專利名稱：一種海洋弧菌的多重pcr反應試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及靶DNA片斷的檢測技術，具體涉及一種海洋弧菌的多重PCR反應試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
由弧菌屬的細菌引起的弧菌病已經(jīng)嚴重危害了海水養(yǎng)殖業(yè)。海洋弧菌中的溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌是主要的致病菌，其能感染石斑魚、真鯛、鱸魚、大黃魚、牙鲆和大菱鲆等魚類動物，也能感染蝦、三疣梭子蟹、鋸緣青蟹等甲殼類動物，以及文蛤，鮑，牡蠣等貝類動物，弧菌病具有發(fā)病快、傳染性高和死亡率高的特點，感染弧菌病的海洋動物會發(fā)生表皮潰瘍，爛尾，腹水，爛眼等癥狀，因此弧菌病對養(yǎng)殖海洋動物造成極大的危害，導致海水養(yǎng)殖業(yè)的極大經(jīng)濟損失。
對弧菌病的致病菌種的準確快速的檢測是用藥防治的依據(jù)，用多聚酶鏈反應(PCR反應)檢測弧菌病的致病菌種，具有快速，敏感，特異性強的優(yōu)點，PCR反應試劑盒是在PCR反應管中裝有包括10×PCR反應緩沖液(含Mg2+)、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌種的DNA引物和滅菌去離子水混合的反應液，其檢測方法是提取該弧菌病的致病菌種的DNA，把DNA加入到PCR反應試劑盒進行擴增反應，然后對擴增產(chǎn)物進行電泳，通過擴增產(chǎn)物與陽性標準品和陰性對照品的電泳結果對比判斷，是否存在該DNA引物的致病菌種，從而找出弧菌病的致病菌種；但現(xiàn)有的PCR反應試劑盒中一般只含有一種致病菌種的單對引物，因此每個PCR反應試劑盒只能擴增一種致病菌種的DNA，即一次只能檢測一種致病菌種，而導致弧菌病的致病菌種多種多樣，弧菌病的癥狀表現(xiàn)也多種多樣，這樣就給選擇用含有哪種致病菌種的DNA引物的試劑盒進行檢測帶來了困難，往往需要多次檢測才能找到致病菌種，有些弧菌病是受幾種海洋弧菌聯(lián)合感染，因此就需要對幾種致病菌種用不同的PCR反應試劑盒進行檢測，才能檢測出感染弧菌病的幾種致病菌種，這樣使得檢測致病菌種的時間延長，檢測費用也增加，并且耽誤了弧菌病的防治時間，導致了弧菌病的擴散傳染，從而導致感染弧菌病的海洋動物的病情加重和更多的海洋動物感染弧菌病，使得海水養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種海洋弧菌的多重PCR反應試劑盒及其檢測方法，其具有能同時檢測三種海洋弧菌的優(yōu)點，縮短了檢測弧菌病的致病菌種的時間，降低了檢測成本。
本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種海洋弧菌的多重PCR反應試劑盒，包括PCR反應液，所述的PCR反應液由10×PCR反應緩沖液(含Mg2+)、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌種的DNA引物和滅菌離子水配制而成，所述的致病菌種的DNA引物為下述三種弧菌的DNA引物，即溶藻弧菌的DNA引物上游引物為5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，下游引物為5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，哈維氏弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，下游引物為5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，副溶血弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，下游引物為5’-ggt cag aat caa acg ccg-3。
Hot star Taq酶是5U/μl的DNA聚合酶的熱啟動版本。
dNTP是每種濃度為2.5mmol/L的dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物。
三種弧菌的DNA引物是由生物公司合成，如表1所示，三種弧菌的DNA引物的兩兩之間無三對堿基以上的互補，引物的PCR反應退火溫度為48℃～54℃，引物的PCR反應的擴增產(chǎn)物的片段長度大小接近，但兩兩之差仍大于100bp，因此能通過電泳把它們分開。
表1

所述的PCR反應液為23.5μl，包括10×PCR反應緩沖液2.5μl、dNTP2.0μl、Hotstar Taq酶0.2μl、最終濃度為0.4μmol/L～0.8μmol/L的溶藻弧菌引物0.5μl、最終濃度為0.4μmol/L～0.8μmol/L的哈維氏弧菌引物0.5μl、最終濃度為0.16μmol/L～0.8μmol/L的副溶血弧菌引物0.5μl，用滅菌去離子水定容。
