專利名稱：用于檢測溶藻弧菌的引物序列及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)中的DNA序列，使用該序列對一種細(xì)菌進(jìn)行檢測的試劑盒，特別是涉及一種用于檢測溶藻弧菌的引物序列及檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
溶藻弧菌是沿海地區(qū)食物中毒和散在性腹瀉的重要病原菌，同時也是多種水生動物的致病菌，如南美白對蝦、斜帶石斑魚、鮭點石斑魚、貝類、大黃魚、黃鰭鯛、鋸緣青蟹等均可被溶藻弧菌感染致病，并產(chǎn)生不同的病癥。特別是近幾年由溶藻弧菌感染所引起的海水工廠化養(yǎng)殖大菱鲆和褐牙鲆腹水病，給海水工廠化養(yǎng)殖企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時，溶藻弧菌可通過海產(chǎn)品感染人類，造成急性腸道疾病。
目前對細(xì)菌性疾病的治療大多依賴于抗生素，抗生素的濫用不僅使病原菌產(chǎn)生了抗性，同時對人的健康也造成了一定的壓力。建立起準(zhǔn)確、快速檢測病原菌的方法，構(gòu)建有效的預(yù)報預(yù)警機(jī)制，在目前來說是非常必要和緊迫的。
現(xiàn)在對溶藻弧菌的鑒定主要依賴于常規(guī)的生理生化方法，該方法耗時、費(fèi)力，并且弧菌種類多，生理生化特征相似，造成生化反應(yīng)結(jié)果難以判定，從而影響了細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確率。
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，簡稱PCR)技術(shù)檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢驗周期短，操作相對簡便。但目前尚無用此種方法對溶藻弧菌快速診斷與檢測的報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于檢測溶藻弧菌的引物序列。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種對海水工廠化養(yǎng)殖水生經(jīng)濟(jì)動物以及養(yǎng)殖水體中的溶藻弧菌跟蹤監(jiān)測，并具有簡便、靈敏、特異、快速特點的溶藻弧菌檢測試劑盒本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種用于檢測溶藻弧菌的引物序列，它由上游引物和下游引物組成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
一種溶藻弧菌檢測試劑盒，由下述試劑組成試劑A將0.5-2.0g普通營養(yǎng)肉湯與50mL的陳海水混合，經(jīng)0.1-0.5Kpa高壓滅菌制成；試劑B將10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液1.5-5.0μL、Taq DNA聚合酶1-3U、滅菌雙蒸水17-19μL混合制成；試劑C將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.2-0.8μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.2-0.8μL，10mM dNTPs 0.2-0.8μL，25mM MgCl21.0-4.0μL混合制成；試劑D20-100ng/mL的溶藻弧菌的基因組總DNA；試劑E滅菌雙蒸水；試劑F取50mL 20倍TBE電泳緩沖液，使其中含有0.09mol羥基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol乙二胺四乙酸(EDTA)制成；試劑G0.3-0.6g瓊脂糖，使其中含溴化乙錠15-30μg。
優(yōu)選的是所述試劑A為將1.25g普通營養(yǎng)肉湯與50mL的陳海水混合，經(jīng)0.1-0.5Kpa高壓滅菌制成；所述試劑B為將10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL、Taq DNA聚合酶1.25U、滅菌雙蒸水17.25μL混合制成；所述試劑C為將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.5μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.5μL，10mM dNTPs 0.5μL，25mM MgCl21.5μL混合制成；所述試劑D為40-60ng/mL的溶藻弧菌的基因組總DNA；所述試劑G為0.3g瓊脂糖，使其中含溴化乙錠20μg。
所述溶藻弧菌的基因組總DNA是用下述方法提取的取在2216E平板上培養(yǎng)18-24h的溶藻弧菌，用滅菌的雙蒸水制成菌懸液，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取溶藻弧菌的基因組總DNA。本發(fā)明的優(yōu)點利用溶藻弧菌的基因保守序列設(shè)計一對引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，建立起檢測溶藻弧菌的PCR檢測方法，在此基礎(chǔ)上裝配出簡便、快速、靈敏、特異的一種溶藻弧菌檢測試劑盒，該試劑盒可用于對海水工廠化養(yǎng)殖水生經(jīng)濟(jì)動物以及養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌的跟蹤監(jiān)測，同時也可用于對海產(chǎn)品以及人類腹瀉的臨床檢測，具有很高的實用價值。


圖1為檢測溶藻弧菌電泳結(jié)果圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實施例1一種用于檢測溶藻弧菌的引物序列，它由上游引物和下游引物組成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
序列表SEQ ID No15’--AAGAGGGTTACTTTCATCAG-3SEQ ID No25’--CGTGTTTCCACCAGCAT-3’實施例2一種溶藻弧菌檢測試劑盒，由下述試劑組成
