強(qiáng)部分是脂肪酸并且所述接頭是一段1-12個 氨基酸殘基。
[0092] 根據(jù)一些特定的實(shí)施方案，所述接頭由甘氨酸殘基組成。
[0093] 根據(jù)另一個實(shí)施方案，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含按照式I的膚 綴合物：
[0094] Z-X-R-P-Y-B (式I)
[00M]其中Z表示經(jīng)由直接的鍵或經(jīng)由接頭共價地連接的能夠增加滲透性的部分，X表示 除了甲硫氨酸之外的天然的或合成的氨基酸殘基，或X可不存在，R是精氨酸殘基或修飾的R 殘基，P是脯氨酸殘基或修飾的脯氨酸殘基，Y是酪氨酸殘基或修飾的酪氨酸殘基，并且B表 示末端簇酸基、酷胺基、醋基或醇基。
[0096] 根據(jù)特定的實(shí)施方案，X是正亮氨酸殘基。
[0097] 根據(jù)特定的實(shí)施方案，Z是豆違酷-甘氨酸(Myr-Gly)、X是正亮氨酸(Nle)、R選自由 精氨酸殘基、高精氨酸殘基化ArgKN-甲基精氨酸殘基(醒eArg)、瓜氨酸殘基、2-氨基-3-脈 基丙酸殘基組成的組;P是脯氨酸殘基或4徑基脯氨酸殘基(4Hyp)，并且Y選自由W下組成的 組:酪氨酸殘基、3,5二艦酪氨酸殘基(35d口yr)、3,5二漠酪氨酸殘基(35地Tyr)和高酪氨酸 殘基。
[0098] 根據(jù)一些實(shí)施方案，藥物組合物中的膚綴合物選自由W下組成的組：
[0099] Myr-Gly-Arg-Pro-Tyr-WH沈Q ID NO. 11);
[0100] Myr-Gly-Nle-Arg-Pr〇-Tyr-NH2(沈Q ID N0.12);
[0101] Myr-Gly-Nle-Arg-Pr〇-35(HTyr-NH2(沈Q ID N0.13);
[0102] Myr-Gly-Nle-Mrg-Pro-Tyr-NHs(沈Q ID NO. 14);
[0103] ]?7尸617-饑6-114巧斗的-35(1口7尸畑2(沈9 10側(cè).15);和
[0104] Myr-Gly-Nle-Mrg-4HyP-Tyr(沈Q ID N0.16)。
[0105] 每個可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0106] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的藥物組合物包含旨在提高穩(wěn)定性、溶解度、滲透性， 或提供至少一種活性成分的特定、延長或調(diào)節(jié)(modified)釋放的藥學(xué)上可接受的載體。
[0107] 根據(jù)一些實(shí)施方案，所述載體適合于通過吸入施用。
[0108] 根據(jù)一些實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的用于通過吸入施用的制劑選自由脂質(zhì)體制劑、 干粉制劑、懸液制劑、溶液制劑、計量劑量吸入器制劑和霧化器制劑組成的組。
[0109] 根據(jù)一些實(shí)施方案，用于吸入的制劑包含W下的至少一種：表面活性劑、推進(jìn)劑 (propel Iant)和共溶劑。
[0110] 根據(jù)一些特定的實(shí)施方案，吸入制劑包含至少一種表面活性劑。
[0111] 根據(jù)一些特定的實(shí)施方案，吸入制劑包含納米顆粒。
[0112] 根據(jù)一些實(shí)施方案，用于吸入的制劑包含直徑小于化m的顆粒，W到達(dá)支氣管區(qū) 域。
[0113] 根據(jù)一些特定的實(shí)施方案，干粉制劑包含乳糖。
[0114] 根據(jù)其他實(shí)施方案，提供了調(diào)節(jié)釋放(modified-release)的藥物組合物，所述調(diào) 節(jié)釋放的藥物組合物包含根據(jù)本發(fā)明的膚和至少一種載體。
[0115] 根據(jù)一些實(shí)施方案，調(diào)節(jié)釋放的藥物組合物為選自由W下組成的組的形式:可生 物降解的微球、非可生物降解的微球、任何合適的幾何形狀的植入物、可植入的棒、可植入 的膠囊、可植入的環(huán)、或延長釋放的凝膠或易受侵蝕的基質(zhì)。
[0116] 藥物組合物可單獨(dú)地施用或與諸如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因 子(FG巧和干細(xì)胞因子(SC巧的其他血管發(fā)生刺激物一起施用。
[0117] 本發(fā)明的藥物組合物可用于治療其中發(fā)生血液供應(yīng)不足的狀況，或其中一種病因 或表現(xiàn)是功能異常的內(nèi)皮、特別是特征為過量滲漏的內(nèi)皮，或其中設(shè)及通過SlP受體的信號 傳導(dǎo)的疾病和/或病理狀況，諸如成人中的骨形成。
[0118] 根據(jù)本發(fā)明，源自內(nèi)皮分化基因受體3化DG3)的第2個環(huán)的至少一種膚或膚綴合物 被用于制備用于預(yù)防或治療其中發(fā)生血液供應(yīng)不足的狀況，其中一種病因或表現(xiàn)是功能異 常的內(nèi)皮、特別是特征為過量滲漏的內(nèi)皮的病理狀況，或其中設(shè)及SlP的狀況(諸如成人中 的骨形成）的治療性藥物，所述膚或膚綴合物包含核屯、序列RPY，其中R是精氨酸殘基或修飾 的精氨酸殘基，P是脯氨酸殘基或修飾的脯氨酸殘基，Y是酪氨酸殘基或修飾的酪氨酸殘基， 其中所述膚不包含與在邸G3的所述第2個環(huán)的相同位置處存在的殘基相同的另外的殘基。
[0119] 根據(jù)本發(fā)明，源自內(nèi)皮分化基因受體3化DG3)的第2個環(huán)的至少一種膚或膚綴合物 被用于預(yù)防或治療其中發(fā)生血液供應(yīng)不足的疾病或狀況，或其中設(shè)及SlP信號傳導(dǎo)的狀況， 所述膚或膚綴合物包含核屯、序列RPY，其中R是精氨酸殘基或修飾的精氨酸殘基，P是脯氨酸 殘基或修飾的脯氨酸殘基，Y是酪氨酸殘基或修飾的酪氨酸殘基，其中所述膚不包含與在 邸G3的所述第2個環(huán)的相同位置處存在的殘基相同的另外的殘基。特別地，根據(jù)本發(fā)明的膚 和膚綴合物可用于促進(jìn)血管生長或內(nèi)皮功能改善。
[0120] 根據(jù)特定的實(shí)施方案，疾病或狀況由功能異常的內(nèi)皮導(dǎo)致（resulted)或引起 (caused)。
[0121] 根據(jù)其他實(shí)施方案，狀況包括骨質(zhì)流失。根據(jù)一些特定的實(shí)施方案，狀況是骨質(zhì)疏 松癥。
[0122] 根據(jù)一些特定的實(shí)施方案，疾病或狀況選自由W下組成的組:外周血管疾病;缺血 性疾病，包括但不限于屯、肌缺血;組織移植;冠狀動脈疾??；中風(fēng);延遲的傷口愈合;肺病，包 括急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和通氣誘發(fā)的肺損傷(VILI);眼病，包括 年齡相關(guān)的黃斑病變(AMD); W及與嚴(yán)重感染相關(guān)的病理狀況，諸如例如脈毒癥。每個可能 性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0123] 根據(jù)一些實(shí)施方案，提供了根據(jù)本發(fā)明的膚或膚綴合物用于預(yù)防或治療脈毒性休 克（septic shock)。
[0124] 根據(jù)其他實(shí)施方案，疾病或狀況的特征在于膜腺e細(xì)胞功能不足。
[0125] 根據(jù)又另一個實(shí)施方案，待預(yù)防、改善或治療的疾病或狀況是糖尿病或膜島移植。
[0126] 根據(jù)某種具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的藥物組合物W藥物洗脫支架提供，所述藥物 洗脫支架用于預(yù)防或治療屯、肌缺血或冠狀動脈疾病。每個可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施 方案。
[0127] 本發(fā)明還設(shè)及一種用于預(yù)防或治療其中發(fā)生血液供應(yīng)不足的狀況、其中內(nèi)皮功能 惡化的狀況、或其中狀況通過SlP受體信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的狀況的方法，所述方法包括向需要其 的受試者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。
[0128] 根據(jù)特定的實(shí)施方案，其中發(fā)生血液供應(yīng)不足或其中內(nèi)皮功能惡化的疾病或狀況 選自由W下組成的組:外周血管疾病；屯、肌缺血;組織移植;冠狀動脈疾?。恢酗L(fēng);糖尿病;膜 島移植；W及延遲的傷口愈合;肺病，包括急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和 通氣誘發(fā)的肺損傷(VILI);眼病，包括年齡相關(guān)的黃斑病變(AMD); W及與嚴(yán)重感染相關(guān)的 病理狀況，諸如例如脈毒癥。每個可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0129] 根據(jù)一些實(shí)施方案，通過SlP受體介導(dǎo)的狀況包括骨質(zhì)流失。根據(jù)一些特定的實(shí)施 方案，所述狀況是骨質(zhì)疏松癥。
[0130] 根據(jù)一些實(shí)施方案，提供了一種預(yù)防或治療脈毒性休克的方法，所述方法包括向 需要其的受試者施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。
[0131] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種包含根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的支架。
[0132] 還提供了一種包含根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的支架，所述支架用于預(yù)防或治療屯、 肌缺血或冠狀動脈疾病。
[0133] 本發(fā)明還包括預(yù)防或治療屯、肌缺血或冠狀動脈疾病的方法，所述方法包括向需要 其的受試者施用根據(jù)本發(fā)明的支架。
[0134] 本發(fā)明的另外的實(shí)施方案和適用的完整范圍根據(jù)下文給出的詳述將變得明顯。但 是，應(yīng)當(dāng)理解的是，詳述和具體的實(shí)施例盡管表明本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，但僅W示例性 的方式給出，因?yàn)樵诒景l(fā)明的精神和范圍內(nèi)的多種變化和修改根據(jù)該詳述對本領(lǐng)域技術(shù)人 員將變得明顯。
[0135] 附圖簡述
[0136] 圖1A-1C顯示了如由主動脈環(huán)毛細(xì)管長度確定的，在主動脈環(huán)測定中毛細(xì)管形成 被沈Q ID N0:13(圖1A)、14(圖1B)和12(圖1C)的膚誘發(fā)。
[0137] 圖2A-2C顯示了如通過主動脈環(huán)毛細(xì)管寬度確定的，在主動脈環(huán)測定中毛細(xì)管形 成被沈Q ID N0:13(圖1A)、14(圖1B)和12(圖1C)的膚誘發(fā)。
[0138] 圖3顯示了在小鼠中的缺血腿模型中，SEQ ID NO: 9的化合物與SEQ ID NO: 1的化 合物對灌注(LDI)的影響。
[0139] 圖4展示了在主動脈環(huán)測定中，SEQ ID NO: 13和14的膚與VEGF的協(xié)同作用。
[0140] 圖5示出了表明在脈毒性休克模型中膚SEQ ID NO: 12(GPS-725.017)挽救小鼠免 于死亡的能力的體內(nèi)結(jié)果。用媒介物或2〇111旨/蛇的6?5-725.017(56〇10^:12)-天一次對 C57化小鼠（每組15只）皮下(S.C.)注射，持續(xù)5天。
[0141] 發(fā)明詳述
[0142] 由于在有機(jī)化學(xué)和分子生物學(xué)上的重大進(jìn)展，現(xiàn)在能夠W足夠用于藥物和臨床使 用的量制備許多生物活性膚。因此在最近幾年，已經(jīng)建立了用于治療和診斷疾患的新方法， 其中已設(shè)及膚。但是，將膚用作治療劑和診斷劑被W下因素限制:a)組織滲透;b)在胃腸道 中W及在血清中趨向蛋白質(zhì)水解的低的代謝穩(wěn)定性;C) 口服攝取后差的吸收，特別是由于 其相對高的分子量或缺少特定的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或二者;d)通過肝臟和腎臟的快速排泄；W及e) 在非祀器官系統(tǒng)中的不期望的副作用，因?yàn)槟w受體可在生物體中廣泛分布。本發(fā)明提供了 運(yùn)樣的生物活性膚:a)由于其小的尺寸和任選的滲透性部分而具有改進(jìn)的組織滲透性;b) 由于封閉的末端并且并入非天然的氨基酸而具有改進(jìn)的代謝穩(wěn)定性;C)由于其低的分子量 和任選的滲透性部分而具有改進(jìn)的吸收;d)由于其低的分子量和短的序列而較容易且較便 宜地被生產(chǎn)；并且e)預(yù)期對它們所源自的抓G3受體是選擇性的，并且因此預(yù)期具有較少的 副作用。
[0143] 如在表1中呈現(xiàn)的，之前公開的源自抓G3的膚長度為至少6個氨基酸并且包含與天 然邸G3序列相同或同源的至少5個殘基。已知最短的膚是膚R002L106(725-106，SEQ ID NO: 2)，它包含在其6個位置中的4個中的與天然序列的那些殘基相同的殘基，W及為存在于天 然序列中的殘基的保守取代的殘基(天冬酷胺代替天冬氨酸）。本發(fā)明的一些源自抓G3的序 列長度為僅4個氨基酸，并且包含在不超過=個位置處與天然序列相同或同源的殘基。出乎 意料的是運(yùn)些短了至少30%的序列比較長的序列更具活性，所述較長的序列與其源自的天 然序列具有更高的同源性。
[0144] 表1.