溶藻弧菌引物的最終濃度為0.4μmol/L、哈維氏弧菌引物的最終濃度為0.4μmol/L、副溶血弧菌引物的最終濃度為0.4μmol/L。
一種海洋弧菌的檢測方法，包括采集和提取海洋弧菌的DNA的樣品模板，將樣品模板加入到多重PCR反應試劑盒中進行擴增反應，得到擴增產(chǎn)物，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測后得到成像結果，所述的PCR反應擴增的試劑盒包括PCR反應液，所述的PCR反應液由10×PCR反應緩沖液(含Mg2+)、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌種的DNA引物和滅菌離子水配制而成，所述的致病菌種的DNA引物為下述三種弧菌的DNA引物，即溶藻弧菌的DNA引物上游引物為5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，下游引物為5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，哈維氏弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，下游引物為5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，副溶血弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，下游引物為5’-ggt cag aat caa acg ccg-3。
PCR的擴增反應的循環(huán)參數(shù)為94℃預變性5min，94℃變性30s、54℃退火30s、68℃延伸1min20s，進行4個循環(huán)后，退火溫度降低2℃，退火溫度每降低2℃后再進行4個循環(huán)，到退火溫度降到48℃時，進行20個循環(huán)，然后在68℃溫度下延伸7min。
成像顯示出的擴增片段的特異性條帶分別為溶藻弧菌737bp，哈維氏弧菌382bp，副溶血弧菌271bp。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于由于海洋弧菌的多重PCR反應試劑盒的致病菌種的DNA引物為下述的三種海洋弧菌的DNA引物溶藻弧菌的DNA引物上游引物為5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，下游引物為5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，哈維氏弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，下游引物為5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，
副溶血弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，下游引物為5’-ggt cag aat caa acg ccg-3；這樣用本發(fā)明的試劑盒進行檢測就能檢測出與上述三種海洋弧菌的DNA引物相對應的溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌；另外由于本發(fā)明的檢測方法利用上述的試劑盒檢測海洋動物的弧菌病的致病菌種，因此能檢測出上述的三種海洋弧菌，這樣就縮短了檢測致病菌種的時間，降低檢測成本，從而能較快地找出感染弧菌病的海洋動物的致病菌種，達到及時有效的防治，避免了更多的海洋動物感染弧菌病，減少了海水養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟損失。


圖1為一種致病菌種感染的弧菌病的本發(fā)明檢測成像結果照片；M100bpDNA Ladder1、2為溶藻弧菌(737bp)，3、4為哈維氏弧菌(382bp)，5、6為副溶血弧菌(271bp)，7為陰性對照；圖2為二種和三種致病菌種聯(lián)合感染的弧菌病的本發(fā)明檢測成像結果照片；三種致病菌種聯(lián)合感染M100bpDNALadder1為陽性標準品溶藻弧菌(737bp)+哈維氏弧菌(382bp)+副溶血弧菌(271bp)；2～6為檢測結果溶藻弧菌(737bp)+哈維氏弧菌(382bp)+副溶血弧菌(271bp)；7陰性對照；二種致病菌種聯(lián)合感染M100bpDNA Ladder8、9為溶藻弧菌(737bp)+哈維氏弧菌(382bp)；10、11為哈維氏弧菌(382bp)+副溶血弧菌(271bp)；12、13為溶藻弧菌(737bp)+副溶血弧菌(271bp)；14陰性對照。