試劑A將1.25g普通營養(yǎng)肉湯與50mL的陳海水混合，經(jīng)0.3Kpa高壓滅菌制成；試劑B將10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL、Taq DNA聚合酶1.25U、滅菌雙蒸水17.25μL混合制成；試劑C將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.5μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.5μL，10mM dNTPs 0.5μL，25mM MgCl21.5μL混合制成；試劑D60ng/mL的溶藻弧菌的基因組總DNA；試劑E滅菌雙蒸水；試劑F取50mL 20倍TBE電泳緩沖液，使其中含有0.09mol羥基甲基氨基甲烷-硼酸(Tris-硼酸)，2mmol乙二胺四乙酸(EDTA)制成；試劑G0.3g瓊脂糖，使其中含溴化乙錠20μg；滅菌牙簽一包。
本發(fā)明的主要原理為試劑A對樣品中的溶藻弧菌進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后經(jīng)過離心，重懸，煮沸等步驟釋放出溶藻弧菌基因組總DNA，試劑B和試劑C含有多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑，將試劑B和試劑C按比例混合在一起，通過加入溶藻弧菌基因組總DNA，對溶藻弧菌的某一基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增。由于我們所設(shè)計的這對引物為溶藻弧菌所特有，如果樣品中含有溶藻弧菌，經(jīng)過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增后，核酸濃度會達(dá)到108mol以上，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后，在紫外分析儀中可以探測到一定分子量的目的條帶。如果沒有溶藻弧菌，則不能擴(kuò)增到同樣分子量的目的條帶。
實施例3一種溶藻弧菌檢測試劑盒，由下述試劑組成試劑A將0.5g普通營養(yǎng)肉湯與50mL的陳海水混合，經(jīng)0.1Kpa高壓滅菌制成；試劑B將10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液1.5μL、Taq DNA聚合酶1U、滅菌雙蒸水17μL混合制成；試劑C將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.2μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.2μL，10mM dNTPs 0.2μL，25mM MgCl21.0μL混合制成；試劑D20ng/mL的溶藻弧菌的基因組總DNA；試劑E滅菌雙蒸水(二次蒸餾水)；試劑F取50mL 20倍TBE電泳緩沖液，使其中含有0.09mol羥基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol EDTA制成；試劑G0.3g瓊脂糖，使其中含溴化乙錠15μg；滅菌牙簽一包。
實施例4一種溶藻弧菌檢測試劑盒，由下述試劑組成試劑A將2.0g普通營養(yǎng)肉湯與50mL的陳海水混合，經(jīng)0.5Kpa高壓滅菌制成；
試劑B將10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液5.0μL、Taq DNA聚合酶3U、滅菌雙蒸水19μL混合制成；試劑C將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.8μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.8μL，10mM dNTPs 0.8μL，25mM MgCl24.0μL混合制成；試劑D100ng/mL的溶藻弧菌的基因組總DNA；試劑E滅菌雙蒸水；試劑F取50mL 20倍TBE電泳緩沖液，使其中含有0.09mol羥基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol EDTA制成；試劑G0.6g瓊脂糖，使其中含溴化乙錠30μg；滅菌牙簽一包。
實施例5一種溶藻弧菌檢測試劑盒，由下述試劑組成試劑A將1.5g普通營養(yǎng)肉湯與50mL的陳海水混合，經(jīng)0.2Kpa高壓滅菌制成；試劑B將10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL、Taq DNA聚合酶2U、滅菌雙蒸水18μL混合制成；試劑C將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.5μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.5μL，10mM dNTPs 0.5μL，25mM MgCl23.0μL混合制成；試劑D40ng/mL的溶藻弧菌的基因組總DNA；試劑E滅菌雙蒸水；試劑F取50mL 20倍TBE電泳緩沖液，使其中含有0.09mol羥基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol EDTA制成；試劑G0.4g瓊脂糖，使其中含溴化乙錠20μg；滅菌牙簽一包。
實施例6所述溶藻弧菌的基因組總DNA是用下述方法提取的取在2216E平板上培養(yǎng)18小時(也可以是培養(yǎng)20小時或24小時)的溶藻弧菌，用滅菌的雙蒸水制成菌懸液，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Bacterial Genomic DNA Mini-prep Kit)提取溶藻弧菌的基因組總DNA，做為陽性對照。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Bacterial Genomic DNA Mini-prep Kit)為天為時代公司產(chǎn)品。溶藻弧菌購于中科院微生物研究所。
實施例7用本發(fā)明的一種溶藻弧菌檢測試劑盒檢測方法如下1、樣品處理取0.1-0.3g或100-300μL樣品，加入800μL試劑A，用滅菌的牙簽充分搗碎樣品組織，37℃ 8-12h，3000rpm/min離心1min；2、取600μL上清，13000rpm/min離心5min，棄上清；3、加20μL試劑E，用加樣槍頭輕輕攪動沉淀使其充分懸?。?