[0145]
[C
[0147] Nle是正亮氨酸殘基，hArg表示高精氨酸殘基，4HyP表示4-徑基脯氨酸殘基，且 35(HTyr表示3，5-二艦酪氨酸殘基。
[0148] 根據(jù)本發(fā)明的特定的實(shí)施方案，在表1的B部分中展示的新序列作為本申請中公開 的新型分子的基礎(chǔ)，所述新型分子還包含通過任選的間隔物與膚、優(yōu)選地與膚的N末端偶聯(lián) 的細(xì)胞滲透性部分。
[0149] 不希望被束縛于理論，本發(fā)明的膚通過引發(fā)Gi-依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)同時抑制G12/13 信號傳導(dǎo)來模擬S1P3化DG3)的天然配體1-憐酸銷氨醇（SlP)的作用，所述膚包含與抓G3受 體共有僅3個氨基酸的序列同源性的序列。猜測G-蛋白抑制物百日咳毒素抑制由本發(fā)明的 膚誘發(fā)的血管發(fā)生。
[0150] 現(xiàn)在通過離體(從包埋在膠原基質(zhì)中的小鼠主動脈環(huán)中使血管出芽)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn) (小鼠缺血后肢測定）顯示，根據(jù)本發(fā)明的膚誘發(fā)多層和成熟的血管(multi-layered and mature vessel)的形成。該結(jié)果表明，與在相同的條件下單獨(dú)測試的VEGF相比，運(yùn)些膚與內(nèi) 源蛋白血管發(fā)生因子(如VEGF)協(xié)同作用并且刺激成熟且穩(wěn)定的血管的形成。由于在缺血區(qū) 域蛋白血管發(fā)生因子如VEGF的水平增加，施用本發(fā)明的膚作為單一療法將通過與局部分泌 的內(nèi)源因子協(xié)同作用而在原位產(chǎn)生期望的血管發(fā)生效應(yīng)。
[0151] 另外，現(xiàn)在顯示根據(jù)本發(fā)明的膚在體內(nèi)預(yù)防血管滲漏。結(jié)果表明，運(yùn)些膚增強(qiáng)血管 完整性并且抑制大分子逃逸到間質(zhì)液。
[0152] 優(yōu)選地，使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)合成技術(shù)，例如通過化學(xué)合成技術(shù)包括擬膚方法 學(xué)合成本發(fā)明的膚。運(yùn)些方法包括專用固相合成、部分固相合成方法、片段縮合、經(jīng)典溶液 合成（classical solution synthesis)。固相膚合成程序是本領(lǐng)域中眾所周知的，并由 John Morrow Stewart和Janis Dillaha Young,Solid Phase Peptide Syntheses(第2片反， Pierce化emical Company ,1984)進(jìn)一步描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過使用自動化膚合成 儀利用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)法例如t-Boc化學(xué)法或Fmoc化學(xué)法合成本發(fā)明的任何膚。合成的膚可通過 制備型高效液相色譜法（Creighton T.1983P;roteins，structures and molecular principles.WH Freeman and Co.N.Y.)來純化，并且其組成可經(jīng)由氨基酸測序來確認(rèn)。本 發(fā)明的一些膚(其僅包含天然的、即遺傳編碼的氨基酸)還可利用本領(lǐng)域已知的重組DNA技 術(shù)來制備。膚和滲透性部分的綴合可利用本領(lǐng)域已知的任何方法，通過固相化學(xué)法或液相 化學(xué)法來進(jìn)行。本發(fā)明的一些優(yōu)選的化合物可利用液相合成方法來方便地制備。本領(lǐng)域已 知的用于制備化合物如本發(fā)明的那些化合物的其他方法可被使用并且被包括在本發(fā)明的 范圍內(nèi)。
[0153] 本文公開的膚的環(huán)狀形式也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。膚的環(huán)化可通過本領(lǐng)域已知的任 何方法進(jìn)行，例如通過存在于膚序列中的游離氨基和簇基，或者通過添加的用于環(huán)化的氨 基酸或部分進(jìn)行。環(huán)化類型的非限制性實(shí)例是:側(cè)鏈與側(cè)鏈環(huán)化、C與N末端環(huán)化、側(cè)鏈與末 端環(huán)化、W及如在例如WO 95/33765中描述的并入至少一個護(hù)-O-取代的氨基酸殘基的任 何類型的主鏈環(huán)化。
[0154] 本發(fā)明的綴合物的滲透性增強(qiáng)部分可與膚部分中的任何位置直接地或通過間隔 物連接。根據(jù)特定的實(shí)施方案，細(xì)胞滲透性部分被連接到膚部分的氨基末端。任選的連接間 隔物可具有不同的長度和構(gòu)象，包括任何合適的化學(xué)成分，包括但不限于胺、酷胺、氨基甲 酸醋、硫酸、氧酸、橫酷胺鍵等。此類間隔物的非限制性實(shí)例包括氨基酸、諷酷胺衍生物、氨 基硫醇衍生物和氨基醇衍生物。
[01巧]定義
[0156] 為了方便和清晰，本說明書、實(shí)施例和權(quán)利要求中采用的某些術(shù)語在本文中被描 述。
[0157] 如本文所用的術(shù)語"膚"意指包含天然的（遺傳編碼的）、非天然的和/或化學(xué)修飾 的氨基酸殘基，每個殘基的特征為具有通過膚鍵或非膚鍵彼此連接的氨基末端和簇基末 端。如本領(lǐng)域通常已知的，貫穿本說明書和權(quán)利要求書中的氨基酸W-個或=個字母代碼 來表示。盡管將領(lǐng)會到在其中環(huán)化不嚴(yán)重干擾膚特征的情況中，膚的環(huán)狀形式也可被使用， 本發(fā)明的膚優(yōu)選地W線狀形式被使用。
[0158] 本發(fā)明中使用的氨基酸是市售可得的或通過常規(guī)合成方法可得的那些氨基酸。某 些殘基可能需要特定的方法用于并入膚中，且膚序列的連續(xù)、發(fā)散(divergent)或收斂式 (convergent)合成方法可用于本發(fā)明中。天然編碼的氨基酸和其衍生物根據(jù)IUPAC慣例由 =字母代碼表示。在沒有說明時，可使用L異構(gòu)體或D異構(gòu)體。
[0159] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的氨基酸的保守取代在本發(fā)明的范圍內(nèi)。保守的氨基酸取 代包括將一個氨基酸替換為另一個具有相同類型的官能團(tuán)或側(cè)鏈例如脂肪族、芳香族、帶 正電荷、帶負(fù)電荷的氨基酸。運(yùn)些取代可增強(qiáng)口服生物利用度、對祀蛋白的親和力、代謝穩(wěn) 定性、滲透到中樞神經(jīng)系統(tǒng)、祀向特定細(xì)胞群體等。技術(shù)人員將認(rèn)識到，對膚、多膚或蛋白序 列的改變、添加或缺失編碼的序列中的單個氨基酸或小百分比的氨基酸的各個取代、缺失 或添加是"保守地修飾的變體"，其中改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸取代。提供功 能上相似的氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域熟知的。
[0160] W下六組的每組包含是彼此的保守取代的氨基酸：
[0161] 1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);
[0162] 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸化）；
[0163] 3)天冬酷胺(N)、谷氨酷胺(Q);
[0164] 4)精氨酸(R)、賴氨酸化）；
[0165] 5)異亮氨酸(I)、亮氨酸化)、甲硫氨酸(M)、鄉(xiāng)氨酸(V);和
[0166] 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
[0167] 本發(fā)明的膚的鹽、膚的類似物和化學(xué)衍生物也被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0168] 如本文所用的術(shù)語"鹽"指膚分子的簇基的鹽W及氨基或脈基的酸加成鹽。簇基的 鹽可通過本領(lǐng)域已知的方法形成，且包括:無機(jī)鹽，例如鋼鹽、巧鹽、錠鹽、鐵鹽或鋒鹽等;和 與有機(jī)堿形成的鹽，諸如，例如與胺諸如=乙醇胺、贓晚、普魯卡因等形成的鹽。酸加成鹽包 括例如與礦物酸形成的鹽，所述礦物酸諸如例如乙酸或草酸。本文描述的鹽還包括添加到 膚溶液W增強(qiáng)水凝膠形成和/或巧礦物質(zhì)的礦化的離子組分。
[0169] 本文所用的"化學(xué)衍生物"指包含通常不是膚分子的一部分的一個或更多個化學(xué) 部分的膚，所述化學(xué)部分諸如游離簇基的醋和酷胺、游離氨基的酷基和烷基衍生物、游離徑 基的憐酸醋和酸。此類修飾可通過使祀向的膚的氨基酸殘基與能夠與選擇的側(cè)鏈或末端殘 基反應(yīng)的有機(jī)衍生劑反應(yīng)而被引入到分子中。優(yōu)選的化學(xué)衍生物包括已被憐酸化、C-末端 酷胺化或N-末端乙酷化的膚。
[0170] 如本文中所用的本發(fā)明的膚的"功能衍生物"涵蓋了可通過本領(lǐng)域已知的方法從 在殘基上作為側(cè)鏈存在的官能團(tuán)或者N-或C-末端基團(tuán)制備的的衍生物，并且只要所述衍生 物保持藥學(xué)上可接受的，即，它們不會破壞膚的活性、不賦予包含它的組合物毒性特性且不 會不利地影響其抗原特性，則它們被包括在本發(fā)明中。例如，運(yùn)些衍生物可包括簇基的脂肪 族醋、通過與錠或與伯胺或仲胺反應(yīng)產(chǎn)生的簇基的酷胺、通過與酷基部分（例如，燒酷基 (a化anoyl)或碳環(huán)芳酷基)反應(yīng)形成的氨基酸殘基的游離氨基的N-酷基衍生物或通過與酷 基部分反應(yīng)形成的游離徑基(例如絲氨酷或蘇氨酷殘基的徑基)的0-酷基衍生物。