具體實施例方式
以下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
實施例1一種海洋弧菌的多重PCR反應試劑盒，在標準PCR反應管中裝有PCR反應液23.5μl，PCR反應液包括10×PCR反應緩沖液2.5μl，dNTP 2.0μl、5U/μl的Hot star Taq酶0.2μl、最終濃度為0.4μmol/L的溶藻弧菌引物0.5μl、最終濃度為0.4μmol/L的哈維氏弧菌引物0.5μl、最終濃度為0.4μmol/L的副溶血弧菌引物0.5μl，加入滅菌去離子水定量到23.5μl；溶藻弧菌的DNA引物上游引物為5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，下游引物為5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，哈維氏弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，
下游引物為5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，副溶血弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，下游引物為5’-ggt cag aat caa acg ccg-3；所有引物由生物公司合成。
實施例2與實施例1基本相同，所不同的只是溶藻弧菌引物的最終濃度為0.6μmol/L，哈維氏弧菌引物的最終濃度為0.6μmol/L，副溶血弧菌引物的最終濃度為0.4μmol/L。
實施例3一種海洋弧菌的檢測方法，其檢測步驟如下1、采集和提取海洋弧菌的DNA的樣品模板從感染弧菌病的大黃魚的肝臟中采集海洋弧菌的樣品；然后按下面步驟提取海洋弧菌的DNA的樣品模板；1)將樣品稀釋到裝有1.5ml TE緩沖液的微離心管中，用8000rpm離心1min，去上清后，2)加入到567μl的TE緩沖液中，反復吹打使之重懸，加入30μl 10％(W/V)SDS溶液，混勻，加入3μl濃度為20mg/ml的蛋白酶K，上下顛倒混勻，置于37℃水浴1h，每10分鐘上下顛倒混勻一次；3)加入100μl 5mol/L的NaCl，充分混勻，加入80μl CTAB/NaCl溶液，混勻，65℃水浴10min；4)加入等體積氯仿/異戊醇，用12000rpm離心5min，將上相移入一新的離心管；5)加入等量的酚∶氯仿∶戊醇(25∶24∶1)混合液，充分混勻混合液，呈乳濁液，室溫下用12000rpm離心5min，若有機相與水相不能充分分開，延長時間重新離心；6)吸取上層水相于另一離心管中；7)加入0.6體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀，沉淀移至1ml70％乙醇中洗滌，12000rpm離心2min，棄上清；8)室溫下晾干，盡量除去乙醇，但不可使DNA過于干燥，得到的DNA沉淀懸浮于50μl TE(PH8.0)緩沖液中，就是海洋弧菌的DNA的樣品模板，在-20℃下貯存?zhèn)溆谩?br> 2、吸取1.5μl的樣品模板加入到實施例1的PCR反應試劑盒中，然后在PCR擴增儀上進行擴增反應，PCR擴增反應的循環(huán)參數(shù)為94℃預變性5min，94℃變性30s、54℃退火30s、68℃延伸1min20s，進行4個循環(huán)后，退火溫度降低2℃，退火溫度每降低2℃后再進行4個循環(huán)，到退火溫度降到48℃時，進行20個循環(huán)，然后在68℃溫度下延伸7min；3、對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測將擴增產(chǎn)物和陽性標準品、陰性對照品在1％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，然后在用紫外凝膠成像系統(tǒng)進行成像，得到圖1中的1、2的成像結果，從而檢測出感染弧菌病的大黃魚的致病菌種為溶藻弧菌737bp。
實施例4與實施例3基本相同，所不同的只是從感染弧菌病的鱸魚的腎臟采集海洋弧菌的樣品；得到圖2中的2～6的成像結果，從而檢測出感染弧菌病的鱸魚的致病菌種為溶藻弧菌737bp+哈維氏弧菌382bp+副溶血弧菌271bp，是三種海洋弧菌聯(lián)合感染。
實施例5與實施例3基本相同，所不同的只是從感染弧菌病的鋸緣青蟹的肝臟采集海洋弧菌的樣品；得到圖2中的10、11的成像結果，從而檢測出感染弧菌病的鋸緣青蟹的致病菌種為哈維氏弧菌382bp+副溶血弧菌271bp，是二種海洋弧菌聯(lián)合感染。
