富集tdh致病性副溶血性弧菌免疫磁珠制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種病原菌免疫磁珠的制備和應(yīng)用，特別涉及用于富集產(chǎn)耐熱直接溶 血素（TDH)的致病性副溶血性弧菌的免疫磁珠的制備方法及應(yīng)用，它是以磁珠為載體，免疫 兔子制備的多克隆抗體為中間識別體，經(jīng)過偶聯(lián)-洗滌的過程制備出免疫磁珠，在合適的 條件下可以高效捕獲產(chǎn)TDH的致病性副溶血性弧菌，可廣泛應(yīng)用于環(huán)境及進(jìn)出口食品檢驗 中致病性副溶血性弧菌的富集分離與檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 副溶血性弧菌是引起世界上很多國家尤其是沿海地區(qū)食源性疾病的重要病原菌， 其廣泛存在于近海岸的海水、海底沉積物和魚蝦類、貝類。其引起的食物中毒癥狀主要是以 腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱等為主的急性胃腸炎。目前，由副溶血性弧菌引起的臨床病例 已在數(shù)量上超過沙門氏菌引起的臨床病例，成為我國首要的食源性病原菌，特別是一些沿 海城市，由該菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的比例尚達(dá)60%以上。
[0003] 研究顯示只有攜帶毒力因子的菌株才具有致病性。但是大量研究表明，幾乎所有 從海水和水產(chǎn)品中分離的副溶血性弧菌是不產(chǎn)毒的菌株，雖然此類菌株也有引起食物中毒 的報道，但絕大部分是不致病的。而且隨著檢測技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用證實，致病性副溶血性弧 菌的確在環(huán)境及食品中的含量較低，致病性菌株和非致病性菌株差異懸殊的混合分布于沿 岸海水、海河交界處及海產(chǎn)品中，致病性菌株僅占1/100-1/1000。利用傳統(tǒng)的平板分離方法 從環(huán)境及食品中分離的副溶血弧菌大多數(shù)為非致病性菌株，很難分離到致病性菌株。但是 臨床病人中分離的副溶血性弧菌超過90%都是致病性菌株。
[0004] 不針對致病性副溶血性弧菌的監(jiān)測就不能有效預(yù)警和控制食物中毒的發(fā)生。 1997年在美國的太平洋西北岸以及 1998年在美國的牡蠣海灣都發(fā)生了因食用牡蠣所致 的副溶血性弧菌暴發(fā)病例，流行病學(xué)調(diào)查表明食用的樣品中檢測到的副溶血性弧菌總數(shù) 小于200cfu/g，按照FDA標(biāo)準(zhǔn)這個結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于IX104cfu/g，屬于"正常的合格樣品"。 Kara-Kudo等人的研究也證實海產(chǎn)品中總的副溶血性弧菌的量并不能正確反映致病性副溶 血性弧菌的情況，致病性副溶血性弧菌的量與較高的總的副溶血性弧菌的量之間并沒有直 接關(guān)系，因為在檢測到的TDH陽性的樣品中，其總的副洛血性弧囷的量小于1X104cfu/g，這 提示，總的副溶血性弧菌并不是預(yù)測致病性副溶血性弧菌的一個可靠的指標(biāo)[5]。因此，建立 針對致病性副溶血性弧菌的檢測方法對于預(yù)防和控制食源性疾病有重要的意義。
[0005] 分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，致病性副溶血性弧菌中主要毒力因子是耐熱直接溶血素 (TDH)，超過90%的致病性菌株攜帶TDH，只有很少致病性菌株攜帶耐熱直接溶血素相關(guān)溶 血素（TRH)，因此通常將TDH作為鑒定致病性副溶血性弧菌的標(biāo)記。目前，用于致病性副溶 血性弧菌檢測的方法主要是分子檢測，比較常見的有常規(guī)PCR，實時熒光PCR以及基因芯 片，這些檢測方法具有高靈敏度，操作簡單，高特異性和高通量等優(yōu)點，但是這些方法只能 對其進(jìn)行定性分析，不能做到分離致病性副溶血性弧菌，不利于對其的深入研究。