[0171] 術(shù)語"膚類似物"表示除了一個或更多個氨基酸改變或酷胺鍵的一個或更多個修 飾/替換之外具有根據(jù)本發(fā)明的氨基酸序列的分子。膚類似物包括天然或非天然氨基酸殘 基的氨基酸取代和/或添加，W及在自然界中不存在的化學(xué)修飾。膚類似物包括膚模擬物。 膚模擬物或"擬膚"意指根據(jù)本發(fā)明的膚W其包含至少一個非編碼殘基或非膚鍵的方式被 修飾。此類修飾包括:例如，一個或更多個殘基的烷基化和更具體的甲基化，使非天然氨基 酸插入或替換天然氨基酸，用其他共價鍵替換酷胺鍵。根據(jù)本發(fā)明的擬膚可任選地包含為 酷胺替換鍵的至少一個鍵，所述酷胺替換鍵諸如脈鍵、氨基甲酸醋鍵、橫酷胺鍵、阱鍵或任 何其他共價鍵。合適的"類似物"的設(shè)計可由計算機(jī)輔助。根據(jù)本發(fā)明的另外的膚類似物包 含呈相反順序的特定膚或膚類似物序列，即，氨基酸在膚序列中W與在天然蛋白中或在被 鑒定為有活性的特定的膚或類似物中呈現(xiàn)的氨基酸順序相反的順序偶聯(lián)。不論是完全或部 分非膚，根據(jù)本發(fā)明的擬膚提供與所述擬膚基于的膚中的基團(tuán)的=維布置十分相似的化學(xué) 部分的空間布置。由于該相似的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，擬膚對生物系統(tǒng)具有與膚的生物活性相似 的作用。
[0172] 修飾的氨基酸殘基是其中任何基團(tuán)或鍵通過缺失、添加或用不同的基團(tuán)或鍵替換 而被修飾的氨基酸殘基，只要氨基酸殘基的功能被保留，或如果功能改變(例如用取代的苯 丙氨酸替換酪氨酸），只要該修飾不損害包含該修飾的殘基的膚的活性即可。
[0173] 根據(jù)本發(fā)明的"膚綴合物"表示包含膚或非膚的另一個部分與其直接地或經(jīng)由接 頭共價鍵合的血管促進(jìn)膚的序列的分子。
[0174] 術(shù)語"接頭"表示其目的是共價地連接細(xì)胞滲透性部分和膚或擬膚的化學(xué)部分，任 何類型的直接的化學(xué)鍵或間隔物。間隔物可被用于允許滲透性增強(qiáng)部分和膚之間的距離。
[0175] "滲透性"指劑或物質(zhì)滲透、彌散或擴(kuò)散通過障礙物、膜、或皮層的能力。"細(xì)胞滲透 性"或"細(xì)胞滲透"部分指在本領(lǐng)域中已知的能夠促進(jìn)或增強(qiáng)分子滲透通過膜的任何分子。 非限制性實(shí)例包括:疏水性部分，諸如脂質(zhì)、脂肪酸、類固醇和大的芳香族或脂肪族化合物； 可具有細(xì)胞膜受體或載體的部分，諸如類固醇、維生素和糖類、天然的和非天然的氨基酸、 轉(zhuǎn)運(yùn)體膚、納米顆粒W及脂質(zhì)體。
[0176] 根據(jù)本發(fā)明的疏水性部分可優(yōu)選地包括脂質(zhì)部分或氨基酸部分。根據(jù)特定的實(shí)施 方案，疏水性部分選自由W下組成的組:憐脂、類固醇、銷氨醇、神經(jīng)酷胺、辛基-甘氨酸、2-環(huán)己基丙氨酸、苯甲酯苯丙氨酸、丙酷基(C3)、下酷基(C4)、戊酷基(C5)、己酷基(C6)、庚酷基 化7)、辛酷基化8)、壬酷基化9)、癸酷基((：1〇)、^^一酷基(Cn)、月桂酷基(Ci2)、十S酷基(Ci3)、 豆違酷基(Ci4)、十五酷基(Ci5)、棟桐酷基(Ci6)、地化noyl((C曲)4)、十屯酷基(Ci7)、硬脂酷 基（〔18)、十九酷基（〔19)、花生酷基（日^證1(1〇71)(〔2日）、116]116(303日]1〇71(〔21)、二十二酷基 (C22) Urucisanoyl(C23)、和二十四酷基（lignoce;r〇5d)(C24);其中所述疏水性部分通過酷 胺鍵、琉基、胺、醇、酪基或碳-碳鍵附接到所述嵌合多膚。
[0177] 根據(jù)本發(fā)明可使用的脂質(zhì)部分的其他實(shí)例：Lipof ectamine、Transf ectace、 Transfectam、Cytofectin、DMRIE、DLRIE、GAP-DLRIE、DOTAP、DOPE、DMEAP、DODMP、DOPC、 DDAB、DOSPA、抓LPC、抓 MPC、DPH、TMADPH、CTAB、賴氨酷-PE、DC-Cho、-丙氨酷膽固醇；DCGS、 DPPE S、DCPE、DMAP、DMPE、DOGS、DOHME、DPEPC、普朗尼克（P1 ur on i C )、Twe en、服IJ、縮醒憐脂、 憐脂酷乙醇胺、憐脂酷膽堿、甘油-3-乙基憐脂酷膽堿、二甲基錠丙烷、=甲基錠丙烷、二乙 基錠丙烷、=乙基錠丙烷、二甲基雙十八烷基漠化錠、銷脂、銷憐脂、溶血脂質(zhì)（lysolipid)、 糖脂、硫巧脂、銷糖脂、膽固醇、膽固醇醋、膽固醇鹽、油、N-班巧酷二油酷憐脂酷乙醇胺、1， 2-二油酷-Sn-甘油、1，3-二棟桐酷-2-班巧酷甘油、1，2-二棟桐酷-sn-3-班巧酷甘油、1-十 六烷基-2-棟桐酷甘油憐脂酷乙醇胺、棟桐酷高半脫氨酸、N，N'-雙(十二烷基氨基幾基亞甲 基)-N，N'-雙（（-N，N，N-ミ甲基錠乙基-氨基幾基亞甲基）乙二胺四艦化物、N，N"-雙(十六燒 基氨基幾基亞甲基)-N，N'，N"-S((-N，N，N-S甲基錠-乙基氨基幾基亞甲基二乙締 S胺六 艦化物;N，N'-雙什二烷基氨基幾基亞甲基)-N，N"-雙（（-N，N，N-S甲基錠乙基氨基幾基亞 甲基)亞環(huán)己基-1,4-二胺四艦化物；1，7,7-四-((-N，N，N，N-四甲基錠乙基氨基-幾基亞甲 基)-3-十六烷基氨基幾基-亞甲基-1，3，7-S氮雜庚燒屯艦化物;N，N，N'，N'-四（（-N，N，N-S甲基錠-乙基氨基幾基亞甲基)-N'-(l，2-二油酷基丙S基-3-憐酸乙醇氨基幾基亞甲基） 二乙締基=胺四艦化物;二油酷基憐脂酷乙醇胺、脂肪酸、溶血脂質(zhì)、憐脂酷膽堿、憐脂酷乙 醇胺、憐脂酷絲氨酸、憐脂酷甘油、憐脂酷肌醇、銷脂、糖脂（glycol ip id)、糖脂 (glucolipid)、硫巧脂、銷糖脂、憐脂酸、棟桐酸、硬脂酸、花生四締酸、油酸、具有聚合物的 脂質(zhì)、具有橫化的糖類的脂質(zhì)、膽固醇、生育酪半班巧酸醋、具有酸連接的脂肪酸的脂質(zhì)、具 有醋連接的脂肪酸的脂質(zhì)、聚合的脂質(zhì)、二乙酷基憐酸醋、硬脂胺、屯、憐脂、具有長度為6-8 個碳原子的脂肪酸的憐脂、具有不對稱酷基鏈的憐脂、6-(5-膽醬締-3b-基氧基)-1-硫代-b-D-化喃半乳糖巧、雙半乳糖基二甘油醋、6-(5-膽醬締-3b-基氧基）己基-6-氨基-6-脫氧- 1- 硫代-b-D-化喃半乳糖巧、6-(5-膽醬締-3b-基氧基）己基-6-氨基-6-脫氧-1-硫代-a-D-化喃甘露糖巧、12-(( (7'-二乙基氨基-香豆素-3-基）幾基）甲基氨基）-十八燒酸;N-[12-(((7'-二乙基氨基香豆素-3-基)幾基）甲基-氨基）十八酷基]-2-氨基棟桐酸;膽醬醇基） 4'-;甲基-錠基燈酸醋;N-班巧酷基二油酷基-憐脂酷乙醇胺；1,2-二油酷基-Sn-甘油；1， 2- 二棟桐酷基-sn-3-班巧酷基-甘油；1,3-二棟桐酷基-2-班巧酷基甘油、1-十六烷基-2-棟 桐酷基丙=基-憐酸乙醇胺、和棟桐酷高半脫氨酸。
[017引術(shù)語"血管生長"指"血管發(fā)生"的過程和"動脈發(fā)生(aderiogenesis)"的過程二 者。
[0179] 術(shù)語"血管發(fā)生"（有時也被稱為"新血管形成"）是用來表示在正常和病理狀況兩 者中新血管的生長的一般術(shù)語。
[0180] 術(shù)語"生理上可接受的載體"或"稀釋劑"或"賦形劑"指良好地適用于藥物制品的 水性或非水性流體。此外，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑"指至少一種載體或賦形劑 并且包括載體和或賦形劑的混合物。術(shù)語"治療劑(therapeutic)"指可被用于治療(包括預(yù) 防、診斷、緩解或治愈)患者中的病癥(malady)、疾苦(affliction)、疾病或損傷的任何藥物 (pharmaceutical)、藥物(化Ug)或預(yù)防劑。
[0181] 藥理學(xué)
[0182] 除了其他考慮之外，本發(fā)明的新型活性成分是膚、膚類似物或擬膚的事實(shí)表明制 劑適合用于遞送運(yùn)些類型的化合物。雖然由于易被胃酸或腸道酶消化，通常膚較不適合用 于口服施用，正在利用新的方法W設(shè)計并提供代謝上穩(wěn)定且口服生物可利用的擬膚類似 物。
[0183] 本發(fā)明的藥物組合物可通過任何適合的方式施用，諸如口服、局部、鼻內(nèi)、皮下、肌 肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、病灶內(nèi)、通過吸入或腸胃外，并且被具體地配制用于施用途 徑。通常地，腸胃外施用或通過吸入施用將是優(yōu)選的，并且組合物將被相應(yīng)地配制。
[0184] 本發(fā)明的藥物組合物可通過本領(lǐng)域熟知的方法來制備，例如通過常規(guī)的混合、溶 解、制粒、研磨、粉碎、制成糖衣丸、研細(xì)、乳化、包封、包埋或凍干過程來制備。
[0185] 因此，根據(jù)本發(fā)明用于使用的藥物組合物可使用一種或更多種生理上可接受的載 體包括賦形劑和助劑W常規(guī)的方式配制，所述生理上可接受的載體包括賦形劑和助劑促進(jìn) 將活性化合物加工到制品中，所述制品可在藥學(xué)上使用。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所選的施用途 徑。
[0186] 可口服使用的藥物組合物包括由明膠制成的推入配合式(push-fit)膠囊W及由 明膠和塑化劑諸如甘油或山梨醇制成的軟、密封的膠囊。推入配合式膠囊可包含活性成分， 所述活性成分與填充物諸如乳糖、粘合劑諸如淀粉、潤滑劑諸如滑石或硬脂酸儀、W及任選 地穩(wěn)定劑混合。在軟膠囊中，活性化合物可被溶解或懸浮在合適的液體中，諸如脂肪油、液 體石蠟或液態(tài)聚乙二醇。另外，可添加穩(wěn)定劑。
[0187] 對于注射，可將本發(fā)明的化合物配制在水性溶液中、優(yōu)選地在生理上相容的緩沖 液中，所述生理上相容的緩沖液諸如化nk'S溶液、林格氏溶液或生理鹽水緩沖液。對于經(jīng)粘 膜施用，在制劑中使用適合于待被滲透的屏障的滲透劑。此類滲透劑例如聚乙二醇在本領(lǐng) 域中是普遍已知的。
[0188] 提供了具有合適的包衣的糖衣丸核屯、。為了運(yùn)個目的，可使用濃縮的糖溶液，所述 濃縮的糖溶液可任選地包含阿拉伯樹膠、滑石、聚乙締化咯燒酬、卡波姆凝膠、聚乙二醇、二 氧化鐵、漆溶液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物?？蓪⒅珓┗蛏靥砑拥狡瑒┗蛱且峦?包衣，用于鑒定或表征活性化合物劑量的不同組合。
[0189] 對于含服施用，組合物可采取W常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。
[0190] 對于通過吸入施用，根據(jù)本發(fā)明的用于使用的變體通過使用合適的推進(jìn)劑W氣溶 膠噴霧外觀的形式從加壓的包或噴霧器被方便地遞送，所述推進(jìn)劑例如二氯二氣甲燒、= 氯氣甲燒、二氯-四氣乙燒或二氧化碳。在加壓的氣溶膠的情況中，可通過提供閥W遞送計 量的量來確定劑量單位。例如，用于在吸入器或吹入器中使用的明膠的膠囊和套筒 (cartridges)可被配制為包含膚和合適的粉末基質(zhì)諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
