(該套載體由清華大學(xué)劉玉樂教授于2013年4月28日贈(zèng)于本發(fā) 明小組，其中包括TRV RNAl和TRV RNA2，TRV病毒有兩個(gè)組份，TRV RNAl和RNA2,需要同時(shí)注 射運(yùn)兩個(gè)才能侵染;一般RNAl沒有多克隆位點(diǎn)，序列都是插入到RNA2中，所W我們的序列都 是插入到RNA2中，侵染是混合含有RNAl的菌液，就可W侵染煙草了。同時(shí)該載體也是一個(gè)通 用普通的載體，在其它公知的載體上也是可用的，效果與本發(fā)明類似，具體數(shù)據(jù)略）上，
bZIPeO就巧對(duì)耐白Autcq壇方Mr?.7、.
[0化1 ]
[0052] 引物巧計(jì)如下：
[0053] bZIP60-XbaI:5'GCCTAAATTT GTTTCGTCTC3'（SEQ N0:8)
[0054] bZIP60-SmaI:5，CAATACACTT CCAGACTATC 3,（沈Q N0:9)
[0055] 獲得TRV:VIGS-bZIP60質(zhì)粒。在具體使用時(shí)采用TRV RNA2空載體(TRV:00)為陰性 對(duì)照，即TRV RNAl加TRV: VIGS-bZIP60為沉默組，TRV RNAl加TRV: 00為對(duì)照組。 障]實(shí)施例子3:轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及菌種保存
[0057]取-70°C保存的邸A105農(nóng)桿菌(本實(shí)驗(yàn)室保存，也可是常用的農(nóng)桿菌)感受態(tài)，置冰 上融解。取化1抽純PVX:pU和TRV: VIGS-bZIP60質(zhì)粒各加入到一支10化1感受態(tài)中，混勻，加 入到處理好的電擊杯。設(shè)置2.2kV電壓，電擊轉(zhuǎn)化。分別電擊完成后加入90化1的液體YEP培 養(yǎng)基(每升含有：牛肉浸膏l(xiāng)Og，酵母提取液lOg，化Cl 5g，PH 7.0)。28°(：，200巧111搖床培養(yǎng) 2h，菌液分別涂布在含抗生素50]ig/ml卡那霉素化an)和10化g/ml利福平(Rif)平板上，28°C 培養(yǎng)至形成單菌落。各挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于含50]ig/ml Kan、100]ig/ml Rif的液 體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm搖培16h，各取化1菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)。分別取檢測(cè)結(jié)果為陽性的 PVX:pll和TRV:VIGS-bZIP60菌液混合15-30%甘油，置甘油管中，于-70°C超低溫冰箱中保 存。
[005引其中，同時(shí)對(duì)各自的對(duì)照質(zhì)粒載體做如上相同方法的轉(zhuǎn)化，并且獲得含有對(duì)照質(zhì) 粒載體的轉(zhuǎn)化菌作為后期對(duì)照處理(PVX: GFP; TRV: RNAl; TRV: 00)。
[0059] 實(shí)施例子4: Pl 1蛋白誘導(dǎo)IPR反應(yīng)及IPR相關(guān)的細(xì)胞程序性死亡
[0060] 挑取PVX: P11 (陽性）和對(duì)照PVX: GFP單斑接種于含有Kan (50mg/L)和Rif (50mg/L) 抗性的YEP培養(yǎng)基中28 °C過夜振蕩培養(yǎng);然后比例（1:100)轉(zhuǎn)接到相同抗性的LB培養(yǎng)基中， 生長至對(duì)數(shù)生長期(A600值約為0.6-0.8)，經(jīng)8000巧m/min離屯、5min收集菌體；用含終濃度 為IOmM MgC12，10mM MES(pH 5.6)，200uM乙酷下香酬(Ace)的無菌水重懸浮，調(diào)整菌液濃度 至A600為1.0;在室溫下放置3小時(shí)W上。
[0061] 用Iml注射器(無針頭)吸取農(nóng)桿菌菌液待用。選取4~6片真葉的本氏煙，在葉片背 面將菌液滲透注射到葉片組織間隙中。每個(gè)處理注射6~8株，將浸潤好的植株在暗處放置3 ~6小時(shí)后移到25°C溫室中培養(yǎng)（16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗交替）。接種后第8天，觀察發(fā)現(xiàn)接 種了 PVX:pll的植株系統(tǒng)葉發(fā)生了嚴(yán)重的程序性壞死，而對(duì)照組PVX:GFP未見有壞死（圖2)， 說明可W進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。運(yùn)也說明處理有PVX:pll的煙草由于大量表達(dá)Pll而致死煙草葉 片或者甚至整個(gè)植物，運(yùn)也就說明該煙草植株發(fā)生了 IPR反應(yīng)而且一直持續(xù)而不能解除，從 而導(dǎo)致程序性死亡。
[006。實(shí)施例子5:本氏煙IPR細(xì)胞因子bZIP60的鑒定
