新型抗-Fc-γ受體IIB抗體及其用圖
【專利說明】新型抗-Fc- γ受體I IB抗體及其用途
【背景技術】
[0001]作為蛋白質的免疫球蛋白基因超級家族的成員，Fey RII受體是由兩個細胞外免 疫球蛋白結構域、一個單跨膜結構域和一個長度變化的胞漿結構域組成的單一多肽鏈 40kDa完整膜結合的糖蛋白。Fc γ RII受體在多種造血細胞上表達，是人血小板和巨核細胞 上的唯一Fc-受體（Cassel，McKenzie, 1993)。已知人的三種Fc γ RII受體，Fc γ RIIA、Fc γ RIIB和FcyRIIC，它們均結合IgG(例如以1-2X106M4的親和性結合IgG〇或免疫復合物（IC， 例如IgG調理的病原體）dFc γ RIIA和Fc γ RIIB主要由于胞質結構域中的差異而互不相同， 所述差異最終導致受體連接后的功能性異質反應。Fc γ RIIA觸發(fā)導致細胞的活化(例如吞 噬作用和呼吸爆發(fā)），而Fc γ RIIB起始抑制性信號，從而導致例如Β細胞活化的抑制。Fc γ RIIC與Fc γ RIIB共享胞外結構域，與Fc γ RIIA共享胞質結構域，從而在結合IgG或1C后傳遞 活化信號。Fc γ RIIB在除T細胞和NK細胞以外的所有白細胞上表達，是在人B細胞上表達的 唯一的抑制性Fc受體。單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞共表達 活化的Fc γ RIIA，而抑制性Fc γ RIIB受體和Fc γ RIIC在自然殺傷細胞(NK細胞)上表達并構 成該類細胞上的唯一 Fey R。已知Fey RIIB的兩種在生物學功能不同的同種型。Fey RIIB-1 唯一地在B細胞上表達，而發(fā)現在1C結合后引起內吞-/吞噬作用誘導的Fc γ RIIB-2在所有 其他？。丫1?1113表達細胞上表達(附11111161'」&1111，1^￥61:。11，2008)。
[0002] ?〇丫1?118在胞外區(qū)中與？〇丫1?114享有93%的同源性。如上所述^〇丫1?118與卩〇丫 RIIA之間的主要差異存在于胞質結構域。Fc γ RIIB包含ΙΤΙΜ(基于免疫受體酪氨酸的抑制 基序），而Fc γ RIIA包含ΙΤΑΜ(基于免疫受體酪氨酸的活化基序）。
[0003] 通過1C結合的FcyRIIA簇集引起ΙΤΑΜ基序與引發(fā)ΙΤΑΜ基序(共有序列:￥12-171-X 8-Y-X2-L/I，Isakov，1997)中酪氨酸殘基磷酸化的受體相關激酶的共定位以及隨后與激酶 Syk相互作用，所述激酶Syk通過大量下游信號傳導和基因活化事件來引發(fā)細胞的活化 (Ghazizadeh等，1994)。結合活性Fc γ RIIA的免疫球蛋白引起促炎性反應，該促炎性反應隨 后導致病原體的去除，但在自身抗體的情況下，還可導致健康組織的破壞，從而達到病理性 自體免疫疾病峰。因此，需要對抗體特異性的嚴格控制和否定性反饋系統(tǒng)來避免免疫系統(tǒng) 對機體的異常破壞。所述抑制性Fc γ RIIB受體就是該否定性反饋系統(tǒng)的一部分。
[0004] Fc γ RIIB的特征在于在胞質結構域中存在Ι??Μ基序(共有序列:V/I-X-Y-X2-V/L， Isakov，1997)，其在Ig-聚集體或1C結合和與攜帶ΙΤΑΜ的活化Fc γ受體共連接后被激酶Lyn 磷酸化。經磷酸化的ITIM吸引多磷酸肌醇5'-磷酸酶的SH2-結構域(SHIP)，SHIP轉而水解磷 酸肌醇信使，所述磷酸肌醇信使由于含ITAM的FeyR-介導的酪氨酸激酶活化而釋放，因而 阻止細胞內Ca 2+的流入。Fc γ RIIB交聯抑制對Fc γ R連接的活化反應，其繼而抑制B細胞活 化、增殖和抗體分泌。
