-40蛋白購(gòu)于Sigma公司。化合物（I) 為自制，HPLC歸一化純度大于98% dDMEM/F12培養(yǎng)基(進(jìn)口分裝購(gòu)于北京賽默飛世爾生物化 學(xué)制品有限公司。Newbom Calf Serum購(gòu)于Beijing Solarbio Science&Technology Co.， LtcLMTT購(gòu)于美國(guó)Amresco公司。凱基AnnexinV-FITC細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生 物技術(shù)有限公司。多聚甲醒購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Bcl-2多克隆抗體購(gòu)于武 漢博±德生物技術(shù)有限公司。Bax多克隆抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。切t-c多 克隆抗體購(gòu)于武漢博±德生物技術(shù)有限公司。羊抗兔IgG/FITC購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有 限公司。羊抗鼠 IgG/化+L)購(gòu)于江蘇碧云天生物公司。正常山羊血清購(gòu)于武漢博±德生物技 術(shù)有限公司。SABC免疫組化試劑盒購(gòu)于武漢博±德生物工程有限公司。DAB顯色試劑盒購(gòu)于 武漢博±德生物技術(shù)有限公司。
[0027] 電子分析天平(FA2004型，上海雷磁精密科學(xué)儀器公司），水浴鍋化H ? SI1-4型，北 京醫(yī)療器械廠），酶標(biāo)儀化Lx-800型，美國(guó)Bio-Tek),流式細(xì)胞儀化PIC化-M化型，美國(guó) Beckman Couiter公司），高速冷凍離屯、機(jī)（3K30型，美國(guó)Sigma公司，二氧化碳培養(yǎng)箱（CO- 150型，美國(guó)NBS有限公司），化YMPUS巧光顯微鏡(BX41型，帶DP70攝像系統(tǒng)，日本Olympus公 司產(chǎn)品）。
[002引二、試驗(yàn)方法
[0029] 1、A執(zhí)-40解育
[0030] A&-40用去離子水配制成1000皿ol/L儲(chǔ)存液并分裝，放置于冰箱-20°C儲(chǔ)存，臨用 用前一周取出在37°C培養(yǎng)箱解育7d，使之聚集老化。
[0031] 2、細(xì)胞的培養(yǎng)
[0032] PC12細(xì)胞株用含10%胎牛血清、10011/而青霉素、1001]/1吐鏈霉素的0161/。12培養(yǎng) 基在玻璃培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，0)2細(xì)胞培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為37 °C，5 % C〇2濃度，飽和濕度，待細(xì)胞 長(zhǎng)至80%豐度后用0.25%的膜酶消化傳代1次(約2-3d)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，實(shí) 驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板用無血清培養(yǎng) 基培養(yǎng);流式細(xì)胞儀檢測(cè)前將細(xì)胞接種至6孔培養(yǎng)板用無血清培養(yǎng)既培養(yǎng);免疫組化實(shí)驗(yàn)均 用24孔培養(yǎng)板爬片法培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。
[0033] 3、細(xì)胞給藥處理及分組
[0034] 細(xì)胞共分為五組，無血清培養(yǎng)基接種Mh后進(jìn)行藥物干預(yù)：①正常對(duì)照組：正常 PC12細(xì)胞;②模型組:25皿ol/L A&-4();③化合物（I)低劑量組:25皿ol/L A&-4()+50mg/L化合 物（I);④化合物（I)中劑量組：2化mo 1/L A&-40+1 OOmg/L化合物（I);⑤化合物（I)高劑量 組:25皿ol/LA&-4Q+200mg/L化合物（I)。藥物處理24h后進(jìn)行檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。
[0035] 4、MTT檢測(cè)各組細(xì)胞活力
[0036] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，膜酶消化后Wl X IO5個(gè)/mL的細(xì)胞密度，每孔10化L接種于 96孔板中無血清培養(yǎng)2地，然后按照上述分組方法進(jìn)行藥物干預(yù)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，2地后， 每孔加入5mg/mL的MTT溶液20化繼續(xù)在C〇2細(xì)胞培養(yǎng)箱中解育地，然后取出96孔培養(yǎng)板，棄 去上清液，每孔加入15化L的DMS0,放在搖床上振蕩lOmin，待紫色結(jié)晶完全溶解后用酶標(biāo)儀 在490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光值。W只加培養(yǎng)液的孔為調(diào)零參照，細(xì)胞活力用百分比表 達(dá)，視對(duì)照組的細(xì)胞活性為100%。結(jié)果計(jì)算：細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD 值)/(對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）X 100%。
[0037] 5、統(tǒng)計(jì)分析