[0191] 用于腸胃外施用的藥物組合物包括水溶性形式的活性成分的水性溶液。另外，活 性化合物的懸液可被制備作為適當(dāng)?shù)挠托宰⑸鋺乙骸：线m的天然或合成的載體在本領(lǐng)域是 眾所周知的（PiIlai等Curr .Opin.Chem.Biol .5,447,2001)。任選地，懸液還可包含合適的 穩(wěn)定劑或增加化合物的溶解度的劑，W允許制備高度濃縮的溶液?？蛇x地，活性成分可W為 用于在使用前用合適的媒介物例如無菌、無熱原的水重構(gòu)的粉末形式。
[0192] 本發(fā)明的化合物還可使用例如常規(guī)栓劑基質(zhì)諸如可可油或其他甘油醋被配制成 直腸用組合物，諸如栓劑或保留灌腸劑(retention enemas)。
[0193] 在屯、肌缺血和冠狀動脈疾病的情況中，用于預(yù)防和/或治療此類狀況的優(yōu)選的方 法將是將治療性膚并入到藥物洗脫支架中。支架正被廣泛地用于治療此類狀況，并且具有 可容納藥物的聚合物的支架的包衣是本領(lǐng)域熟練的人員熟知的。根據(jù)本發(fā)明的治療性膚經(jīng) 由藥物洗脫支架的局部釋放可W是有優(yōu)勢的，因?yàn)樵谕汀⒓〉钠谕稽c(diǎn)處獲得高的濃度同時 全身性濃度可變得可忽略。
[0194] 適用于本發(fā)明的上下文的藥物組合物包括其中W有效獲得預(yù)期目的的量包含活 性成分的組合物。更具體地，治療有效量意指有效預(yù)防、緩解或改善待治療的受試者的疾病 的癥狀的化合物的量。治療有效量的確定良好地在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)。
[0195] 本文描述的膚的毒性和治療效果能夠通過在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動物中的標(biāo)準(zhǔn)藥 物學(xué)程序來確定，例如通過確定主題化合物的IC50(提供50%抑制的濃度）和LD50(導(dǎo)致 50%的測試動物死亡的致死劑量)來確定。從運(yùn)些細(xì)胞培養(yǎng)物測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù) 可被用于配制用于在人類中使用的劑量范圍。劑量可根據(jù)采用的劑型和使用的施用途徑而 變化。準(zhǔn)確的制劑、施用途徑和劑量可由個體醫(yī)師根據(jù)患者的情況選擇（例如Fingl,等， 1975,于叮he Pharmacological Basis of Therapeutics"，第I章第頂）。
[0196] 用于施用此類藥物組合物的優(yōu)選的劑量的范圍為從約O.liig/kg到約20mg/kg體 重。優(yōu)選地，活性成分的量的范圍為從約IOygAg到5000]ig/kg。
[0197] 根據(jù)待被治療的狀況的嚴(yán)重度和反應(yīng)性，給藥也可W是單次施用緩釋組合物，具 有從若干天持續(xù)到若干周或直到達(dá)到治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減少的療程。待施用的組合物 的量將當(dāng)然地取決于待被治療的受試者、疾苦的嚴(yán)重度、施用方式、處方醫(yī)師的判斷W及所 有其他相關(guān)因素。
[0198] 在某些實(shí)施方案中，可通過使用保護(hù)性賦形劑來增強(qiáng)膚的遞送。運(yùn)通常通過將膚 與使其耐受酸水解和酶促水解的成分復(fù)合或通過將多膚包裝在適當(dāng)?shù)哪褪苄暂d體諸如脂 質(zhì)體中來完成。保護(hù)用于口服遞送的多膚的方法是本領(lǐng)域熟知的（參見例如美國專利號5， 391，377，描述了用于口服遞送治療劑的脂質(zhì)成分）。
[0199] 可通過使用持續(xù)釋放的蛋白"包裝"系統(tǒng)來維持升高的血清半衰期。此類持續(xù)釋放 系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于蛋白和膚的ProLease可生 物降解的微球遞送系統(tǒng)（Tra巧，1998,Biotechnol .Prog. 14,108; Johnson等 1996,化ture Med. 2,795; He;rbe;rt等1998, Pharmaceut. Res. 15,357)是包括可生物降解的聚合物微球的 干燥粉末，所述可生物降解的聚合物微球在聚合物基質(zhì)中包含蛋白質(zhì)，所述干燥粉末可被 復(fù)合成干燥制劑、具有或不具有其他劑。
[0200] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物的劑型包括但不限于可生物降解的可注射的 藥性持久(depot)的系統(tǒng)，諸如基于PLGA的可注射的藥性持久的系統(tǒng)、非基于PLGA的可注射 的藥性持久的系統(tǒng)和可注射的可生物降解的凝膠或分散體。每個可能性代表本發(fā)明的單獨(dú) 的實(shí)施方案。如本文所用的術(shù)語"可生物降解的"指至少部分地由于與在周圍組織液中發(fā)現(xiàn) 的物質(zhì)接觸，或通過細(xì)胞活動，而隨時間推移在其表面侵蝕或降解的組分。特別地，可生物 降解的組分是聚合物，諸如但不限于:基于乳酸的聚合物，諸如聚丙交醋，例如聚化，k丙交 醋）即PLA;基于乙醇酸的聚合物，諸如聚乙交醋（PGA)，例如來自DureCt的Lactel液;柴（D， レ丙交醋-共-乙交醋）即化GA,(來自Boehringer的Resomei-⑩RG-504、Resomer飯RG-502、Resomer液RG-504H、Resomer衝RG-502H、Resomer?l;G-5〇4S、Resomer?飯 RG-502S;來自Durect的Lactel愈）；聚己內(nèi)醋，諸如聚（e-己內(nèi)醋）即PCL (來自Durect的Lact站愈 );聚酸酢;聚(癸二酸)SA;聚（藍(lán)麻油酸)RA;聚（富馬酸），F(xiàn)A;聚(脂肪酸二聚體），F(xiàn)AD;聚(對 苯二甲酸），TA;聚（間苯二甲酸），IPA;聚(P-徽基苯氧基}甲燒），CPM;聚(P-徽基苯氧基} 丙烷），CPP;聚(p-{簇基苯氧基}己燒），CPH;聚胺、聚氨醋、聚酷胺醋、聚原酸醋{CHDM:順式/ 反式-環(huán)己基二甲醇，皿：1，6-己二醇.061'011:(3,9-二亞乙基-2,4,8，10-四氧雜螺^^一 燒）};聚二氧環(huán)己酬；聚徑基下酸醋；聚亞控基草酸醋；聚酷胺;聚酷胺醋；聚氨醋；聚縮醒； 聚縮酬;聚碳酸醋;聚原碳酸醋;聚硅氧烷;聚憐臘;班巧酸鹽/醋;透明質(zhì)酸;聚(蘋果酸）；聚 (氨基酸）；聚徑基戊酸鹽/醋;聚亞控基班巧酸鹽/醋;聚乙締化咯燒酬;聚苯乙締;合成的纖 維素醋；聚丙締酸；聚下酸；S嵌段共聚物（PLGA-PEG-化GA)、S嵌段共聚物（PEG-PLGA-陽G)、聚(N-異丙基丙締酷胺KPNIPAAm)、聚(環(huán)氧乙燒)-聚(環(huán)氧丙烷)-聚(環(huán)氧乙燒)S嵌 段共聚物(PEO-PPO-PEO)、聚戊酸;聚乙二醇;聚徑基烷基纖維素;幾下質(zhì);殼聚糖;聚原酸醋 和共聚物、=元共聚物;脂質(zhì)，諸如膽固醇、卵憐脂;聚(谷氨酸-共-谷氨酸乙醋)等，或其混 合物。
[0201] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含選自但不限于W下的可生物降解的聚合 物:PLGA、PLA、PGA、聚己內(nèi)醋、聚徑基下酸鹽/醋、聚原酸醋、聚燒控酸酢、明膠、膠原、氧化的 纖維素、聚憐臘等。每個可能性代表單獨(dú)的實(shí)施方案。
[0202] 藥性持久的系統(tǒng)
[0203] 通過靜脈內(nèi)（IV)、肌肉內(nèi)（IM)、或皮下（SC)注射的腸胃外途徑是小分子量和大分 子量藥物的最常用且有效的遞送形式。但是，由于針刺造成的疼痛、不適和不便使該藥物遞 送模式成為最不被患者優(yōu)選的。因此，能夠最低限度地減少注射的總次數(shù)的任何藥物遞送 技術(shù)是優(yōu)選的。在實(shí)踐中藥物給藥的頻率的此類減少可通過使用能夠W緩慢但可預(yù)測的方 式釋放藥物并且因此提高依從性的可注射的藥性持久的制劑來實(shí)現(xiàn)。對于大多數(shù)藥物，根 據(jù)劑量將注射頻率從每日一次減少到每月一次或兩次或甚至更久(6個月）是可能的。除了 提高患者的舒適度之外，呈藥性持久的制劑的形式的藥物的較少頻率的注射通過消除峰和 谷使血漿濃度-時間曲線平滑。使血漿曲線的此平滑不僅具有在大多數(shù)病例中增加治療益 處的潛能，還具有減少任何不希望的事件諸如免疫原性的潛能。
[0204] 微粒、植入物和凝膠是在實(shí)踐中使用用于延長藥物在身體中的釋放的可生物降解 聚合物裝置的最常見形式。將微粒在臨注射之前懸浮在水性介質(zhì)中，并且技術(shù)人員可在懸 液中裝載多達(dá)40%的固體。借助于特殊的針將植入物/棒狀制劑W干燥狀態(tài)遞送到SCVIM組 織，而不需要水性介質(zhì)。棒/植入物的該特征允許較高的質(zhì)量的制劑和藥物含量被遞送。此 夕h在棒/植入物中，由于與微粒相比植入物中的小得多的面積(area),初始的爆發(fā)問題被 最小化。除了可生物降解的系統(tǒng)之外，存在能夠在身體外部使用的非可生物降解的植入物 和輸注累。非可生物降解的植入物需要醫(yī)生訪問，不僅為了將裝置植入到SC/IM組織，也為 了在藥物釋放時期之后將它們移除。
[0205] 包含微粒制品的可注射組合物特別容易出現(xiàn)問題。與其他類型的可注射懸液中的 0.5-5 %的固體相比，微粒懸液可包含多達(dá)40 %的固體。另外，與推薦用于IM或SC施用的小 于扣m的顆粒尺寸相比，在可注射的藥性持久的產(chǎn)品中使用的微粒的尺寸范圍多達(dá)約250WI1 (平均60-100皿)。較高的固體濃度和較大的固體顆粒尺寸需要較大尺寸的針(約18-21標(biāo)準(zhǔn) 規(guī)格(gauge))用于注射?？偠灾?，雖然不頻繁地使用較大且不舒適的針，患者仍偏愛較少 頻率地施用的劑型超過用較小的針的每天藥物注射。
[0206] 可生物降解的聚(乳酸KPLA)的聚醋W及被稱為聚(丙交醋-共-乙交醋）的丙交醋 和乙交醋的共聚物(PLGA)是用于可生物降解的劑型的最常見聚合物。PLA是疏水性分子，并 且化GA由于存在較多的親水性乙交醋基團(tuán)而比化A降解的快。運(yùn)些生物相容性聚合物經(jīng)歷 醋鍵的隨機(jī)、非酶促、水解裂解W形成乳酸和乙醇酸，乳酸和乙醇酸是身體內(nèi)的正常代謝化 合物?？晌盏目p合線、夾子（cl ip)和植入物是運(yùn)些聚合物的最早的應(yīng)用。Southern Research Institute在1970年開發(fā)出了第一種合成的、可吸收的縫合線（Dexoil⑧)。在 1973年出現(xiàn)了描述PLGA聚合物在持續(xù)釋放劑型中的使用的第一個專利化S 3,773,919)。
