本發(fā)明涉及作物品質(zhì)育種領(lǐng)域，具體涉及到一種利用近紅外光譜快速測(cè)定甘藍(lán)型油菜種子中生育酚含量的方法。

背景技術(shù)：

維生素e，包括生育酚和生育三烯酚，是一種重要的脂溶性維生素，它具有很強(qiáng)的抗氧化性，在動(dòng)植生命中有著不可替代的重要地位。天然維生素e主要合成于油料作物的種子和葉片。油菜屬于雙子葉植物，只含有生育酚，由于油菜種子富含生育酚且種植面積大，因此油菜生育酚育種日漸成為研究的熱點(diǎn)之一，越來(lái)越受到育種工作者的關(guān)注。油菜籽粒生育酚含量的測(cè)定主要通過(guò)液相色譜法(hplc)進(jìn)行測(cè)量，一般都比較復(fù)雜，它既要消耗種子，還要使用大量的化學(xué)試劑，無(wú)論是從時(shí)間、資金還是環(huán)境保護(hù)來(lái)說(shuō)，都需要尋求更方便有效的方法。

近紅外光譜分析是近些年來(lái)在分析測(cè)試行業(yè)的逐漸備受關(guān)注的一門新技術(shù)，憑借其快速高效無(wú)損的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，在農(nóng)作物領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，但利用近紅外光譜測(cè)定油菜或其它作物種子生育酚含量的方法至今尚未見報(bào)道，雖然在飼料維生素e含量檢測(cè)中有所應(yīng)用，但在飼料中建立的模型或即使利用其它種子建立的分析模型對(duì)油菜種子維生素含量的測(cè)定也是完全不適合的，這主要是因?yàn)椴煌魑锓N子所含化學(xué)成分不同，含氫基團(tuán)倍頻與合頻振動(dòng)頻率不同，則近紅外圖譜的峰位、峰數(shù)及峰強(qiáng)也不同，即不同物質(zhì)的光譜是存在特異性的，那么用油菜建立的模型僅適用于油菜，因此必須建立油菜種子自己的生育酚測(cè)量的方法。鑒于此，通過(guò)發(fā)明人的探索、研究，利用近紅外光譜分析，可以實(shí)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜種子中生育酚含量的快速測(cè)定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述情況，本發(fā)明的目的就是為了提供一種利用近紅外光譜專門快速測(cè)定甘藍(lán)型油菜種子中生育酚含量的方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

一種利用近紅外光譜快速測(cè)定甘藍(lán)型油菜種子中生育酚含量的方法，包括下述步驟：

(1)利用近紅外光譜儀采集表1中所有樣品的近紅外光譜數(shù)據(jù)

樣品光譜采集所用的儀器為fossnipsystem公司的fosstr-3700型近紅外快速品質(zhì)分析儀，掃描波長(zhǎng)為1100-2500nm，分辨率為2nm；每份材料掃描兩次，掃描后取反射值r，再轉(zhuǎn)化成log(1/r)保存到光譜文件中，逐份掃描，得到所有油菜籽樣品的光譜圖；

(2)對(duì)步驟(1)獲得的光譜圖進(jìn)行預(yù)處理

即將所有甘藍(lán)型油菜種子光譜從fosstr-3700型近紅外快速品質(zhì)分析儀中導(dǎo)出，轉(zhuǎn)入分析軟件winisi中；對(duì)樣品的光譜文件按編號(hào)進(jìn)行合并后平均，即將每個(gè)樣品的2次重復(fù)掃描光譜進(jìn)行合并，得到一個(gè)新的平均后的光譜文件，以降低誤差。

(3)利用winisi軟件將表1中的β+γ-生育酚以及總生育酚含量一一對(duì)應(yīng)的輸入光譜文件中，建立校正模型；其中，建立β+γ-生育酚校正模型時(shí)采用的是表1中的295個(gè)樣品，即除了表1中序號(hào)為108、143、171、179、206、229這7個(gè)樣品外的所有樣品；建立總生育酚校正模型采用的是表1中的286個(gè)樣品，即除了表1中序號(hào)為9、15、26、29、62、74、76、99、116、121、135、162、224、230、255、291這16個(gè)樣品外的所有樣品；β+γ-生育酚以及總生育酚含量?jī)煞N校正模型所采用的數(shù)學(xué)方法均為2,3,3,1；所用的回歸方式為改進(jìn)的偏最小二乘法(modifiedpls)；光譜散射處理方式采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量轉(zhuǎn)換+趨勢(shì)變換法(snv+det)。

