檢測副溶血性弧菌的方法及其單抗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種檢測副溶血性弧菌的方法、用于該方法的兩株由同一次單克隆抗體制備過程產(chǎn)生的抗副溶血性弧菌的單克隆抗體，該單克隆抗體可特異性地與副溶血性弧菌結(jié)合。它由小鼠雜交瘤細(xì)胞系3G9E9G3H7，CGMCC No.8003或3G9F7D5C9，CGMCC No.9010所產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了抗副溶血性弧菌的單克隆抗體的用途。CGMCC No.80032013.07.16CGMCC No.90102014.04.10
【專利說明】檢測副溶血性弧菌的方法及其單抗

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種檢測副溶血性弧菌的方 法、用于該方法的兩株抗副溶血性弧菌單克隆抗體以及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。

【背景技術(shù)】
[0002] 副溶血性弧菌（Bibrio parahemolyticus)又稱為副溶血弧菌，屬于弧菌屬，是一 種常見的病原菌。副溶血性弧菌是一種嗜鹽性的革蘭氏陰性菌，主要的棲息地在海水中。如 果食用了遭此菌污染的海鮮，會引發(fā)食物中毒；臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣 便為主要癥狀。
[0003] 目前副溶血性弧菌的檢測主要依賴于國標(biāo)所規(guī)定的生化鑒定，其缺點是操作繁 瑣、檢測周期較長，無法適應(yīng)大量的樣品篩查。免疫學(xué)檢測是近年來出現(xiàn)的最快速、準(zhǔn)確、穩(wěn) 定的快速檢測手段，但是檢測產(chǎn)品全部依賴進(jìn)口，我國目前尚無擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)，且 可運用于檢測實踐的快速檢測產(chǎn)品，該專利以副溶血性弧菌為檢測靶標(biāo)，所要求保護(hù)的技 術(shù)涉及副溶血性弧菌快速檢測產(chǎn)品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種體外檢測副溶血性弧菌的方法。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的是提供用于上述方法的兩株由同一次單克隆抗體制備過程 產(chǎn)生的可特異性地結(jié)合于副溶血性弧菌不同抗原位點的單克隆抗體。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是提供產(chǎn)生上述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
[0007] 本發(fā)明的第一方面是提供了一種體外檢測副溶血性弧菌的方法，包括以下步驟：
[0008] (a)將待測樣品加樣于包被有捕捉抗體的固相載體，從而使待測樣品中的副溶血 性弧菌與固相載體上的捕捉抗體結(jié)合，形成帶有"副溶血性弧菌-捕捉抗體"二元復(fù)合物的 固相載體；所述的捕捉抗體是特異性地結(jié)合于副溶血性弧菌的單克隆抗體3G9F7D5C9,所 述的單克隆抗體3G9F7D5C9由小鼠雜交瘤細(xì)胞系3G9F7D5C9, CGMCC No. 9010產(chǎn)生；
[0009] (b)將檢測抗體加樣于（a)獲得的固相載體，從而形成帶有"檢測抗體-副溶 血性弧菌-捕捉抗體"三元復(fù)合物的固相載體；所述的檢測抗體是特異性地結(jié)合于副溶 血性弧菌的單克隆抗體3G9E9G3H7，所述的單克隆抗體3G9E9G3H7由小鼠雜交瘤細(xì)胞系 3G9E9G3H7，CGMCC No. 8003產(chǎn)生，且所述的單克隆抗體3G9E9G3H7攜帶一可檢測標(biāo)記物； 和
[0010] (C)檢測三元復(fù)合物中的可檢測標(biāo)記物，從而確定待測樣品中副溶血性弧菌的存 在與否以及存在的量。
[0011] 在一優(yōu)選例中，所述的固相載體為酶標(biāo)反應(yīng)板。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測標(biāo)記物為辣根過氧化物酶。
[0013] 本發(fā)明的第二方面是提供了一種免疫球蛋白，它是特異性地結(jié)合于副溶血性弧菌 的單克隆抗體，它由小鼠雜交瘤細(xì)胞系3G9F7D5C9, CGMCC No. 9010所產(chǎn)生。
[0014] 本發(fā)明的第三方面是提供了一種產(chǎn)生上述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，它是小鼠雜 交瘤細(xì)胞系 3G9F7D5C9, CGMCC No. 9010。