[0063]挑取 TRV: RNAl 巧 RV: VIGS-bZIP60 (陽性)和對(duì)照 TRV: 00 (TRV: RNAl 巧 RV: 00)的單斑 接種于含有Kan (50mg/L)和Rif (50mg/L)抗性的YEP培養(yǎng)基中28 °C過夜振蕩培養(yǎng)。菌液處理 和滲透注射同第實(shí)施例子4。共兩組處理分別為TRV:RNAl+TRV:VIGS-bZIP60和TRV = RNAl + TRV: OO，各6株植物，注射后第10天，取樣品和對(duì)照植株的系統(tǒng)葉，Tri ZOl提取總RNA，合成第 一鏈cDNA( W上操作同實(shí)施例子 1 中的步驟）JastStart Universal SYBR Green Master (Roche試劑盒，產(chǎn)品號(hào)：04913850001)用來進(jìn)行定量PCR檢測(cè)植株bZIP60的下調(diào)情況，具體 步驟如下：
[0064]
[00化]定量引物如下，其中NB-Actin為內(nèi)參基因：NB-Actin forward:
[0066] AAGACCAGCTCATCCGTGGA(SEQ NO：10)；NB-Actin reverse:
[0067] CTCATCCTATCAGCAATGCCC(沈Q N0:111)。
[006引 目的bZIP60基因引物如下：
[0069] bZIP60 forward:CCTGCTTTGGTTCATGGGCATCAT(沈Q N0:12)
[0070] bZIP60 reverse:AGAAGACCGTGGTTTCTGCTTCGT(沈Q N0:13)
[0071] 在實(shí)時(shí)巧光定量PCR儀中進(jìn)行如下反應(yīng):預(yù)變性95°C3min;94°C15sec、58°C15sec、 72°C30sec，進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin。
[0072] 結(jié)果顯示（圖3)與對(duì)照植株相比，VIGS植株的bZIP60下調(diào)了 75%左右（圖3)。表明 浸潤了TRV RNAl加TRV:VIGS-bZIP60與對(duì)照組TRV RNAl加TRV:00相比，IPR標(biāo)志因子bZIP60 明顯下調(diào)，可用于下一步的鑒定驗(yàn)證。
[007引實(shí)施例子6:本氏煙IPR細(xì)胞因子bZIP60的鑒定
[0074] 在發(fā)生沉默bZIP60的植株(實(shí)施例子5中鑒定的植株)和對(duì)照植株上同時(shí)接種PVX: Pll。在接種第7天和第30天分別觀察接種葉和系統(tǒng)葉的壞死情況，發(fā)現(xiàn)沉默了bZIP60植株 的壞死程度明顯比對(duì)照要緩和（圖4)。從運(yùn)一實(shí)驗(yàn)結(jié)果可W知道，bZIP60是WR反應(yīng)中的一 個(gè)標(biāo)記基因，通過該系統(tǒng)的檢測(cè)表明，當(dāng)與UPR相關(guān)的細(xì)胞因子被沉默后，PVX:pll誘導(dǎo)的 UPR相關(guān)的細(xì)胞壞死程度要明顯減輕。運(yùn)一結(jié)果表明，含有PVX:pll基因的載體可W用來檢 測(cè)一些與WR相關(guān)的細(xì)胞因子是否真的存在，或者存在的時(shí)候?qū)R具體影響的程度，例如 檢測(cè)它們各自的相對(duì)表達(dá)量，運(yùn)樣結(jié)合表觀現(xiàn)象與分子水平來評(píng)估與UPR相關(guān)的已經(jīng)存在 的植物因子的具體影響。
[0075] 從另一方面講，當(dāng)需要發(fā)現(xiàn)一些未知的UPR因子的時(shí)候，也可W用含有本發(fā)明的 PVX:pll基因的載體(例如質(zhì)粒載體或者含有該質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化載體，例如農(nóng)桿菌，大腸桿 菌，酵母桿菌等)進(jìn)行如上的實(shí)驗(yàn)，可W發(fā)現(xiàn)一些未知的UPR植物因子。
[0076] 在本發(fā)明中，我們同樣進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)，例如把本發(fā)明克隆的Pll基因序列(SEQ N0:4)替換成已經(jīng)公開的類似的基因序列(AJ292229)SEQ N0:1進(jìn)行如本發(fā)明的同樣的轉(zhuǎn)化 和鑒定，卻并沒有發(fā)現(xiàn)有價(jià)值、有意義的結(jié)果。特別的，通過該系統(tǒng)的檢測(cè)表明，當(dāng)與WR相 關(guān)的細(xì)胞因子被沉默后，PVX:Pl 1 (SEQ NO: 1)誘導(dǎo)的IPR相關(guān)的細(xì)胞壞死程度并沒有明顯減 輕(具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)略）。運(yùn)似乎進(jìn)一步說明了本發(fā)明的PVX:pll基因 W及該P(yáng)ll基因具有獨(dú)特 的用途，至于具體機(jī)理目前還不清楚。運(yùn)可能是，植物發(fā)生WR的過程是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的生 理過程，現(xiàn)在已知的參與UPR的植物因子還是相當(dāng)?shù)挠邢?，且很多是通過同源分析酵母和哺 乳動(dòng)物的UPR因子得來。