(4).采集待測(cè)樣品的光譜，處理之后輸入到校正模型中，得到待測(cè)樣品的生育酚含量預(yù)測(cè)值。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供的是一種利用近紅外光譜快速測(cè)定甘藍(lán)型油菜種子中生育酚含量的方法，該方法快速、準(zhǔn)確、無(wú)損，操作簡(jiǎn)單，操作過(guò)程只需經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單培訓(xùn)的工人即可完成，每個(gè)樣品的測(cè)試過(guò)程不到2分鐘，經(jīng)驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，高效。而直接利用標(biāo)準(zhǔn)方法(hplc)測(cè)量甘藍(lán)型油菜種子中生育酚含量需要實(shí)驗(yàn)人員操作，每個(gè)樣品所需時(shí)間達(dá)到4小時(shí)，并且不能對(duì)測(cè)量完成的樣品進(jìn)行回收。

附圖說(shuō)明

圖1為建立近紅外光譜技術(shù)快速測(cè)定甘藍(lán)型油菜種子中生育酚含量模型的流程圖。

圖2為校正集甘藍(lán)型油菜種子所有樣品的近紅外掃描光譜圖。

圖3為利用高效液相色譜法測(cè)得的甘藍(lán)型油菜種子中生育酚含量的色譜圖；

其中δ-t,is,γ+β-t,α-t分別表示δ生育酚、內(nèi)標(biāo)、γ和β生育酚之和、α生育酚。

圖4為驗(yàn)證集利用校正模型計(jì)算得到的生育酚含量預(yù)測(cè)值和標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定的化學(xué)值之間的關(guān)系散點(diǎn)圖；

其中a圖為γ+β-生育酚，b圖為總生育酚。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)；所述試劑或材料，如未特別說(shuō)明，均來(lái)源于商業(yè)渠道。

實(shí)施例1：

一種利用近紅外光譜快速測(cè)定甘藍(lán)型油菜種子中生育酚含量的方法，包括下述步驟：

1.收集甘藍(lán)型油菜樣品。

為保證分析模型的準(zhǔn)確性，必須選取一批遺傳多樣性豐富的油菜種子。鑒于此，首先利用從全國(guó)各地收集的有代表性的一批油菜自交系，通過(guò)分子標(biāo)記分析、生育酚含量測(cè)定，從中篩選出373份在生育酚含量、群體結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性均存在較大差異的甘藍(lán)型油菜種子，然后將這373份材料分成兩組，第一組作為校正集，用于建立近紅外校正模型；第二組作為驗(yàn)證集，用于驗(yàn)證近紅外校正模型的準(zhǔn)確性，其中校正集302份，驗(yàn)證集71份，所述的373份樣品參考lius,fanc,lij,etal.agenome-wideassociationstudyrevealsnoveleliteallelicvariationsinseedoilcontentofbrassicanapus.[j].theoreticalandappliedgenetics,2016,129(6):1203-1215.，具體如下表所示：

表1校正集甘藍(lán)型油菜樣品材料編號(hào)及hpcl測(cè)得的生育酚含量

表2驗(yàn)證集甘藍(lán)型油菜樣品材料編號(hào)及hplc測(cè)得的生育酚含量

2.利用近紅外光譜儀采集校正集所有樣品的近紅外光譜數(shù)據(jù)。

樣品光譜采集所用的儀器為fossnipsystem公司的fosstr-3700型近紅外快速品質(zhì)分析儀，掃描波長(zhǎng)為1100-2500nm，分辨率為2nm。每份材料掃描兩次，掃描后取反射值r，再轉(zhuǎn)化成log(1/r)保存到光譜文件中，逐份掃描，得到所有油菜籽樣品的光譜圖。