[0015] 本發(fā)明的第四方面是提供了上述免疫球蛋白的用途，它被用于檢測副溶血性弧 菌。
[0016] 本發(fā)明的第五方面是提供了一種免疫球蛋白，它是特異性地結(jié)合于副溶血性弧菌 的單克隆抗體，它由小鼠雜交瘤細(xì)胞系3G9E9G3H7, CGMCC No. 8003所產(chǎn)生。
[0017] 本發(fā)明的第六方面是提供了一種產(chǎn)生上述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，它是小鼠雜 交瘤細(xì)胞系 3G9E9G3H7, CGMCC No. 8003。
[0018] 本發(fā)明還提供了上述免疫球蛋白的用途，它被用于檢測副溶血性弧菌。
[0019] 本發(fā)明各個方面的細(xì)節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過下文以及權(quán)利要求 的描述，本發(fā)明的特點、目的和優(yōu)勢將更為明顯。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1本發(fā)明的單克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖
[0021] Lane I : 3G9F7D5C9，Lane2 : 3G9E9G3H7。

【具體實施方式】
[0022] 單克隆抗體
[0023] 本發(fā)明人的研究表明，以副溶血性弧菌作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，分離純 化得到兩株抗副溶血性弧菌單克隆抗體3G9E9G3H7和3G9F7D5C9，其抗體效價可達(dá)到 1:100000,其能夠特異性、高效地與副溶血性弧菌結(jié)合，與單增李斯特、豬霍亂沙門、鼠傷寒 沙門、腸炎沙門、福氏志賀、宋內(nèi)氏志賀、鮑氏志賀、大腸桿菌0157: H7、阪崎腸桿菌、小腸耶 爾森氏菌、肺炎鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等共計77種病原細(xì)菌均無交叉反應(yīng)。
[0024] 本發(fā)明提供了抗副溶血性弧菌單克隆抗體。本發(fā)明的抗副溶血性弧菌單克隆抗體 可以利用小鼠雜交瘤細(xì)胞系 3G9E9G3H7(CGMCC No. 8003)或 3G9F7D5C9(CGMCC No. 9010)分 泌產(chǎn)生。本發(fā)明包括具有抗副溶血性弧菌單克隆抗體3G9E9G3H7和3G9F7D5C9的相應(yīng)氨基 酸序列的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物。具 體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)（互補決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì) 偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物（即免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物），只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈 和重鏈的超變區(qū)相同或至少90%同源性，較佳地至少95%同源性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所 知，免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物包括：藥物、毒素、細(xì)胞因子（cytokine)、放射性核素、酶和 其他診斷或治療分子與抗副溶血性弧菌單克隆抗體或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。本發(fā) 明還包括與抗副溶血性弧菌單克隆抗體或其片段結(jié)合的細(xì)胞表面標(biāo)記物或抗原。
[0025] 對于本發(fā)明的抗副溶血性弧菌單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方 法測定?？垢比苎曰【鷨慰寺】贵wV鏈的超變區(qū)或互補決定區(qū)（complementarity determining region,⑶R)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結(jié)合抗原。因此，本 發(fā)明包括那些具有帶⑶R的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其⑶R與抗副溶血 性弧菌單克隆抗體⑶R具有90%以上（較佳地95%以上）的同源性。本發(fā)明不僅包括完 整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或（Fab ')2片段；抗體重鏈；抗 體輕鏈。
