與結球甘藍耐抽薹基因相連鎖的分子標記及其獲得方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其設及一種與結球甘藍度rassicaoleracea L.var.capitataL.)耐抽臺基因連鎖的分子標記B0ISSROO207及其獲得方法。
【背景技術】
[0002] 甘藍為蕓臺屬"UΞ角"作物含CC二倍體基因組的基本種，包括結球甘藍、花挪菜、 青花菜、抱子甘藍、羽衣甘藍、球莖甘藍、皺葉甘藍和芥藍等8個栽培變種。各變種間天然 雜交率很高。甘藍類蔬菜目前在世界各地廣泛栽培，W結球甘藍栽培面積最大，結球甘藍、 花挪菜、青花菜和球莖甘藍在中國普遍栽培，芥藍主要在我國華南地區(qū)等地栽培。據(jù)報道， 2013年我國結球甘藍年種植面積大約為90萬hm2;青花菜種植面積約8萬hm2;花挪菜種植 面積45萬hm2。
[0003] 結球甘藍是我國重要的蔬菜作物之一，在各地普遍栽培，現(xiàn)已實現(xiàn)周年生產(chǎn)與周 年供應。據(jù)統(tǒng)計，其栽培面積約占我國蔬菜播種面積的10%W上，在我國城鄉(xiāng)蔬菜供應中具 有舉足輕重的地位。在春甘藍栽培中，往往因氣候及栽培管理不當?shù)仍蛟斐纱焊仕{發(fā)生 先期抽臺現(xiàn)象，從而嚴重影響結球甘藍的品質和產(chǎn)量，給生產(chǎn)帶來巨大損失。因此，為有效 減少運些損失，需要在理論上加強結球甘藍耐抽臺性分子遺傳機制的研究，同時，在生產(chǎn)上 培育具有耐抽臺性的甘藍品種。
[0004] 為解決上述影響我國十字花科作物可持續(xù)發(fā)展的重大問題，挖掘新的耐抽臺種質 資源，W往育種家們大多借助形態(tài)學標記和生化標記來輔助育種，經(jīng)篩選已獲得一些優(yōu)良 的耐抽臺自交系，但在耐抽臺性轉育過程中應用傳統(tǒng)的方法篩選耐抽臺植株時存在選育時 間較長、操作程序繁瑣等缺點；另一方面耐抽臺性的表現(xiàn)易受環(huán)境條件的影響，難W適應育 種實踐的需要。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，利用分子標記輔助技術開展十字花科蔬菜 耐抽臺性育種顯出巨大的潛力。一類基于DNA變異的分子標記技術已經(jīng)被國內外許多學 者應用于十字花科蔬菜抗逆及抗病研究。應用分子標記技術，不但可W免除傳統(tǒng)育種中繁 重的選擇過程，W及跟蹤、檢測外源基因，還能把多個抗病及抗逆基因聚合到同一優(yōu)良品種 中，使其獲得持久、廣泛的抗性。
[0005] 提高耐抽臺性是當前結球甘藍乃至整個十字花科蔬菜重要的育種目標之一。同 時，通過雜交與回交技術，可W將結球甘藍中的耐抽臺基因轉移到同為甘藍種的青花菜、花 挪菜、抱子甘藍、球莖甘藍和芥藍等變種中，從而為耐抽臺的甘藍類蔬菜新品種選育提供基 因資源。因此，獲得與耐抽臺基因緊密連鎖的分子標記不僅可應用到分子輔助育種中，提高 甘藍種作物耐抽臺育種效率，在品種選育上有重要的應用價值，還可W為進一步圖位克隆 耐抽臺基因并分析其生物學功能奠定研究基礎。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有在育種實踐中可用的耐抽臺分子標記不足，提供一種 與結球甘藍耐抽臺基因連鎖的分子標記BO1SSR00207及其獲得方法。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過W下技術方案實現(xiàn)的：一種與結球甘藍耐抽臺基因相連鎖的 分子標記，其上游引物為SEQIDNO. 1，下游引物為SEQIDNO. 2。
[0008] -種與結球甘藍耐抽臺基因相連鎖的分子標記的獲得方法，包括W下步驟：