3.對(duì)校正集的光譜進(jìn)行預(yù)處理。

將校正集所有甘藍(lán)型油菜種子光譜從近紅外儀器中導(dǎo)出，轉(zhuǎn)入分析軟件winisi(本實(shí)施例使用的是winisiiii)中。對(duì)樣品的光譜文件按編號(hào)進(jìn)行合并后平均，將每個(gè)樣品的2次重復(fù)掃描光譜進(jìn)行合并，得到一個(gè)新的平均后的光譜文件，以降低誤差。

4.利用標(biāo)準(zhǔn)的方法測(cè)定校正集所有樣品的化學(xué)值，即樣品的生育酚含量。

本發(fā)明所使用的測(cè)定甘藍(lán)型油菜種子中生育酚含量的標(biāo)準(zhǔn)方法是高效液相色譜法(hplc)，所用的儀器是安捷倫(agilent)1260高效液相色譜儀，該儀器配有自動(dòng)進(jìn)樣器、真空脫氣機(jī)、色譜工作站以及熒光檢測(cè)器。

樣品處理方法為：

(1)取干燥的甘藍(lán)型油菜種子約50mg，精確稱量；

(2)加1.5ml含有0.01％bht提取液(體積比為9:1的甲醇、二氯甲烷混合液)；

(2)利用購(gòu)自美國(guó)的sk450型混合機(jī)將樣品研磨3min，之后在常溫下震蕩提取4h；

(3)12000r/min條件下離心20min，取400ul上清于進(jìn)樣瓶中；

(4)用agilent1260高效液相色譜儀對(duì)玻璃品種的樣品進(jìn)行檢測(cè)；

(5)采用內(nèi)標(biāo)定量法，每個(gè)樣品中加入60μl的50ng/μl的5,7-二甲基生育酚的正己烷溶液；

(6)圖像顯示及處理軟件為workstationtoolar；分別計(jì)算出β+γ-生育酚以及總生育酚含量(由于α-生育酚、δ-生育酚含量較低，故不用于建立模型)。對(duì)校正集各樣品的的檢測(cè)結(jié)果如表1所示，結(jié)果顯示，γ+β-生育酚含量在133.78～396.69ug/g之間，總生育酚在216.12～522.21ug/g之間，最高值與最低值均相差兩倍以上，變化幅度均較大，由于歷史上油菜籽粒維生素e含量從來(lái)沒(méi)有作為一個(gè)重要性狀進(jìn)行過(guò)人工選擇，這樣的含量變異基本上代表了絕大多數(shù)不同油菜籽粒維生素e含量的變化幅度，因此利用這些樣品建立的模型同樣適合用于絕大多數(shù)油菜種子維生素e含量的測(cè)定。

色譜分析條件為：(1)色譜柱：c18柱(4.6mmid×12.5mm，4-pack)，柱溫30℃；(2)熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)為292nm，發(fā)射波長(zhǎng)330nm，檢測(cè)時(shí)間為20min；(3)進(jìn)樣量為20ul；(4)流動(dòng)相為水:甲醇＝5:95(體積比)，變換至水:甲醇＝0:100(體積比)，流速為1.5ml/min。

5.將校正集的光譜數(shù)據(jù)與化學(xué)值相關(guān)聯(lián)，建立定標(biāo)方程。

利用winisi軟件將hplc得到的兩種化學(xué)值(β+γ-生育酚以及總生育酚含量)一一對(duì)應(yīng)的輸入光譜文件中；選擇計(jì)算和利用得分程序，以pca計(jì)算方式(利用文件中的掃描數(shù)據(jù)計(jì)算得分，以此統(tǒng)計(jì)文件中各樣品間的差異)和光譜文件中所有樣品得分的平均值作為中心，以此來(lái)計(jì)算每個(gè)樣品的馬氏距離，將馬氏距離設(shè)置為3.0，即每個(gè)樣品離中心樣品點(diǎn)的距離超過(guò)該值，就被視為超常樣品，就被剔除，最終有295個(gè)樣品(表1中除了序號(hào)為108、143、171、179、206、229這7個(gè)樣品)用于建立β+γ-生育酚校正模型，286個(gè)樣品(表1中除了序號(hào)為9、15、26、29、62、74、76、99、116、121、135、162、224、230、255、291這16個(gè)樣品)用于建立總生育酚校正模型。