[0026] 本發(fā)明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以 用常規(guī)技術(shù)，利用雜交瘤細(xì)胞系3G9E9G3H7(CGMCC No. 8003)或3G9F7D5C9(CGMCC No. 9010) 獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
[0027] -旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0028] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通 過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
[0029]目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白（或其片段，或其衍生 物）的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中己知的各種現(xiàn)有的DNA分子（或如載 體）和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
[0030] 本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體。這 些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0031] 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。
[0032] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如出血性大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法 處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電 穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可運用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常 規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
[0033] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)） 誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
[0034] 在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、 用蛋白沉淀劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析（凝膠過 濾）、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法 的結(jié)合。
[0035] 本發(fā)明的抗副溶血性弧菌單克隆抗體3G9E9G3H7和3G9F7D5C9,其效價高（可以達(dá) 到1:100000)，能夠特異性地、高效地檢測副溶血性弧菌，與單增李斯特、豬霍亂沙門、鼠傷 寒沙門、腸炎沙門、福氏志賀、宋內(nèi)氏志賀、鮑氏志賀、大腸桿菌0157: H7、阪崎腸桿菌、小腸 耶爾森氏菌、肺炎鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等共計77種病原細(xì)菌均無交叉反應(yīng)，此為本發(fā)明 的最大創(chuàng)新點。上述單克隆抗體3G9E9G3H7可以用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、納米金 顆粒標(biāo)記，專一性地作為檢測抗體使用。上述單克隆抗體3G9F7D5C9在各種檢測運用中，可 專一性地作為捕捉抗體使用。
[0036] 檢測試劑盒
[0037] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究和試驗，意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用小鼠雜交瘤細(xì)胞系 3G9F7D5C9(CGMCC No. 9010)所產(chǎn)生的抗副溶血性弧菌單克隆抗體作為捕捉抗體捕獲副溶 血性弧菌后，再用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記的由小鼠雜交瘤細(xì)胞系3G9E9G3H7(CGMCC No. 8003) 所產(chǎn)生的抗副溶血性弧菌單克隆抗體作為檢測抗體，可以極其有效地結(jié)合于副溶血性弧 菌，從而通過雙抗夾心法高靈敏度地檢測副溶血性弧菌。