4、95℃處理15min，稍離心，上清作為細(xì)菌DNA的提取液；5、PCR擴(kuò)增取18.1μL試劑B與4.9μL試劑C混合，加入2μL細(xì)菌DNA提取液，同時分別取2μL試劑D和試劑E分別加入另外兩個18.1μL試劑B與4.9μL試劑C混合的PCR反應(yīng)管中，分別作為陽性對照和空白對照，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃ 2min預(yù)變性，94℃ 40sec，58℃ 45sec，72℃ 1min，29個循環(huán)，72℃ 10min，4℃保存；6、反應(yīng)結(jié)束后，取試劑F用蒸餾水做40倍稀釋，將試劑G倒入100mL的三角瓶內(nèi)，加入稀釋后的試劑F，加熱，直至溶液清亮，稍冷卻，倒入制膠槽；7、取5-10μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物加2μL上樣緩沖液，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳30-35min后于紫外儀上觀察，若在485bp處出現(xiàn)反應(yīng)條帶，則為溶藻弧菌陽性，若無條帶為陰性，陽標(biāo)應(yīng)在485bp處出現(xiàn)反應(yīng)條帶，空白應(yīng)無反應(yīng)條帶。
圖1中M為DL2000 Marker(從上到下分子量依次為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1為空白對照；2為陽性樣品；3為陽性對照。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測溶藻弧菌的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物組成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQID No2所述的核苷酸序列。
2.一種溶藻弧菌檢測試劑盒，其特征是由下述試劑組成試劑A將0.5-2.0g普通營養(yǎng)肉湯與50mL的陳海水混合，經(jīng)0.1-0.5Kpa高壓滅菌制成；試劑B將10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液1.5-5.0μL、Taq DNA聚合酶1-3U、滅菌雙蒸水17-19μL混合制成；試劑C將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.2-0.8μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.2-0.8μL，10mM dNTPs 0.2-0.8μL，25mM MgCl21.0-4.0μL混合制成；試劑D20-100ng/mL的溶藻弧菌的基因組總DNA；試劑E滅菌雙蒸水；試劑F取50mL 20倍TBE電泳緩沖液，使其中含有0.09mol羥基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol乙二胺四乙酸制成；試劑G0.3-0.6g瓊脂糖，使其中含溴化乙錠15-30μg。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種溶藻弧菌檢測試劑盒，其特征是所述試劑A為將1.25g普通營養(yǎng)肉湯與50mL的陳海水混合，經(jīng)0.1-0.5Kpa高壓滅菌制成；所述試劑B為將10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL、Taq DNA聚合酶1.25U、滅菌雙蒸水17.25μL混合制成；所述試劑C為將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.5μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.5μL，10mM dNTPs 0.5μL，25mM MgCl21.5μL混合制成；所述試劑D為40-60ng/mL的溶藻弧菌的基因組總DNA；所述試劑G為0.3g瓊脂糖，使其中含溴化乙錠20μg。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種溶藻弧菌檢測試劑盒，其特征是所述溶藻弧菌的基因組總DNA是用下述方法提取的取在2216E平板上培養(yǎng)18-24h的溶藻弧菌，用滅菌的雙蒸水制成菌懸液，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取溶藻弧菌的基因組總DNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測溶藻弧菌的引物序列及檢測試劑盒，檢測試劑盒由下述試劑組成，試劑A將普通營養(yǎng)肉湯與陳海水混合，經(jīng)高壓滅菌制成；試劑B將PCR反應(yīng)緩沖液、Taq DNA聚合酶、滅菌雙蒸水混合制成；試劑C將SEQ ID No1、SEQ ID No2所述的核苷酸序列，dNTPs，MgCl
文檔編號C12N15/11GK1944667SQ200610016170
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月19日
發(fā)明者孫金生, 薛淑霞, 李翔, 耿緒云, 胡金城 申請人:天津市水產(chǎn)研究所