[0207] 現(xiàn)今，PLGA聚合物從多個供應(yīng)商Alke;rmes(Mediso;rb polymers) ,Absorbable Polymers International [先前的Birmingham Polymers(Durect的部口）]、Purac和 Boehringer Ingelheim市售可得。除了PLGA和PLA之外，天然的纖維素類聚合物諸如淀粉、 淀粉衍生物、右旋糖酢和非-PLGA合成聚合物也正在被探索作為此類系統(tǒng)中的可生物降解 的聚合物。
[020引治療用途
[0209]根據(jù)本發(fā)明的原理，本發(fā)明的膚可用于其中發(fā)生血液供應(yīng)不足、足夠的血管生長 和循環(huán)未適宜地被恢復(fù)W及由于血液流動不足而存在組織死亡的風(fēng)險的適應(yīng)癥，或內(nèi)皮功 能異常的病例。通常，運(yùn)些狀況是例如外周血管疾病;屯、肌缺血;組織移植疾病;冠狀動脈疾 ??；中風(fēng);和延遲的傷口愈合(例如在潰瘍性病變中）；肺病，包括急性肺損傷(ALI )、急性呼 吸窘迫綜合征(ARDS)、和通氣誘發(fā)的肺損傷(VILI);眼病，包括年齡相關(guān)的黃斑病變(AMD); W及與嚴(yán)重感染相關(guān)的病理狀況，諸如例如脈毒癥。
[0210] 本發(fā)明的膚還可用于治療糖尿病和設(shè)及膜腺e細(xì)胞的損傷或需要運(yùn)些細(xì)胞再生的 另外的疾病狀態(tài)。已經(jīng)顯示膜島脈管系統(tǒng)是膜腺e細(xì)胞的再生能力的關(guān)鍵決定因素。除了其 他W外，Brissova等(Diabetes 55:2974-2985,2006)證實(shí)了血管發(fā)生因子和其受體在成人 膜腺中差異表達(dá)，并且減少的由膜腺P細(xì)胞的VEGF-A表達(dá)導(dǎo)致異常的膜島血管形成和糖尿 病前期的表型，導(dǎo)致減少的輸出到血管系統(tǒng)中的膜島素。血管發(fā)生因子如VEGF是膜島血管 形成和功能的主要調(diào)節(jié)物，并且還是移植的膜島的血管再形成所需的。因此，本發(fā)明的膚可 用于一般性地治療糖尿病、或特別地用于膜島移植。
[0211] 雖然已經(jīng)為了闡述本發(fā)明而就本發(fā)明的多個特定的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但此 類具體地公開的實(shí)施方案不應(yīng)該被認(rèn)為是限制性的?；?br>【申請人】在本文的公開內(nèi)容，本領(lǐng) 域技術(shù)人員將想到許多其他的特定的實(shí)施方案，并且
【申請人】提出僅被如在所附的權(quán)利要求 書中所定義的其發(fā)明的精神和范圍所限制。 實(shí)施例
[0212] W下的實(shí)施例表明了本發(fā)明的膚離體和在體內(nèi)刺激血管發(fā)生的活性。
[0213] 實(shí)施例1:膚合成
[0214] 通過常規(guī)的固相合成方法利用巧OC或Fmoc化學(xué)法合成膚。
[0215] 實(shí)施例2:離體主動脈環(huán)測定
[0216] 從7至8周齡雄性SABRA小鼠解剖胸主動脈。將主動脈立即轉(zhuǎn)移至恰有BIO-MPM-I的 皮氏（Petri)培養(yǎng)皿。在解剖顯微鏡下將主動脈周圍的動脈外膜和小血管小屯、地移除，并且 制成0.75mm的橫切片。將得到的主動脈環(huán)徹底沖洗并且在含有青霉素-鏈霉素的BIO-MPM-I 中培養(yǎng)過夜。隨后，將環(huán)包埋在96孔板(Nunc ,Rochester, NY)中的SOiil膠原混合物（7份膠 原、1份IOX伊格爾氏最低必須培養(yǎng)基MEM、和2份0.15M碳酸氨鋼）中。膠原溶液的凝固通過 將抑升高至中性并將溫度升高至37°C來實(shí)現(xiàn)。將15化1的含有青霉素-鏈霉素和測試的因子 或膚）的BIO-MPM-I添加到包埋的環(huán)，并將板在37°C在加濕的10%C02氣氛中解育。在第4天 和第8天更新含有因子和/或膚的培養(yǎng)基。2周后，用4%甲醒固定環(huán)持續(xù)24小時，隨后用溶解 在乙醇中的結(jié)晶紫(0.02%)染色并且徹底洗涂W移除過量染料。W4個孔(小鼠主動脈環(huán)的 4個環(huán))/測定檢查因子和膚的效應(yīng)。使用數(shù)碼相機(jī)(WkonJokyo Japan)獲取代表性環(huán)的顯 微照片。根據(jù)Nissanov等化ab Invest. 1995;73:734-739)使用Image-Pro 4.5軟件（Media 切bernetics, Si Iver Spring ,MD)手動地進(jìn)行出芽的形態(tài)分析。未染色的環(huán)經(jīng)受石蠟切片 W及蘇木精和伊紅化&E)染色。
[0217] 表2歸納了在若干主動脈環(huán)測定中測試的若干化合物的結(jié)果。如也在圖1A-1C和圖 2A-2C中表明的，在該測定中膚AB-017(SEQ ID N0:12)、AB-033(SEQ ID N0:13WPAB-034 (SEQ ID NO:)引發(fā)大量的毛細(xì)管形成。圖lA-lC展示了主動脈環(huán)毛細(xì)管長度并且圖2A-2C展 示了主動脈環(huán)毛細(xì)管寬度。在表中：K-Flu是與巧光素部分偶聯(lián)的賴氨酸殘基，4化化e是4-漠-苯丙氨酸，Dod是十二燒酷基，Dec表示癸酷基，Oct是辛酷基，并且化X是己酷基。
[021 引
[0219] 實(shí)施例3:效力研究-小鼠后肢缺血/血管發(fā)生模型
[0220] 本研究的目標(biāo)是確定施用測試物品膚AB-017(SEQ ID NO: 12)和725-106(陽性對 照，SEQ ID N0:2)是否能夠增強(qiáng)后肢缺血模型中的血管發(fā)生、隨后引起臨床的和運(yùn)動功能 的改善。該測試的原理基于施用該測試化合物后灌注率、臨床跡象和組織學(xué)參數(shù)(壞死）的 改變。
[0221] 小鼠是用于研究的選擇的物種，并且后肢缺血模型在歷史上已在測試的化合物的 潛在促血管發(fā)生特性的評估和評價中被使用。小鼠后肢缺血模型是提供關(guān)于該策略的效力 的早期信息的初始步驟。
[0222] 各個測試組包括4-7只小鼠/組。在該模型中腹膜內(nèi)（i.p)注射是施用測試物品的 優(yōu)選途徑，并且DMS0/PEG被用作媒介物W制備測試物品溶液。
[0223] 將測試的膚溶解在100 %DMSO中。其后，向溶液添加聚乙二醇(PEG)400。使用無菌 水W稀釋至0.5%DMS0/10%陽G 400/出0的終濃度，W得到2mg/ml。制備溶液并且分成標(biāo)記 的等分并儲存在-70°C。
[0224] 物種/品系:小鼠 /Ba化/c雄性~8周
[0225] 來源:化rlan實(shí)驗(yàn)室，W色列
[02%]初始體重:在研究初始約25g。組的最小和最大重量在組平均重量的±20%的范圍 內(nèi)。
[0227] 根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院(化tional Institute Of Health,NIH)和國際實(shí)驗(yàn)動 物護(hù)理評估和認(rèn)可委員會（Association for Assessment and Accreditation of Laboratoiy Animal姑re,AAALAC)的指導(dǎo)進(jìn)行動物處理。
[0228] 在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件、空氣調(diào)節(jié)并過濾的化EPA F6/6)、具有足夠的新鮮空氣供應(yīng) (31次空氣交換/小時)條件下收容動物。在氣候控制的環(huán)境中保持動物。溫度范圍在20-24 °(：之間并且RH在30-70%之間，具有12小時光照和12小時黑暗的周期。在測量為35 X 30 X 15cm、具有便于顆粒食物和塑料瓶中的飲用水的不誘鋼頂部格柵的聚乙締籠中收容動物(7 只/籠）；墊料:蒸汽滅菌的干凈的稻殼。墊料至少一周兩次連同籠一起更換。
[02巧]飲食：用市售的曬齒動物飲食（Teklad Certified Global 18%Protein Diet目 錄號：106S8216)任意飼喂動物。動物可自由接近從市政供應(yīng)獲得的引用水。
[0Z30] 外科手術(shù)程序:
[0231] 麻醉:〇2/化0的混合物中的1.5-3%的異氣燒，在自然呼吸下。用帶子捆住動物的所 有四肢，W便于動物用于外科手術(shù)。將動物的兩條后腿剌毛并消毒。在所有動物中的進(jìn)行手 術(shù)的腿(右腿)上，從腹股溝區(qū)到接近膝蓋處做出切口。暴露出股靜脈/動脈/神經(jīng)。將動脈與 靜脈、神經(jīng)和周圍的筋膜剖離開。在動脈與股深動脈的分叉點(diǎn)的遠(yuǎn)端，使用6-0絲縫合線將 動脈結(jié)扎兩次，并且其后在運(yùn)兩點(diǎn)之間橫切(參見prox-A-組模型附錄I)。用6-0絲閉合手術(shù) 傷口，并且使小鼠返回至其籠。在所有動物中，左腿是未經(jīng)處理的對照。
[0232] 排除標(biāo)準(zhǔn)：只有外科手術(shù)后平均流出測量值(mean flux measurement) < 10%且 <外科手術(shù)前的測量值的50%的小鼠被并入該研究。外科手術(shù)后平均流出測量值超過該范 圍的小鼠被從該研究排除。
[023；3]計算:平均流出=(外科手術(shù)前(處理的)-0.5) / (外科手術(shù)前(對照)-0.5)
[0234] (外科手術(shù)后(處理的）-0.5)/(外科手丕后(對照）-0.5)
[0235] 藥物施用:通過IP施用WlOml/kg的劑量體積向所有動物給藥。
[0236] 表3.治療方案：
[02371
[0淵]測試和評價:
[0239] 體重:在外科手術(shù)前、每次給藥前、W及尸體解剖前測量體重。
[0240] 血液流動測量：使用Laser Doppler裝置（Perimed 化riScan PIM II System,技 術(shù)手冊隨測試設(shè)備可得)在W下時間點(diǎn)測量當(dāng)腿在其自然休息位置時的血液流動(進(jìn)行手 術(shù)的腿&對照腿）：外科手術(shù)前(剌毛后)&外科手術(shù)后(第0天）；第1天;第8天;第15天;第22天 和第29天。每只小鼠的每個時間點(diǎn)由3次測量組成。
[0241] 另外，在外科手術(shù)前剌毛前在最初的10只動物中測量血液流動。
[0242] 缺血嚴(yán)重度的宏觀評價:在手術(shù)后兩周W及在研究結(jié)束時，通過利用壞死區(qū)域的5 點(diǎn)分級形態(tài)學(xué)量表對缺血肢體宏觀評價;根據(jù)Tokai . J.等化邱.Cl in. Med .，31，3，128-132 頁，2006),0級:無變化；1級：（限于)足尖壞死;2級：足部壞死(擴(kuò)展到足背）；3級：膝蓋壞死 (擴(kuò)展到膝蓋）；4級:全部壞死(整個后肢喪失）。