[0038] 如本文所用，所述的"樣品"是指食品、人畜糞便、嘔吐物等物質(zhì)，包括但不限于：血 清、血漿、糞便、食品等的增菌液。優(yōu)選的，所述的樣品是食品。
[0039] 如本文所用，所述的"捕捉抗體"、"包被抗體"、"第一抗體"與"一抗"可互換使 用，都是指所述的可特異性地結(jié)合于副溶血性弧菌的單克隆抗體，其由小鼠雜交瘤細(xì)胞系 3G9F7D5C9, CGMCC No. 9010 產(chǎn)生。
[0040] 所述的捕捉抗體可被包被在固相載體上。本發(fā)明對所采用的固相載體沒有特別的 限制，只要其能夠與捕捉抗體相偶聯(lián)（連接）即可。例如，所述的固相載體為酶標(biāo)反應(yīng)板。
[0041] 如本文所用，所述的"檢測抗體"、"第二抗體"、"酶標(biāo)抗體"與"二抗"可互換使 用，都是指可特異性結(jié)合于副溶血性弧菌的另一株單克隆抗體，其由小鼠雜交瘤細(xì)胞系 3G9E9G3H7, CGMCC No. 8003 產(chǎn)生。
[0042] 如本文所用，所述的"特異性"是指抗體只能結(jié)合于副溶血性弧菌；更特別地，指那 些能與副溶血性弧菌結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。
[0043] 本發(fā)明人進(jìn)而根據(jù)雙抗夾心法的原理，制備了一種可用于檢測樣品中副溶血性弧 菌的酶聯(lián)免疫試劑盒。雙抗夾心法常規(guī)的做法是將捕捉抗體固定于載體，然后捕捉抗體與 抗原反應(yīng)，洗滌后再與檢測抗體反應(yīng)（所述的檢測抗體攜帶可檢測標(biāo)記物，或可與攜帶可 檢測標(biāo)記物的物質(zhì)結(jié)合），最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測信號。并且，相對于單抗 體的競爭法來說，雙抗體夾心法的測定效果更為優(yōu)良，因而測定時只需很少的樣品量。所以 采用雙抗體夾心法無論在靈敏度、精確度、準(zhǔn)確度、特異性及穩(wěn)定性上更具有優(yōu)勢。
[0044] 具體而言，本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒含有：
[0045] (a)酶標(biāo)反應(yīng)板，所述的酶標(biāo)反應(yīng)板上包被有作為捕捉抗體的抗副溶血性弧菌單 克隆抗體3G9F7D5C9,所述的抗副溶血性弧菌單克隆抗體由小鼠雜交瘤細(xì)胞系3G9F7D5C9， CGMCC No. 9010 產(chǎn)生；
[0046] (b)容器a，所述的容器a中裝有作為檢測抗體的抗副溶血性弧菌單克隆抗體 3G9E9G3H7，所述的抗副溶血性弧菌單克隆抗體由小鼠雜交瘤細(xì)胞系3G9E9G3H7，CGMCC No. 8003 產(chǎn)生。
[0047] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的檢測抗體帶有可檢測的標(biāo)記物。
[0048] 如本文所用，所述的"可檢測的標(biāo)記物"是指用于確定待檢測樣品中副溶血性弧菌 的存在與否以及存在的量的標(biāo)志物。在確定了本發(fā)明的試劑盒所采用的捕捉抗體和/或檢 測抗體后，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)用于與檢測抗體結(jié)合來進(jìn)行檢測的各種標(biāo)記物。本發(fā)明對 所采用的標(biāo)記物沒有特別的限制，只要是能夠與所述的檢測抗體結(jié)合，且在適當(dāng)處理后能 夠準(zhǔn)確地指示待檢測樣品中副溶血性弧菌的存在與否以及存在量的標(biāo)記物均是可用的。所 述的標(biāo)記物可直接被設(shè)置于檢測抗體上；或者，所述的標(biāo)記物也可被設(shè)置于特異性抗檢測 抗體的抗抗體上，本領(lǐng)域人員可根據(jù)所采用的抗體的種類和特性，選擇適宜的標(biāo)記物。例 如，所述的標(biāo)記物可以選自：辣根過氧化物酶（HRP)、堿性磷酸醋酶（AP)、葡萄糖氧化酶、 3 -D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0049] 當(dāng)采用如上所示的一些酶標(biāo)記物時，還需要采用一些與相應(yīng)的酶結(jié)合的底物，從 而可通過顯色等方式來報導(dǎo)標(biāo)記物的存在情況或者存在量。如本文所用，所述的"與標(biāo)記 物相對應(yīng)的底物"是指可被標(biāo)記物所催化顯色，用于顯示檢測抗體與副溶血性弧菌發(fā)生結(jié) 合的識別信號。所述的底物例如：用于辣根過氧化物酶的鄰苯二肢（OPD)、四甲基聯(lián)苯肢 (TMB)、ABTS ;用于堿性磷酸酯酶的對硝基苯磷酸醋（p-nitro phenyl phosphate, p-NPP)等 等。本領(lǐng)域人員可根據(jù)所采用的標(biāo)記物的種類和特性，選擇適宜的底物。