6.采用不同的數(shù)學(xué)處理技術(shù)和散射校正方法完成定標(biāo)方程內(nèi)部驗(yàn)證，選擇最佳定標(biāo)方程，確定校正模型；本發(fā)明中β+γ-生育酚以及總生育酚含量?jī)煞N校正模型所采用的數(shù)學(xué)方法均為2,3,3,1(即做2階導(dǎo)數(shù)處理、導(dǎo)數(shù)處理光譜間隔點(diǎn)為3、一次平滑光譜間隔點(diǎn)為3、二次平滑為1)、(2,3,3,1)；所用的回歸方式為改進(jìn)的偏最小二乘法(modifiedpls)；光譜散射處理方式采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量轉(zhuǎn)換+趨勢(shì)變換法(snv+det)；選擇最佳定標(biāo)方程的主要參數(shù)有定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)誤差(sec)、交叉驗(yàn)證誤差(secv)、定標(biāo)決定系數(shù)(rsq)、交叉驗(yàn)證系數(shù)(1-vr)。通過(guò)這些參數(shù)判定定標(biāo)方程的優(yōu)劣。

7.采集驗(yàn)證集樣品的光譜，處理之后輸入到校正模型中，得到驗(yàn)證集樣品的生育酚含量預(yù)測(cè)值。使用與校正集相同的方法得到處理過(guò)的驗(yàn)證集材料的光譜，利用winisi軟件，通過(guò)建立的校正模型計(jì)算出驗(yàn)證集所有材料的預(yù)測(cè)值，校正集和驗(yàn)證集材料種子中生育酚含量如下表所示：

8.利用標(biāo)準(zhǔn)方法(hplc)測(cè)定校正集樣品的生育酚含量，即化學(xué)值，并與預(yù)測(cè)值進(jìn)行對(duì)比分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)校正模型的外部驗(yàn)證。采用與校正集相同的方法測(cè)量出驗(yàn)證集所有樣品的化學(xué)值，將驗(yàn)證集的化學(xué)值與通過(guò)模型得到的預(yù)測(cè)值進(jìn)行對(duì)比分析，以驗(yàn)證校正模型是否可用，結(jié)果如下表所示：

說(shuō)明：n,樣本數(shù)；mean,平均值；sd,參考值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；sec,校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)誤差；rsq,決定系數(shù)；1-vr,1-不可解釋方差與總方差的比值；dt,導(dǎo)數(shù)處理；scm,散射校正方法；terms,用于校準(zhǔn)的主成分?jǐn)?shù)；group,校準(zhǔn)集被劃分成若干組；secv,交叉驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)誤差；r²cv,交叉驗(yàn)證確定系數(shù)；rpd,比性能差(sd/secv)；sep,外部驗(yàn)證中預(yù)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)誤差；r²ev,外部驗(yàn)證確定系數(shù)；snv+det,標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量轉(zhuǎn)換+趨勢(shì)變換法；wmsc,加權(quán)多散射校正。

雖然本模型的rsq值相對(duì)有點(diǎn)低，但考慮到種子中生育酚含量低于種子干重的0.6％，這說(shuō)明模型的質(zhì)量較高，從上表中可看出交叉驗(yàn)證的rpd值在1.0～2.0之間，運(yùn)用本模型是可以比較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)甘藍(lán)型油菜種子中生育酚含量。此外，利用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)量時(shí)從樣品制備到完成分析所用時(shí)間接近5個(gè)小時(shí)，而利用本發(fā)明所述的方進(jìn)行分析時(shí)，每份樣品所用時(shí)間不超過(guò)3分鐘，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。這一模型的建立為油菜高生育酚育種提供了快捷有效的方法，從而將極大地加快新品種的選育進(jìn)程。