[0006] 本研究即在此基礎(chǔ)上，表達(dá)純化毒力因子TDH，制備多克隆抗體，免疫磁珠，富集攜 帶TDH的副溶血性弧菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在提供一種富集TDH致病性副溶血性弧菌免疫磁珠制備方法及應(yīng)用。主 要解決目前檢測方法只能對其進(jìn)行定性分析，不能做到分離致病性副溶血性弧菌的技術(shù)問 題。本發(fā)明的思路是：利用產(chǎn)耐熱直接溶血素副溶血性弧菌中毒力因子TDH作為抗原制備 多克隆抗體，后者結(jié)合免疫磁珠對食品目的菌進(jìn)行富集，然后利用弧菌顯色平板進(jìn)行分離， 從而達(dá)到有針對性的檢測食品中產(chǎn)耐熱直接溶血素副溶血性弧菌的目的。
[0008] 實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種富集TDH致病性副溶血性弧菌免疫磁珠制備方 法，包括以下步驟：通過表達(dá)純化副溶血性弧菌中毒力因子TDH，將其免疫大白兔，獲得多 克隆抗體，然后將多克隆抗體偶聯(lián)在磁珠上，獲得結(jié)合標(biāo)記二抗的免疫磁珠，然后直接捕獲 食品中產(chǎn)耐熱直接溶血素副溶血性弧菌。
[0009] 具體步驟如下： ①毒力因子TDH的表達(dá)純化： 根據(jù)網(wǎng)上公布的副溶血性弧菌RMD2210633菌株的全基因組序列，利用軟件01ig〇6. 0 設(shè)計毒力因子TDH的表達(dá)用引物，并根據(jù)需要加入克隆所需要的酶切位點和保護(hù)堿基。引 物為：FP~CGGGATCCATGAAGTACCGATATTTTGC：RP-CCCAAGCTTTTATTGTTGATGTTTAC〇 經(jīng)PCR擴 增，克隆入表達(dá)質(zhì)粒pET-30a，建立重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后超生 離心，上清用HisBindPurificationKit(Novagen公司）純化重組蛋白。
[0010] ②多克隆抗體的制備： 用獲得的重組蛋白皮下多點注射成年新西蘭兔，第一次劑量為lmg/只。第14天，進(jìn)行 第二次免疫，劑量為〇. 5mg/只。第28天，進(jìn)行第三次免疫，劑量為0. 5mg/只。第35天進(jìn) 行第四次免疫，劑量為〇. 5mg/只，之后再每隔一周免疫一次，共免疫7次。免疫完后，進(jìn)行 兔血的純化。將純化好的兔血分裝，于_20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0011] ③免疫磁珠的制備： 免疫磁珠的制備按照磁珠說明書進(jìn)行。取100μ1磁珠懸浮液(含磁珠約lmg)至離心 管內(nèi)，將離心管放于磁力架上，待上層液體變澄清后，保留底部的磁珠，棄掉上清，加lml磁 珠偶聯(lián)緩沖液，重懸磁珠后，磁力條件下將磁珠沉淀；先后加入1〇〇μ1磁珠偶聯(lián)緩沖液和 2μ1抗體(含抗體約7μg)混勾，孵育30min，磁力將磁珠沉淀，棄上清；加入lml洗液，磁力 將磁珠沉淀；重復(fù)此步驟3次；最后加入100μ1洗液，重選磁珠，放于4°C冰箱備用。
[0012] 本發(fā)明優(yōu)點是：1表達(dá)純化副溶血性弧菌中主要的毒力因子TDH，將其作為抗原， 制備多克隆抗體，保證分離的高度特異性，這是常規(guī)培養(yǎng)分離方法所不及的；2利用免疫磁 珠捕獲技術(shù)可快速收集，濃縮環(huán)境及食品中的目的菌，操作簡便，快速。
【附圖說明】
[0013] 圖1為免疫磁珠捕獲產(chǎn)耐熱直接溶血素副溶血性弧菌實驗中抗原抗體優(yōu)化組合 實驗結(jié)果。
[0014] 圖2為免疫磁珠捕獲產(chǎn)耐熱直接溶血素副溶血性弧菌的特異性實驗結(jié)果。
[0015] 圖3為未經(jīng)免疫磁珠捕獲水產(chǎn)品樣品中產(chǎn)耐熱直接溶血素副溶血性弧菌實驗結(jié) 果。
[0016] 圖4為經(jīng)免疫磁珠捕獲水產(chǎn)品樣品中產(chǎn)耐熱直接溶血素副溶血性弧菌實驗結(jié)果。
【具體實施方式】
[0017] 富集TDH致病性副溶血性弧菌免疫磁珠制備方法，包括以下步驟： ①毒力因子TDH的表達(dá)純化： 根據(jù)網(wǎng)上公布的副溶血性弧菌RMD2210633菌株的全基因組序列，利用軟件01ig〇6. 0設(shè)計毒力因子TDH的表達(dá)用引物，并根據(jù)需要加入克隆所需要的酶切位點和保護(hù)堿基。引 物為：FP~CGGGATCCATGAAGTACCGATATTTTGC：RP-CCCAAGC