[0077]運(yùn)也進(jìn)一部證明，本發(fā)明創(chuàng)建的在本氏煙中PVX:pll誘導(dǎo)IPR相關(guān)的細(xì)胞程序性壞 系統(tǒng)能夠有效檢測(cè)出與WR相關(guān)的細(xì)胞因子，為鑒定新的植物來源的WR相關(guān)因子提供了 有效手段。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種含有PVX: pi 1侵染性克隆質(zhì)粒在篩選或鑒定本氏煙中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR反應(yīng)相關(guān)植 物因子中的用途，其中，其中編碼P11蛋白的基因序列如SEQ N0:4所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中該用途還包括:將大蒜X病毒(Garlic virus X)分 離物編碼的pll蛋白的基因序列插入到PVX侵染性克隆載體pgR106中獲得質(zhì)粒載體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，在所述獲得質(zhì)粒載體的方法中還包括如下步驟:通過酶 切連接的方法，在該P(yáng)I 1基因兩端引入Clal和SalI，然后連接到用相同酶切酶切的PVX侵染 性克隆載體pgR106中。4. 一種植物UPR相關(guān)因子的鑒定方法，該方法包括:利用大蒜X病毒(Garlic virus X) 分離物編碼的Pll蛋白的基因序列插入到PVX侵染性克隆載體pgR106中獲得過質(zhì)粒載體，其 中編碼P11蛋白的基因序列如SEQ N0:4所不。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，通過酶切連接的方法，在該P(yáng)11基因兩端引入Clal 和Sail，然后連接到用相同酶切酶切的PVX侵染性克隆載體pgR106中。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，將bZIP60基因3'末端300bp的序列通過限制性酶 切位點(diǎn)Xbal和Smal連接插入到相同酶切位點(diǎn)的TRV RNA2載體上獲得含有bZIP60基因的質(zhì) 粒載體。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，分別將包括有pi 1基因的克隆載體pgR106和包括 有bZIP60基因的TRV RNA2載體通過電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，對(duì)獲得的陽性農(nóng)桿菌載體對(duì)煙草葉片進(jìn)行接種， 其中先在煙草葉片上接種包括有bZIP60基因的TRV RNA2載體的農(nóng)桿菌表達(dá)菌液，然后再在 同一煙草植物上接種包括有pll基因的克隆載體pgRl〇6的農(nóng)桿菌表達(dá)液。9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8之一所述的方法，其中，bZIP60基因的部分序列如SEQ NO: 7所示。10. 如SEQ N0:4所示的基因在篩選或鑒定本氏煙中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR反應(yīng)相關(guān)植物因子中 的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一個(gè)用于鑒定與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR反應(yīng)相關(guān)植物因子的基因及其應(yīng)用。本發(fā)明將一種大蒜X病毒(Garlic virus X,GarVX)編碼的p11蛋白嵌合到馬鈴薯X病毒(Potato virus X,PVX)中，根據(jù)接種了嵌合病毒后癥狀表型的差異在本氏煙的病毒誘導(dǎo)基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)的植株中篩選出與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)相關(guān)的植物因子。
【IPC分類】C12N15/82, C12N15/66, C12N15/29
【公開號(hào)】CN105695480
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610137501
【發(fā)明人】魯宇文, 燕飛, 彭杰軍, 趙晉平, 鄭紅英, 林林, 程曄, 陳劍平
【申請(qǐng)人】浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2016年6月22日
【申請(qǐng)日】2016年3月11日