[0243] 肢體運(yùn)動功能損傷的評價:在手術(shù)后兩周和在研究結(jié)束時，利用W下4點(diǎn)量表進(jìn)行 肢體運(yùn)動功能的評價:〇級：彎曲足尖W抵抗尾己的溫和牽引；1級：巧屈；2級:無拖動但無巧 屈；3級：拖動足部（Rutherford等J. Vas州Iar Surge巧；1997，26，517-538)。最終肌肉重量& 組織固定:在研究的終止(第29天），將動物處死。將W下肌肉與腿剖離、稱重并在福爾馬林 中固定直到被發(fā)起人收回：腔前肌、脾腸肌和比目魚肌。
[0244] 結(jié)果
[0245] ^匯編:數(shù)據(jù)W圖的形式歸納，顯示進(jìn)行手術(shù)的腿的持續(xù)4周的灌注（圖3,數(shù)值 結(jié)果作為平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差給出），W及W表的形式歸納(表4)，顯示每組的動物的數(shù)目、腿 功能的評分和在第15天腿的缺血狀況的評分。只有在手術(shù)后其腿灌注減少巧0%的動物被 包括在該分析中。
[0246] 缺血評分
[0247] 4:擴(kuò)展到股的壞死(整個后肢喪失）
[0248] 3:擴(kuò)展到小腿的壞死(膝蓋喪失）
[0249] 2:擴(kuò)展到足背的壞死(足喪失）
[0250] 1:限于足尖的壞死(足尖喪失）
[0巧1] 0:壞死不存在
[0252] 功能評分
[0253] 3:拖動足部
[0254] 2:無拖動但無巧屈
[0巧5] 1:巧屈
[0256] 0:彎曲足尖W抵抗尾己的溫和牽引（Rutherford等，1997)。
[0257]圖3和表4歸納了在體內(nèi)后肢缺血模型中，與媒介物對照相比，用化合物AB-017 (SEQ ID NO: 12)和725-106(陽性對照，SEQ ID N0:2)處理的結(jié)果。如可W看到的，在灌注 (圖3)、腿功能和腿壞死(表4)的所有參數(shù)方面，用AB-017處理與媒介物對照和較長的膚 725-106二者相比導(dǎo)致缺血腿的顯著改進(jìn)。
[0巧引表4.
[0 巧9]
[0260] 實(shí)施例4:體內(nèi)效力-小鼠中的血管發(fā)生模型
[0261] 本研究的目的是在小鼠屯、肌梗死模型中測試膚的促血管發(fā)生活性，并確定在該模 型中施用膚是否能夠誘導(dǎo)血管生長，并可證明是否由此改善缺血屯、臟的臨床功能。測試的 原理基于在施用測試膚之后，灌注率、臨床跡象和組織學(xué)參數(shù)的改變。研究的終點(diǎn)包括測量 ECG和測量屯、肌損傷。
[0262] 小鼠是用于研究的選擇的物種，并且在歷史上已在測試的化合物的潛在促血管發(fā) 生特性的評估和評價中被用于屯、肌梗死研究。小鼠屯、肌梗死缺血模型通常是提供關(guān)于該策 略的效力的早期信息的初始步驟。
[0263] 總共使用30只小鼠。每個測試組包括10只小鼠。在該模型中，腹膜內(nèi)（i.p)注射是 施用測試的化合物的優(yōu)選途徑，并且DMS0/PEG被用作媒介物來制備測試物品溶液。
[0264] 材料和方法
[0265] 將測試膚溶解在100%DMS0中。其后，向溶液添加聚乙二醇(陽G)400。使用無菌水 W稀釋至0.5 %DMSO/10 %陽G 400/H20的終濃度，W得到2mg/ml。制備溶液并分成標(biāo)記的等 分，并儲存在-7〇°C。 惦66]物種/品系：小鼠/Fl雜交CB6F1 (C57BL/6J X BALBc)
[0267] 性另Ij/數(shù)目/年齡:雄性/30( 3組)/8周 [0%引來源:化rlan實(shí)驗(yàn)室，W色列
[0269] 體重:在研究初始約25g。組的最小和最大重量將不超過組平均重量的±20%。
[0270] 適應(yīng)時期:最少5天。
[0271 ] 標(biāo)識:通過小鼠登記號、刻耳號和籠卡。
[0272] 動物處理根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)和國際實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理評估和認(rèn)可委員會 (AAALAC)。
[0273] 在測量為35 X 30 X 15cm、具有不誘鋼頂部格柵、具有用于顆粒食物的設(shè)施和在玻 璃瓶中的飲用水的聚乙締籠中收容動物（4只/籠）；在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件、空氣調(diào)節(jié)并過濾 化EPA F6/6)、具有足夠的新鮮空氣供應(yīng)(31次空氣交換/小時)條件下收容動物。在氣候控 制的環(huán)境中保持動物。溫度范圍在20-24°C之間并且畑在30-70 %之間，具有12小時光照和 12小時黑暗周期。使用蒸汽滅菌的干凈稻殼化arlan，Sani-cMp目錄號：2018SC+F)，并且墊 料至少一周兩次連同籠一起更換。動物被任意"自由飼喂"飼喂市售的曬齒動物飲食 (Teklad Certified Global 18%P;rotein Diet 目錄號：106S8216)。動物可自由汲取飲用 水。食物和水供應(yīng)中的合理預(yù)期的污染物應(yīng)不具有影響該測試的結(jié)果的潛能。使用計算機(jī) 生成的隨機(jī)化程序"ReSearch Randomi Zer"將動物隨機(jī)化，并分成3個10只動物的組。 腳4] 實(shí)驗(yàn)設(shè)計和條件
[0275]用戊己比妥鋼(70mg/kg)麻醉動物。切口的位置是左蔽窩。皮下注射0.1ml的0.1% 的利多卡因溶液。在距胸骨左緣2mm處朝向左蔽窩（其下l-2mm)做出8mm的斜切口。操作者盡 力使在皮膚下延伸的胸部淺靜脈在切口的側(cè)角可視化。兩層胸肌均被切開，小屯、避開靜脈； 透過薄且半透明的胸壁，可觀察到肋骨和充氣的肺。第4肋間隙代表那些肋骨之間觀察到肺 的最低部分的區(qū)域。然后打開胸腔，小屯、不要損傷肺。插入胸牽開器并溫和打開W使傷口張 開8-lOmm的寬度。然后使被肺部分地覆蓋的屯、臟可視化。將屯、包用曲直錯溫和地夾起、撕 開、并放置在牽開器的臂后。該手法將肺輕微地向上推、使其移動并且提供較好的屯、臟暴 露。然后，使冠狀動脈左前降支(LAD)作為搏動的鮮紅穗狀物(spike)可視化，在屯、臟壁的中 央從左屯、房的下方向尖端延伸。如果無法可視化LAD動脈，可抬高左屯、房，W使得源自主動 脈的LAD動脈的源頭被定位。于在其正常位置的左屯、耳的尖部W下l-2mm處將LAD動脈結(jié)扎， 運(yùn)引起左屯、室(LV)大約40-50%的缺血。在結(jié)扎的位點(diǎn)已被確定后，在略低于隨后的結(jié)扎處 使用曲錯溫和地壓在動脈上（運(yùn)增強(qiáng)動脈的觀察并穩(wěn)定屯、臟）。通過LV的前壁的顏色變化 (變蒼白）確定閉塞。移出牽開器，并且通過關(guān)閉通氣機(jī)外流使肺再充氣。通過使用一條或兩 條6-0尼龍縫合線將第4和第5肋骨拼合，來使胸腔閉合(對胸壁施加壓力W減少自由空氣的 體積）。分別用6-0可吸收縫合線和尼龍縫合線逐層閉合肌肉和皮膚。整個程序的持續(xù)時間 花費(fèi)大約12-15分鐘。 腳引藥物施用:
[0277] 在誘發(fā)屯、肌梗死之后約45-120分鐘，僅對恢復(fù)的動物、自主呼吸的動物通過IP施 用lOml/kg溶液中的20mg/kg的測試化合物進(jìn)行第一次給藥，并且其后每周兩次。
[0278] 表5:組分配
[0279]
[0280] 測試和評價:
[0281 ]體重:在每一個給藥日的給藥前的研究當(dāng)日測量體重。
[0282] ECG測量:在LAD動脈閉塞之后（之前和閉塞后立即），通過ECG ST段抬高確認(rèn)屯、肌 梗死的誘發(fā)。其后，在屯、肌梗死之后每周一次通過BIOPAC系統(tǒng)進(jìn)行ECG測量。
[0283] LDH測量:在24小時結(jié)束時，從每只小鼠收集血液(150iil )，并在室溫儲存持續(xù)1至2 個小時。通過在2，00化pm離屯、持續(xù)10分鐘來獲得血清，并在-70°C儲存。用標(biāo)準(zhǔn)Elisa試劑盒 測量LDH。
[0284] 終止:在手術(shù)后4周研究終止時，處死動物并進(jìn)行肉眼病理檢查。將屯、臟切離，并用 23-規(guī)格針插管通過升主動脈，用于隨后的用2mL至3mL37°C0.9%氯化鋼和用3mL至4mL 37 。(:憐酸鹽緩沖液（pH 7.4)中的1.0 % TTC灌注。然后用2mL至3ml的10 %獻(xiàn)青藍(lán)（PhthalO Blue,Heubach Ltd)灌注屯、臟W勾繪非缺血屯、肌。將屯、臟稱重，并用數(shù)碼相機(jī)從兩側(cè)拍照。 使用Image J來對整個屯、臟的邊界、非缺血區(qū)域和每個切片的兩側(cè)上的梗死區(qū)域進(jìn)行數(shù)字 地求積。非缺血區(qū)域和缺血區(qū)域(有風(fēng)險的區(qū)域）的尺寸被計算為按mm 2的尺寸或被計算為 總區(qū)域的百分比乘W屯、臟的總重量。
[0285] 實(shí)施例5:主動脈環(huán)的整裝制片(whole-mount)免疫染色
[0286] 將在膠原中包埋并生長的環(huán)（如在"主動脈環(huán)測定"中描述的）在室溫用PBS中的 1 %多聚甲醒固定，持續(xù)30分鐘，并在PBS中留置過夜。通過用含有1 % BSA和0.01 %化i ton-X 100的PBS在4 °C解育持續(xù)8小時來實(shí)現(xiàn)固定的環(huán)的封閉和透化。將環(huán)用含有1 % BSA的PBS中 的FITC綴合的抗a平滑肌肌動蛋白抗體(ab8211，1:200稀釋的；Abeam,Cambridge,England) 解育，持續(xù)8小時。通過在接下來的8至10個小時期間用PBS的若干次洗涂，去除過量的未結(jié) 合的抗體之后，使用巧光顯微鏡(Axiove;rt200M;Zeiss)使樣品可視化。
[0287] 實(shí)施例6:體內(nèi)角膜囊袋測定
[0288] 角膜囊袋測定測試血管形成，所述血管形成從小鼠眼的邊緣朝向插入到眼角膜的 包含測試材料的丸粒。