與實施例3基本相同，也可以對真鯛、石斑魚、牙鲆和大菱鲆等魚類動物感染弧菌病的表皮潰瘍，爛尾，腹水，爛眼、肝臟，脾臟，腎臟，血液等進行檢測；也能對感染弧菌病的甲殼類動物和貝類動物等海洋動物進行檢測，可以得到圖1中的1、2為溶藻弧菌(737bp)或3、4為哈維氏弧菌(382bp)或5、6為副溶血弧菌(271bp)成像結果的單種致病弧菌的感染，也可以得到圖2中的2～6成像結果的三種海洋弧菌聯(lián)合感染，以及圖2中的8、9為溶藻弧菌(737bp)+哈維氏弧菌(382bp)，10、11為哈維氏弧菌(382bp)+副溶血弧菌(271bp)，12、13為溶藻弧菌(737bp)+副溶血弧菌(271bp)成像結果的二種海洋弧菌聯(lián)合感染。
權利要求
1.一種海洋弧菌的多重PCR反應試劑盒，包括PCR反應液，所述的PCR反應液由10×PCR反應緩沖液、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌種的DNA引物和滅菌離子水配制而成，其特征在于所述的致病菌種的DNA引物為下述三種弧菌的DNA引物，即溶藻弧菌的DNA引物上游引物為5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，下游引物為5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，哈維氏弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，下游引物為5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，副溶血弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，下游引物為5’-ggt cag aat caa acg ccg-3。
2.如權利要求1所述的一種海洋弧菌的多重PCR反應試劑盒，其特征在于所述的PCR反應液為23.5μl，包括10×PCR反應緩沖液2.5μl、dNTP2.0μl、Hot star Taq酶0.2μl、最終濃度為0.4μmol/L～0.8μmol/L的溶藻弧菌引物0.5μl、最終濃度為0.4μmol/L～0.8μmol/L的哈維氏弧菌引物0.5μl、最終濃度為0.16μmol/L～0.8μmol/L的副溶血弧菌引物0.5μl，用滅菌去離子水定容。
3.如權利要求2所述的一種海洋弧菌的多重PCR反應試劑盒，其特征在于溶藻弧菌引物的最終濃度為0.4μmol/L、哈維氏弧菌引物的最終濃度為0.4μmol/L、副溶血弧菌引物的最終濃度為0.4μmol/L。
4.一種海洋弧菌的檢測方法，包括采集和提取海洋弧菌的DNA的樣品模板，將樣品模板加入到多重PCR反應試劑盒中進行擴增反應，得到擴增產(chǎn)物，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測后得到成像結果，所述的多重PCR反應試劑盒包括PCR反應液，所述的PCR反應液由10×PCR反應緩沖液、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌種的DNA引物和滅菌離子水配制而成，其特征在于所述的致病菌種的DNA引物為下述三種弧菌的DNA引物，即溶藻弧菌的DNA引物上游引物為5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，下游引物為5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，哈維氏弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，下游引物為5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，副溶血弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，下游引物為5’-ggt cag aat caa acg ccg-3。
5.如權利要求4所述的一種海洋弧菌的檢測方法，其特征在于擴增反應的PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預變性5min，94℃變性30s、54℃退火30s、68℃延伸1min20s，進行4個循環(huán)后，退火溫度降低2℃，退火溫度每降低2℃后再進行4個循環(huán)，到退火溫度降到48℃時，進行20個循環(huán)，然后在68℃溫度下延伸7min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海洋弧菌的多重PCR反應試劑盒及其檢測方法，包括PCR反應液，PCR反應液由10×PCR反應緩沖液(含Mg
文檔編號C12Q1/04GK101067155SQ20071006921
公開日2007年11月7日 申請日期2007年6月5日 優(yōu)先權日2007年6月5日
發(fā)明者王國良, 祝璟琳, 金珊 申請人:寧波大學