[0009] (1)利用經(jīng)過多代自交選育出的耐抽臺材料叩9805'和易抽臺材料'Y5-3-14'，將 耐抽臺親本和易抽臺親本進行雜交得到Fi群體，F(xiàn)1自交后獲得F2群體；
[0010] 似針對F2群體，采用改良的BSA法分別構建耐抽臺基因池和易抽臺基因池；
[0011] (3)利用SSR分子標記技術，對易抽臺基因池和耐抽臺基因池進行與結球甘 藍耐抽臺性分子標記的篩選；篩選出與目標性狀（耐抽臺性）存在連鎖關系分子標記 BO1SSR00207,經(jīng)單株驗證分析，該分子標記BO1SSR00207與結球甘藍耐抽臺基因的遺傳距 離為 10. 69cM。
[0012] 進一步地，所述步驟2具體為：
[0013](2. 1)通過冬性鑒定確定F2群體中每一個單株的耐抽臺性，W抽臺情況將F2代群 體單株分為1級~9級。其中，1級為：短縮莖伸長（< 1cm) ;9級為：花臺大于20cm;
[0014] (2. 2)取F2代群體中的1級單株15株，采用CTAB法提取基因組DM,混樣后構建 F2代易抽臺基因池；取9級單株15株，采用CTAB法提取基因組DNA，混樣后構建F2代耐抽 臺基因池。
[0015] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于：
[0016] 先期抽臺嚴重影響結球甘藍乃至十字花科蔬菜的品質與產(chǎn)量，給生產(chǎn)帶來巨大的 損失。本發(fā)明利用SSR分子標記方法，結合改良的BSA法得到一個與結球甘藍耐抽臺基因 連鎖的SSR分子標記，可直接用于甘藍類蔬菜的耐抽臺性分子標記的輔助選擇育種。利用 該分子標記，不僅克服了常規(guī)育種方法所需時間周期長等缺點，還可W有目的地聚合多個 抗性基因，培育出具有穩(wěn)定的多抗性的甘藍類蔬菜新品種。同時也可利用運個新的與耐抽 臺基因連鎖的分子標記克隆結球甘藍耐抽臺基因，并對其進行結構和功能分析，運對于進 一步了解結球甘藍耐抽臺的分子遺傳機理有積極意義。因此，本發(fā)明在甘藍類蔬菜育種實 踐及耐抽臺理論研究上均具有重要意義。
【附圖說明】
[0017] 圖1為雙親及Fi代田間植株。其中，A:母本，B:Fi代，C:父本。
[0018] 圖2為BO1SSR00207引物對耐/易抽臺基因池的擴增結果。1~3:耐抽臺基因 池；4~6 :易抽臺基因池。Μ為lOObpDNAmarker。
[0019] 圖3為B0ISSROO207引物對兩個親本的驗證結果。Pi為父本，P2為母本，Μ為10化p DNAm曰rker〇
[0020] 圖4為B0ISSROO207引物的F2代單株驗證結果。Μ為lOObpDNAmarker。
【具體實施方式】
[0021] 本發(fā)明與結球甘藍耐抽臺分子標記BO1SSR00207的獲得方法主要包括W下步驟：
[0022] 1.利用經(jīng)多代自交選育出的耐抽臺材料'Y9805'和易抽臺材料'Y5-3-14'，將所 述耐/易抽臺親本雜交得到Fi群體，F(xiàn)1自交獲得F2群體。
[0023] 2.應用SSR分子標記技術，運用改良BSA法進行與結球甘藍耐抽臺性分子標記的 篩選。
[0024] (1)葉片總DM的提?。?br>[00巧]具體做法為：通過冬性鑒定確定每一個單株的耐抽臺性，W抽臺情況將F2代群體 單株分為1級~9級分別取樣。其具體標準為：1級：短縮莖伸長（< 1cm) ;3級：短縮莖伸 長明顯（1~2cm)，無花臺；5級：短縮莖伸長，有花臺（< 5cm) ;7級：節(jié)間伸長，花臺大于 5cm;9級：節(jié)間伸長，花臺高度大于20畑1。采用CTAB法提取基因組DNA。同時還提取了親 本Pi和P2的基因組DM。
[0026] 似耐/易抽臺結球甘藍基因池的構建