[0050] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的檢測抗體與標(biāo)記物直接相連接。更優(yōu)選地，所述的 標(biāo)記物是HRP。與以生物素標(biāo)記檢測抗體、反應(yīng)后再與鏈親和素HRP反應(yīng)相比較，直接在檢 測抗體上標(biāo)記HRP、反應(yīng)結(jié)束后直接加底物顯色更為簡單便捷。
[0051] 為了獲得定量結(jié)果，還可以在檢測過程中設(shè)置含己知濃度的多個副溶血性弧菌的 標(biāo)準(zhǔn)品。對于標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)置方法可采用常規(guī)的方法。
[0052] 為了消除假陽性和假陰性，也可在檢測過程中設(shè)置質(zhì)控（對照）。作為本發(fā)明的優(yōu) 選方式，所述的陽性對照為滅活的副溶血性弧菌菌液，所述的陰性對照為3%氯化鈉堿性蛋 白胨水（APW)。
[0053] 此外，為了使本發(fā)明的試劑盒在檢測時更方便，所述的試劑盒中優(yōu)選的還包含其 它一些輔助試劑，所述的輔助試劑是ELISA試劑盒中常規(guī)使用的一些試劑，這些試劑的特 性以及它們的配制方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。所述的試劑例如（但不限于）：顯 色劑、洗滌液、終止液、增菌液、稀釋液。
[0054] 此外，在所述試劑盒中還可包含使用說明書，用于說明其中裝載的試劑的使用方 法。
[0055] 本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測原理及有益效果如下：
[0056] 本發(fā)明的試劑盒采用的是雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法。當(dāng)在酶標(biāo)反應(yīng)板上預(yù)包被有抗 副溶血性弧菌單克隆抗體（捕捉抗體），加入樣品溶液或標(biāo)準(zhǔn)品后，再加入帶有可檢測的標(biāo) 記物如辣根過氧化物酶的另一株抗副溶血性弧菌單克隆抗體（檢測抗體），樣品或標(biāo)準(zhǔn)品 中存在的副溶血性弧菌就會與酶標(biāo)反應(yīng)板上包被的捕捉抗體相結(jié)合，待加入檢測抗體后， 會形成"抗體一抗原一酶標(biāo)抗體"復(fù)合物，經(jīng)過TMB (四甲基聯(lián)苯胺）顯色后會形成黃色物 質(zhì)，從而可判斷樣品中副溶血性弧菌的存在與否以及存在的量。
[0057] 用酶標(biāo)儀于450nm下測定吸光度值。陰性對照彡0. 1、陽性對照彡0. 3,實驗結(jié)果 有效，否則結(jié)果判定為無效；檢測孔OD值> 0. 2時，判定為陽性；檢測孔OD值介于0. 1-0. 2 之間時，判定為弱陽性；檢測孔OD值< 0. 1判定為陰性。
[0058] 試驗表明，本發(fā)明的副溶血性弧菌酶聯(lián)免疫試劑盒，有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度。板 間誤差小于5%，板內(nèi)CV小于3%。與單增李斯特、豬霍亂沙門、鼠傷寒沙門、腸炎沙門、福 氏志賀、宋內(nèi)氏志賀、鮑氏志賀、大腸桿菌〇157:H7、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、肺炎鏈球 菌、蠟樣芽孢桿菌等共計77種病原細(xì)菌均無交叉反應(yīng)，此為本發(fā)明的最大創(chuàng)新點。
[0059] 總之，本發(fā)明的試劑盒對樣品的前處理要求低，操作簡便，檢測極限為105cfu/ml， 特異性和穩(wěn)定性好，并與大多數(shù)食源性致病菌都沒有交叉反應(yīng)。
[0060] 檢測方法
[0061] 本發(fā)明還提供了一種利用本發(fā)明的試劑盒體外檢測副溶血性弧菌的方法，包括以 下步驟：
[0062] (a)將待測樣品加樣于包被有捕捉抗體的固相載體，從而使待測樣品中的副溶血 性弧菌與固相載體上的捕捉抗體結(jié)合，形成帶有"副溶血性弧菌-捕捉抗體"二元復(fù)合物的 固相載體；所述的捕捉抗體是特異性地結(jié)合于副溶血性弧菌的單克隆抗體3G9F7D5C9,所 述的單克隆抗體3G9F7D5C9由小鼠雜交瘤細(xì)胞系3G9F7D5C9, CGMCC No. 9010產(chǎn)生；
[0063] (b)將檢測抗體加樣于（a)獲得的固相載體，從而形成帶有"檢測抗體-副溶 血性弧菌-捕捉抗體"三元復(fù)合物的固相載體；所述的檢測抗體是特異性地結(jié)合于副溶 血性弧菌的單克隆抗體3G9E9G3H7，所述的單克隆抗體3G9E9G3H7由小鼠雜交瘤細(xì)胞系 3G9E9G3H7, CGMCC No. 8003產(chǎn)生，且所述的單克隆抗體3G9E9G3H7攜帶一可檢測標(biāo)記物；和