[0038] 采用SPSS17.0分析軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(占:S)表示，組間采用LS化k較，P<〇.05為具有顯著性差異，P<0.Ol為極其顯著性 差異，圖表由Excel 2003繪制。
[0039] S、結(jié)果及結(jié)論
[0040] MTT測(cè)試結(jié)果顯示，與正常組細(xì)胞比較，模型組細(xì)胞活性明顯降低(P<0.01)，化合 物（I)干預(yù)后細(xì)胞活性有所提高，其中高、中劑量組細(xì)胞活性的升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.0 l，P<0.05)，低劑量組細(xì)胞活性改變不大(P〉0.05)。見表1 (與模型組比較沖<0.05，*沖< 0.01)。
[0041 ]表1MTT法化合物（I)對(duì)A執(zhí)-40誘導(dǎo)PCl2細(xì)胞活性的影響（jtts，n = 6) 「00471

L0043J 結(jié)論，本研冗證實(shí)A&-40的毒性損害神經(jīng)細(xì)胞，引起PC12大量調(diào)t：，細(xì)胞巧性下降， 化合物（I)干預(yù)后調(diào)亡情況得到改善。因此，該化合物（I)具備在治療保護(hù)神經(jīng)類藥物上具 有醫(yī)藥用途和前景。
[0044] 實(shí)施例3
[0045] 片劑的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或巧樣 酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0046] 實(shí)施例4
[0047] 口服液的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或巧 樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口 服液。
[004引實(shí)施例5
[0049]膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒 石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[00加]實(shí)施例6
[0051]注射液的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或巧 樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0化2] 實(shí)施例7
[0053] 無菌粉針的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水 中，攬拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安飯中，低溫冷凍干燥后無 菌烙封 得粉針劑。
[0054] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有醫(yī)藥用途的黃酮類化合物，具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物α)，2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：（a)將馬鞭 草的干燥地上部分粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用 石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁 醇萃取物；（b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫10個(gè)柱體積， 再用75%乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏； (c)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、40:1、20:1、10:1 和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分 離，依次用體積比為25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至1」3個(gè)組分；（e)步驟⑷ 中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度 洗脫，收集9~13個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述用乙醇熱回流提取 采用的乙醇濃度為75 %。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的黃酮類化合物及其制備方法，屬于藥物領(lǐng)域，具體涉及從馬鞭草的干燥地上部分中分離得到的一種新的黃酮類化合物、制備方法和該化合物的醫(yī)藥用途。該化合物為首次報(bào)道，可以從馬鞭草的干燥地上部分中提取、分離純化得到，純度高。體外試驗(yàn)證明Aβ1-40的毒性損害神經(jīng)細(xì)胞，引起PC12大量凋亡，細(xì)胞活性下降，化合物(Ⅰ)干預(yù)后凋亡情況得到改善，可以進(jìn)一步研究開發(fā)成神經(jīng)保護(hù)的藥物。
【IPC分類】A61P25/00, C07D493/18, A61K31/357
【公開號(hào)】CN105669694
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610105210
【發(fā)明人】王賽波
【申請(qǐng)人】溫州統(tǒng)益生物醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年2月26日