[0027] 具體做法為：本發(fā)明采用改良的BSA法分別構建耐抽臺基因池和易抽臺基因池。 從F2代群體中1級單株和9級單株各取15株基因組DNA分別進行混樣，構建F2代易抽臺 基因池及F2代耐抽臺基因池。
[0028] (3)與結球甘藍耐抽臺基因連鎖的SSR標記的篩選
[002引利用336對SSR引物（序列見表1)對2個基因池化代耐抽臺池和F 2代易抽臺 池）進行PCR擴增，每一PCR重復一次。PCR檢測的反應體系（20μ? :75ng基因組DNA模 板，0. 5U Taq DNA聚合酶（FermentasTM)、0. 4μL (10μmol·L1)dNTPs、1μL (10μmol·L1) 上下游引物、2μΙ lOXPCR Buffer(200mmol.LiTris pH 8.0,200mmol.LiKCl， lOOmmol .L i(NH4)2S04和20mmol .L iM拆04)，加(1地20至20yL。PCR檢測的擴增程序：94°C 預變性3min，進入35個循環(huán)（94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s)，最后再72°C延 伸7min。PCR反應過程在BIO-RAD S1000 ? Thermal切cler儀器上進行，樣品在4°C條件 下保存。
[0030] 表1用于篩選SSR標記的引物序列
[0031]
[0032]







[0040]PCR產(chǎn)物用12%質量百分數(shù)的聚丙締酷胺凝膠電泳檢測。PAGE電泳及染色所用試 劑和儀器如下：
[00川（3.1)0.3g/血的丙締酷胺混合液（100血）（即30%質量百分比的膠原液），配制方 法為：29g丙締酷胺（Ac巧lamide)，Ig N, Ν'-甲雙丙締酷胺（Bisac巧lamide)，加d地20至 100mL，37°C攬拌溶解，4°C避光保存。
[004引 （3.。0.Ig/mL的過硫酸胺（10血），配制方法為：Ig過硫酸胺（Ammonium persulfate,AP巧溶于10血d地20中，4°C保存。
[0043] (3. 3)5ΧΤ邸緩沖液（pH8. 3,500血），配制方法為：27gTris堿，13. 75g棚酸， 1. 86g胞2邸ΤΑ· &0,加d地2〇定容到500血，4°C保存。
[0044] (3. 4)TEMED(N，，N，，N，，N，-四甲基乙二胺）。
[0045] (3. 5)上樣緩沖液：其中含有0. 25%漠酪藍（W/V)，40%薦糖水溶液（W/V)，4°C膽 存。
[004引（3. 6)封底膠：1 %瓊脂糖溶液，用1XT邸配置。
[0047] (3. 7)染色液：無水乙醇50ml，硝酸銀0. 5g，溶于dd&0并定容至500ml。膽存于 棟色瓶中，室溫保存。
[0048] (3. 8)顯色液：氨氧化鋼lOg，溶于dd&0并定容至500ml，室溫保存。實驗室再加 入2ml質量百分數(shù)為37%的甲醒。
[0049](3. 9)儀器：DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠），DYCZ-30C型雙夾板垂 直電泳槽（北京六一儀器廠），Tanon2500全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)等。
[0050]PAGE電泳的主要步驟：
[0051] 1)將準備灌膠的玻璃板，梳子，膠套，電泳槽等，用去污劑洗涂自來水沖洗，驚干， 酒精擦拭。
[0052] 2)將兩塊玻璃板插入橡膠套后，放入電泳槽中，使較低的玻璃板朝向負極（黑色 電極）。保持電泳槽水平，梓緊電泳槽上的螺桿使玻璃板和橡膠套穩(wěn)固且密封。
[0053] 3)在微波爐中將封底膠煮沸，將玻璃板和橡膠套Ξ面的外側接縫封好