[0289] 如由Kenyon等（Invest 0曲thalmol Vis Sci . 1996;37:1625-1632)描述的檢查血 管發(fā)生反應(yīng)。簡而言之，通過將硫糖侶（500mg/mL)溶解在20mM巧樣酸鋼、ImM抓TA和9%薦 糖溶液中，并將的該溶液添加到5mg的測試膚、或者40iig的FGF、VEGF或CSF中來制備丸 粒。單個丸粒包含運(yùn)些量的約1:450。在添加20化乙醇中的Hy化on聚合物（120mg/mL)之后， 將混合物應(yīng)用到15 X 15-mm2的合成網(wǎng)格片（Sefar AmericaJansas City,MO)并且用 Hy化on包衣。允許丸粒空氣干燥，并撕除網(wǎng)格的纖維。在經(jīng)麻醉的巧7BL/6小鼠（8-10周齡） 的兩只眼中產(chǎn)生角膜微囊袋。在局部施用利多卡因之后，使用Von-Graefe白內(nèi)障刀做出切 口。在距血管化的邊緣Imm至2mm距離處，將丸粒(0.2 X 0.2 X 0.3mm)浸潰到角膜微囊袋內(nèi)。 在膚和蛋白組合的情況中，將2個丸粒插入同一切口。將多黏菌素-B-新霉素-桿菌膚 (Bamyxin)眼用軟膏應(yīng)用到眼W預(yù)防感染。8天后，利用體視鏡術(shù)記錄反應(yīng)并進(jìn)行拍照。每周 兩次監(jiān)測血管發(fā)展直到充滿顯微鏡，并制作0.5mm的橫切片。得到的主動脈血管發(fā)生消退 (regression)。在4只動物(4-6只眼）中檢查在該測定中測試的每種膚和因子。
[0290]實(shí)施例6:協(xié)同作用
[0巧1] 在10咖濃度的膚48-033(569 10^:13)和48-034(569 10^:14)與促血管發(fā)生 蛋白VEGF-起的存在下，重復(fù)主動脈環(huán)測定。表6和圖4中顯示的結(jié)果表明用膚與VEGF-起 處理的協(xié)同作用。
[0巧2] 表6.
[0293]
[0294]
[02M]實(shí)施例7:另外的膚
[0296] 表7列出了為W上公開的膚的膚類似物的另外的膚。運(yùn)些膚被合成并被測試對血 管發(fā)生的刺激。
[0297] 表7.
[029引
[0巧9] Myr是丑違酷基、化O是膽醬醇基、X是2-氨基-3-脈基丙酸、hArg是局精氨酸、Cit是 瓜氨酸、R是低級烷基、Zl是(S)-嚷挫燒-2-簇酸、Z2是(2S，3aS，7aS)八氨-IH-嗎I噪-2-簇酸、 NMeA巧是N-甲基精氨酸、MfeNle是N-甲基正亮氨酸、4HyP是(4-徑基)脯氨酸、3HyP是（3-徑 基)脯氨酸、4^是(4-畑2)苯丙氨酸且35(11￥是(3,5-二艦)酪氨酸。
[0300] 實(shí)施例8:血管滲漏的抑制
[0301] W20mg/Kg或40mg/Kg的量將沈Q ID N0:12(Myr-Gly-Nle-Arg-Pr〇-Tyr-NH2)的膚 或媒介物（10 % PEG-400、90 % DDW) i . P.注射至小鼠。5分鐘、10分鐘、1小時或4小時后，W 0.2ml/25g小鼠（40mg/Kg)i.p.注射雙蒸水(DDW)中的5mg/ml伊文氏藍(lán)化vans-Blue)溶液。 30分鐘后終止實(shí)驗(yàn)，并打開煩骨W觀察腦表面（"神經(jīng)外科"），并且評價從血管滲漏的伊文 氏藍(lán)的量。
[0302] 外周血管染色的原理:伊文氏藍(lán)；其是具有960道爾頓的分子量的聚陰離子化合 物，其與白蛋白緊密結(jié)合并且被用于追蹤血管滲透性。在血管滲漏的情況中，伊文氏藍(lán)-白 蛋白復(fù)合物從血液流逃逸到周圍的間質(zhì)液，結(jié)果導(dǎo)致肢體著藍(lán)色W及腦表面的淺藍(lán)色外 觀。
[0303] 在特定的實(shí)驗(yàn)中，在顏料注射前5分鐘，i.p.注射40mg/kg的SEQ ID NO: 12的膚或 媒介物，每種注射至2只小鼠。然后W40mg/kg i.p.注射伊文氏藍(lán)，并且30分鐘后進(jìn)行"神經(jīng) 外科"，并監(jiān)測從血液流逃逸出的顏料，如通過腦周圍組織的淺藍(lán)色外觀顯示的。結(jié)果清楚 地表明，雖然如通過腦的淺藍(lán)色顯示的，伊文氏藍(lán)從對照(注射媒介物的）小鼠的血管滲漏， 但沒有顏料從用膚SEQ ID NO: 12預(yù)處理的動物的血管滲漏。
[0304] 在另外的實(shí)驗(yàn)中，在顏料注射(伊文氏藍(lán)，40mg/kg i . P.持續(xù)30分鐘前10分鐘，將 20mg/kg的沈Q ID NO: 12的膚或媒介物（10 %陽G-400、90 %DDW) i . P.注射到2只小鼠中。該 結(jié)果清楚地表明，雖然如通過腦的淺藍(lán)色和爪的淺藍(lán)色顯示的，伊文氏藍(lán)從對照(注射媒介 物的）小鼠的血管滲漏，但沒有顏料從用膚SEQ ID N0:12預(yù)處理的動物的血管滲漏，在腦部 和外周均沒有。
[0305] 在另一個實(shí)驗(yàn)中，在顏料注射(伊文氏藍(lán)，40mg/kg i.p.持續(xù)30分鐘）之前1或4小 時，將40mg/kg的SEQ ID NO: 12的膚i .P.注射到小鼠。對照小鼠在顏料注射之前1小時接受 媒介物（10 %PEG-4i . P. 00、90 %DDW)的i . P.注射。結(jié)果清楚地表明雖然如通過腦的淺藍(lán)色 顯示的，伊文氏藍(lán)從對照(注射媒介物的）小鼠的血管滲漏，但沒有顏料從在伊文氏藍(lán)注射 之前1小時用膚SEQ ID NO: 12預(yù)處理的動物的血管滲漏，盡管在伊文氏藍(lán)之前4小時注射膚 4給予僅部分的保護(hù)，即微弱的淺藍(lán)色外觀。
[0306] 實(shí)施例9:體內(nèi)脈毒性休克模型
[0307] 利用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)方法在野生型(WT化57MyJ、鼠中誘發(fā)嚴(yán)重脈毒癥的多 種微生物的脈毒癥小鼠模型（Belikoff等!"he Journal of Immunology,2011,186:2444-2453)。簡言之，將小鼠麻醉，在腹部的右下象限做出1.5-cm的縱切口，并使盲腸暴露。用4-0 絲縫合線對盲腸的遠(yuǎn)端2/3結(jié)扎，并用18-規(guī)格針雙倍地刺破。然后將盲腸放回腹膜腔，并用 外科手術(shù)釘閉合切口。之后，用皮下注射的無菌鹽水使小鼠復(fù)蘇，并允許蘇醒后自由地接近 食物和水。
[030引該步驟后，然后用媒介物或用20111旨/蛇的6?5-725.017(沈010^:12)每日一次皮 下(S.C.)注射小鼠，持續(xù)5天。
[0309] 在圖5中示出的結(jié)果表明膚SEQ ID NO: 12(在圖中被標(biāo)為GPS-725.017)在建立的 體內(nèi)脈毒性休克模型中挽救小鼠免于死亡的能力。
[0310] W上特定實(shí)施方案的描述將如此充分地掲示本發(fā)明的一般性質(zhì)，使得其他人可通 過應(yīng)用現(xiàn)有的知識容易地改動和/或調(diào)整此類特定的實(shí)施方案用于多種應(yīng)用，而無需過多 實(shí)驗(yàn)，且不背離一般概念，并且因此此類調(diào)整和改動應(yīng)該并預(yù)期被包括在所公開的實(shí)施方 案的等價物的含義和范圍內(nèi)。應(yīng)理解，本文中采用的措辭或術(shù)語是用于描述的目的而不是 用于限制的目的。用于進(jìn)行多種公開的功能的方法、材料和步驟可采取多種替代形式而不 背離本發(fā)明。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種3-10個氨基酸的肽，所述肽包含核心序列RPY，其中R是精氨酸殘基(Arg)或修飾 的精氨酸殘基，P是脯氨酸殘基(Pro)或修飾的脯氨酸殘基，Y是酪氨酸殘基(Tyr)或修飾的 酪氨酸殘基，其中所述肽共有與具有序列M et-Arg-PrO-Tyr-ASp(SEQIDN0:4)的內(nèi)皮分化 基因受體3(EDG3)的相應(yīng)殘基143-147的那些氨基酸相同的不超過3個氨基酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，所述肽由3-9個氨基酸殘基組成。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，所述肽由4-8個氨基酸殘基組成。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中至少一個殘基是非天然編碼的氨基酸殘基。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的肽，其中所述核心序列RPY的至少一個殘基是非天然編碼的氨 基酸殘基或修飾的殘基。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的肽，其中所述非天然編碼的氨基酸殘基或修飾的殘基選自由 以下組成的組:正亮氨酸(N1 e )、修飾的Arg、修飾的Pro和修飾的Tyr。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，所述肽能夠促進(jìn)血管的生長或改善內(nèi)皮功能。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，所述肽能夠刺激血管發(fā)生或減少功能異常的內(nèi)皮的滲漏。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，所述肽還包含經(jīng)由直接的鍵或經(jīng)由接頭與所述肽共價地 連接的滲透性增強(qiáng)部分。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的肽，其中所述接頭由1-5個氨基酸殘基組成。11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的肽，其中所述滲透性增強(qiáng)部分被連接到所述肽的N末端。12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的肽，其中所述滲透性增強(qiáng)部分通過包含至少1個氨基酸殘基 的接頭被連接。13. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的肽，其中所述接頭是甘氨酸(Gly)殘基。14. 根據(jù)權(quán)利要求9-13中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述滲透性增強(qiáng)部分是脂肪酸殘基。15. 根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述羧基末端被?；?、酰胺化、還原或 酯化。16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，所述肽還包含三肽天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸(Asp-Arg-Tyr)或其類似物。17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述肽是環(huán)狀的。