[0064] (C)檢測三元復(fù)合物中的可檢測標(biāo)記物，從而確定待檢測樣品中副溶血性弧菌的 存在與否以及存在的量。
[0065] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，定量檢測副溶血性弧菌的方法具體如下：
[0066] ( i )抗原抗體反應(yīng)：將本發(fā)明的捕捉抗體包被在多孔板上，之后在多孔板的微孔 內(nèi)分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品（可選），或待測樣品；
[0067] ( ii )酶聯(lián)反應(yīng)：將檢測抗體（其上設(shè)置有標(biāo)記物）溶液加入各孔，振蕩、孵育、洗 滌；
[0068] (iii)顯色反應(yīng)：每孔加入對應(yīng)于標(biāo)記物的底物、顯色劑，孵育，每孔加入反應(yīng)終止 液，結(jié)束反應(yīng)：
[0069] ( iv )酶標(biāo)儀測定OD值：
[0070] ( V )結(jié)果計算：
[0071] A)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：以副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測定OD值為縱坐 標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0072] B)評判質(zhì)控品濃度（可選）：根據(jù)質(zhì)控品的OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出相應(yīng)的濃度 值；質(zhì)控品測定濃度值處于給定范圍時，該次測定有效；
[0073] C)計算待測樣品濃度：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控品均被判定有效時，根據(jù)待測樣本的OD 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品的副溶血性弧菌濃度。
[0074] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩嶒炇抑改希∟ew York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。
[0075] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0076] 實施例1.抗副溶血性弧菌單克隆抗體3G9E9G3H7和3G9F7D5C9的制備
[0077] -、免疫原和陽性標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備
[0078] 副溶血性弧菌（ATCC No. 17802)接種于3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW)，37°C、 150r/min振蕩培養(yǎng)17h，計數(shù)，加入0. 3%甲醛溶液室溫滅活1天。用生理鹽水調(diào)整副溶血 性弧菌（ATCC No. 17802)濃度至5 X 109cfu/ml作為免疫原；用生理鹽水調(diào)整濃度為IO8Cfu/ ml作為陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品，3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW)為陰性對照標(biāo)準(zhǔn)品。
[0079] 二、單克隆抗體的制備
[0080] 1)實驗動物：選3只8周齡，體重20g左右、雌性Balb/c小鼠為實驗動物。
[0081] 2)免疫方法：每只小鼠腹腔注射0. 2ml免疫原，每間隔2周用同樣劑量加強注射 一次。
[0082] 3)采血：3次加強免疫后從尾部靜脈采血，采用間接非競爭酶聯(lián)免疫法測定抗血 清效價。待效價不再上升，腹腔注射同樣量免疫原，3天后按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0083] 4)細(xì)胞融合：取免疫小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在50%PEG作用下常規(guī)融 合，分別接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0084] 5)雜交瘤細(xì)胞篩選：采用間接非競爭酶聯(lián)免疫法，篩選強陽性孔的雜交瘤細(xì)胞， 將其轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板。
[0085] 6)克隆培養(yǎng)及抗體制備：用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至鋪滿孔 底1/10時，再用同樣方法檢測，將強陽性孔再克隆，如此反復(fù)3 - 4次，直至陽性率達(dá)到 100 %。將雜交瘤細(xì)胞擴大培養(yǎng)，注射于經(jīng)石蠟油預(yù)處理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6個 雜交瘤細(xì)胞，7?10天小鼠腹部隆起，活體穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸銨法從小鼠腹水中 純化抗體。
[0086] 三、單克隆抗體的效價測定
[0087] 副溶血性弧菌培養(yǎng)基如下：國標(biāo)：GB/T 4789. 7-2008
[0088] 3 %氯化鈉堿性蛋白胨水（APW)
[0089] 成分：蛋白胨10. 0g，氯化鈉30. 0g，蒸餾水1000. OmL
[0090] 制法：將上述成分混合，調(diào)節(jié)pH8. 5±0. 2,121°C高壓滅菌lOmin。
[0091] 單克隆抗體效價測定的步驟如下：
[0092] (1)將飽和培養(yǎng)細(xì)菌抗原連同培養(yǎng)基在對應(yīng)的孔中加入100 yl，4°C過夜（約包板 36h)。
[0093] (2)倒空液體并拍干殘留液體，用250 ill洗滌液清洗3次。
[0094] (3)每個孔中加 lOOiill% BSA，37°C 封閉 lh。
[0095] (4)倒空液體并拍干殘留液體，用250 ill洗滌液清洗3次。
[0096] (5)每個孔中加 IOOiil血清，37°C孵育lh。
[0097] (6)倒空液體并拍干殘留液體，每個孔中加250 ii IPBST洗滌液洗滌3次。
[0098] (7)每個孔中50 ill的HRP標(biāo)記的二抗（sigma)，室溫孵育lh。
[0099] (8)用洗滌液浸泡5min，倒空液體并拍干殘留液體，每個孔中加250 ii IPBST洗滌 液洗滌3次。
[0100] (9)每個孔中加100 ill底物，顯色30min，加終止液100 ill并立即在OD45tl讀數(shù)。
[0101] 表1.兩株單克隆抗體效價測定結(jié)果（OD45tl)
[0102]

【權(quán)利要求】
1. 一種體外檢測副溶血性弧菌的方法，包括以下步驟： (a) 將待測樣品加樣于包被有捕捉抗體的固相載體，從而使待測樣品中的副溶血性弧 菌與固相載體上的捕捉抗體結(jié)合，形成帶有"副溶血性弧菌-捕捉抗體"二元復(fù)合物的固相 載體；所述的捕捉抗體是特異性地結(jié)合于副溶血性弧菌的單克隆抗體3G9F7D5C9,所述的 單克隆抗體3G9F7D5C9由小鼠雜交瘤細(xì)胞系3G9F7D5C9, CGMCC No. 9010產(chǎn)生； (b) 將檢測抗體加樣于（a)獲得的固相載體，從而形成帶有"檢測抗體-副溶血性弧 菌-捕捉抗體"三元復(fù)合物的固相載體；所述的檢測抗體是特異性地結(jié)合于副溶血性弧菌 的單克隆抗體3G9E9G3H7,所述的單克隆抗體3G9E9G3H7由小鼠雜交瘤細(xì)胞系3G9E9G3H7， CGMCC No. 8003產(chǎn)生，且所述的單克隆抗體3G9E9G3H7攜帶一可檢測標(biāo)記物；和 (c) 檢測三元復(fù)合物中的可檢測標(biāo)記物，從而確定待測樣品中副溶血性弧菌的存在與 否以及存在的量。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固相載體為酶標(biāo)反應(yīng)板。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可檢測標(biāo)記物為辣根過氧化物酶。
4. 一種免疫球蛋白，它是特異性地結(jié)合于副溶血性弧菌的單克隆抗體，其特征在于，它 由小鼠雜交瘤細(xì)胞系3G9F7D5C9, CGMCC No. 9010所產(chǎn)生。
5. -種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，它是小鼠雜交瘤細(xì)胞系 3G9F7D5C9, CGMCC No. 9010。
6. -種如權(quán)利要求4所述的免疫球蛋白的用途，其特征在于，它被用于檢測副溶血性 弧菌。
7. -種免疫球蛋白，它是特異性地結(jié)合于副溶血性弧菌的單克隆抗體，其特征在于，它 由小鼠雜交瘤細(xì)胞系3G9E9G3H7, CGMCC No. 8003所產(chǎn)生。
8. -種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，它是小鼠雜交瘤細(xì)胞系 3G9E9G3H7, CGMCC No. 8003〇
9. 一種如權(quán)利要求7所述的免疫球蛋白的用途，其特征在于，它被用于檢測副溶血性 弧菌。
【文檔編號】C07K16/12GK104360066SQ201410609247
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】劉箐, 丁承超 申請人:上海理工大學(xué)