18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述序列RPY選自由以下組成的組： i. Arg-Pr〇-Tyr； ii. Arg-Pr〇-35dITyr； iii. hArg-Pr〇-Tyr； iv·hArg-Pro_35dITyr;和 v.hArg-4Hyp-Tyr 其中hArg是高精氨酸;35dITyr是3，5-二碘酪氨酸并且4Hyp是4-羥基脯氨酸。19. 一種肽綴合物，所述肽綴合物包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽和能夠增加滲透性的部 分，其中所述肽綴合物按照式I: i.Z-X-R-P-Y-B (式I) 其中Z表示經(jīng)由直接的鍵或經(jīng)由接頭共價地連接的能夠增加滲透性的部分，X表示除了 甲硫氨酸之外的天然的或合成的氨基酸殘基，或X可不存在，R是精氨酸殘基或修飾的R殘 基，P是脯氨酸殘基或修飾的脯氨酸殘基，Y是酪氨酸殘基或修飾的酪氨酸殘基，并且B表示 末端羧酸基、酰胺基、酯基或醇基。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽綴合物，其中X是正亮氨酸(Nor)殘基。21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽綴合物，其中R選自由精氨酸殘基、高精氨酸殘基(hArg)、 N-甲基精氨酸殘基(匪eArg)、瓜氨酸殘基和2-氨基-3-胍基丙酸殘基組成的組;P選自由脯 氨酸殘基、羥基脯氨酸殘基和噻唑烷-羧酸酯殘基組成的組，且Y選自由酪氨酸殘基、3,5二 碘酪氨酸殘基(35dITyr)、3,5二溴酪氨酸殘基(35dBTyr)和高酪氨酸殘基組成的組。22. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽綴合物，其中Z表示豆蔻酰-甘氨酸(Myr-Gly)，X是正亮氨 酸(Nle)殘基，R是精氨酸殘基或高精氨酸殘基(hArg)，P是脯氨酸殘基或4-羥基-脯氨酸殘 基(4HyP)，Y是酪氨酸殘基或(3,5-二碘)酪氨酸(35(111 7〇殘基，并且8是末端，表示末端羧 酸基、酰胺基、酯基或醇基。23. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽綴合物，所述肽綴合物包含至少一個非天然的滲透性增 強(qiáng)部分。24. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽綴合物，所述肽綴合物包含選自由以下組成的組的肽： Gly-Arg-Pr〇-Tyr-NH2(SEQ ID NO:5)； Gly-Nle-Arg-Pr〇-Tyr-NH2(SEQ ID N0:6)； Gly-Nle-Arg-Pr〇-35dITyr-NH2(SEQ ID N0:7)； Gly-Nle-hArg-Pr〇-Tyr-NH2(SEQ ID N0:8)； Gly-Nle-hArg-Pr〇-35dITyr-NH2(SEQIDN0:9)jP Gly-Nle-hArg-4HyP-Tyr(SEQ ID N0:10)。25. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽綴合物，所述肽綴合物選自由以下組成的組： Myr-Gly-Arg-Pr〇-Tyr-NH2(SEQ ID NO:11)； Myr-Gly-Nle-Arg-Pr〇-Tyr-NH2(SEQ ID NO:12)； Myr-Gly-Nle-Arg-Pr〇-35dITyr-NH2(SEQ ID NO:13)； Myr-Gly-Nle-hArg-Pr〇-Tyr-NH2(SEQ ID NO:14)； Myr-Gly-Nle-hArg-Pr〇-35dITyr-NH2(SEQIDN0:15)4P Myr-Gly-Nle-hArg-4HyP-Tyr(SEQ ID N0:16)。26. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一 項(xiàng)所述的肽和藥學(xué)上可接受的載體。27. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求19-25中任一 項(xiàng)所述的肽綴合物和藥學(xué)上可接受的載體。28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述肽綴合物選自由以下組成的組： Myr-Gly-Arg-Pr〇-Tyr-NH2(SEQ ID NO:11)； Myr-Gly-Nle-Arg-Pr〇-Tyr-NH2(SEQ ID NO:12)； Myr-Gly-Nle-Arg-Pr〇-35dITyr-NH2(SEQ ID NO:13)； Myr-Gly-Nle-hArg-Pr〇-Tyr-NH2(SEQ ID NO:14)； Myr-Gly-Nle-hArg-Pr〇-35dITyr-NH2(SEQIDN0:15)jP Myr-Gly-Nle-hArg-4HyP-Tyr(SEQ ID N0:16)。29. 根據(jù)權(quán)利要求26至28中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，用于預(yù)防或治療其中發(fā)生血液 供應(yīng)不足或與內(nèi)皮功能異常相關(guān)的狀況或通過S1P受體介導(dǎo)的狀況。30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其中所述狀況選自由以下組成的組:外周血管 疾病、心肌缺血、組織移植、冠狀動脈疾病、中風(fēng)、和延遲的傷口愈合、肺病、眼病、骨質(zhì)流失 和與嚴(yán)重感染相關(guān)的病理狀況。31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其中所述肺病選自由以下組成的組:急性肺損 傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和通氣誘發(fā)的肺損傷(VILI)。32. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其中所述眼病是年齡相關(guān)的黃斑病變(AMD)。33. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其中所述與嚴(yán)重感染相關(guān)的病理狀況是膿毒 癥。34. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其中所述狀況的特征為胰腺細(xì)胞功能不足。35. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其中所述狀況是糖尿病或胰島移植。36. 根據(jù)權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述載體適合于通過吸入施 用。37. 根據(jù)權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述藥物組合物為調(diào)節(jié)釋放的組 合物的形式。38. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的調(diào)節(jié)釋放的藥物組合物，其中所述組合物為選自由以下組 成的組的形式:可生物降解的微球、非可生物降解的微球、植入物、可植入的棒、可植入的膠 囊、可植入的環(huán)、延長釋放的凝膠或易受侵蝕的基質(zhì)。39. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的藥物組合物，所述藥物組合物用于與另一種刺激血管發(fā)生 的劑一起施用。40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的藥物組合物，其中所述刺激血管發(fā)生的劑選自由以下組成 的組:血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)和干細(xì)胞因子(SCF)。41. 根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的促血管發(fā)生的肽用于制備用于預(yù)防或治療其 中發(fā)生血液供應(yīng)不足或與內(nèi)皮功能異常相關(guān)的狀況的藥物中的用途。42. -種預(yù)防或治療其中發(fā)生血液供應(yīng)不足的狀況、與內(nèi)皮功能異常相關(guān)的狀況、或通 過S1P受體介導(dǎo)的狀況的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用根據(jù)權(quán)利要求26-28中 任一項(xiàng)所述的藥物組合物。43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述狀況選自由以下組成的組：外周血管疾病、 心肌缺血、組織移植、冠狀動脈疾病、中風(fēng)、糖尿病、胰島移植、和延遲的傷口愈合、肺病、目艮 病和與嚴(yán)重感染相關(guān)的病理狀況。44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述肺病選自由以下組成的組：急性肺損傷 (ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和通氣誘發(fā)的肺損傷(VILI)。45. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述眼病是年齡相關(guān)的黃斑病變(AMD)。46. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述與嚴(yán)重感染相關(guān)的病理狀況是膿毒癥。47. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述狀況的特征為胰腺細(xì)胞功能不足。48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述狀況是骨質(zhì)疏松癥。49. 一種支架，所述支架包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的肽或肽綴合 物。50. -種預(yù)防或治療心肌感染或冠狀動脈疾病的方法，所述方法包括向需要其的受試 者施用根據(jù)權(quán)利要求49所述的支架。
【文檔編號】A61P11/00GK105873944SQ201480069919
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年12月17日
【發(fā)明人】施姆爾·本－賽森, 哈達(dá)斯·路維尼
【申請人】耶路撒冷希伯來大學(xué)伊森姆研究發(fā)展有限公司