[0005] Fey RIIB具有兩種抑制活性。如上所述，其一依賴于ΙΤΙΜ基序并在Fey RIIB連接 到攜帶ΙΤΑΜ的受體(例如Fey RIIA)時發(fā)生，導致ΙΤΑΜ觸發(fā)的鈣動員和細胞增殖的抑制。這 就意味著諸如脫粒作用、吞噬作用、ADCC、細胞因子釋放和促炎活化的鈣依賴性過程以及Β 細胞增殖都被Fc γ RIIB阻斷。Fc γ RIIB的第二種抑制活性包括Β細胞上受體的同型聚集(Fc γ RIIB簇集）。同型聚集將促細胞凋亡信號遞送到細胞質中，這可被Fc γ RIIB與B細胞受體 (BCR)的連接所阻斷。多價-抗原結合后的BCR信號傳導的特征在于簇集的BCR通過Lyn(Src 家族的一種激酶)磷酸化。這種Lyn作用下的磷酸化與BCR和被稱作"脂筏"的富含鞘脂和膽 固醇的膜微結構域的聯合一起發(fā)生。這些不溶的"脂筏"在免疫突觸的形成中起著重要作 用。已觀察到，BCR與APC(抗原提呈細胞)上的抗原的相互作用致使在所接合的B細胞和APC 的界面處形成該免疫突觸。Fey RIIB與BCR的共連接使BCR與脂筏的聯合去穩(wěn)定，隨后阻斷B 細胞的免疫突觸的形成。BCR信號傳導的Fc γ RIIB抑制包含受體的細胞質結構域的ITIM中 的酪氨酸殘基被激酶Lyn磷酸化以及隨后的肌醇磷酸酶SHIP的募集(Daeron等.，1995， Ravetch and Bolland,2001)。
[0006] 科學界接受這樣的觀點：Fey RIIB可被看作外周B細胞發(fā)育過程中較晚檢查點 (checkpoint)，并且其還直接調節(jié)漿細胞存活。因此Fey RIIB被認為是用于治療B細胞障 礙、特別是B細胞介導的免疫反應的重要靶標。
[0007] 在小鼠和人中的研究已經闡明Fc γ RIIB對B細胞活性和體液耐受的影響，其中Fc yRIIB表達的降低或缺少造成了明顯的自身免疫性疾病的發(fā)展或加劇。事實上，Fey RIIB 在諸如原發(fā)免疫性血小板減少癥、全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎(RA)、大皰性天皰瘡、 尋常型天皰瘡和其他天皰瘡形式、B細胞驅動的多發(fā)性硬化癥的自身免疫性疾病以及其他 以病原性免疫復合物發(fā)展為特征的自身免疫性疾病的發(fā)展和過程中起到關鍵作用。在健康 個體的免疫反應期間，已經進入血液循環(huán)的病原體受到針對病原體生物體的表位的抗體 (免疫球蛋白，Ig)的調理，并繼而導致所謂的免疫復合物的形成。這些免疫復合物隨后會被 免疫系統(tǒng)的特定細胞(如巨噬細胞、中性粒細胞、吞噬細胞)所吞噬，這導致病原體生物體從 血液循環(huán)中被清除。另外已經證明，Fc γ RIIB在外周耐受性方面也起著關鍵作用，因為Fc γ RIIB敲除小鼠發(fā)展自發(fā)的自身免疫性疾病。Fc γ RIIB不足導致對誘發(fā)的自身免疫性疾病的 易感性(Bolland和Ravetch，2000)。
[0008] 與健康人相比，在遭受自身免疫性疾病的患者中，Fc γ RIIB在B細胞上的表達通常 會減弱或降低。然而例如幼稚Β細胞顯示出正常的Fc γ RIIB表達，來自RA患者的記憶Β細胞 和衆(zhòng)母細胞則顯示出這一受體的表達降低(Catal;in，2010) Jiang及同事也能夠表明，在來 自健康捐贈者的漿母細胞上通過表面耦合的抗-Fc γ RIIB抗體2.4G2的Fc γ RIIB交聯導致 細胞凋亡(Xiang等，2007)
[0009] 基于上述的Fey RIIB在自身免疫性疾病中的顯著作用，已經開發(fā)了針對該受體的 抗體，以便治療或診斷患者。W0 2009/083009公開了針對Fc γ RIIB兩種同種型的抗體，而TO 2004/016750公開了與內源表達于人細胞上的Fey RIIB的細胞外結構域特異性結合的抗 體，其親和力是與表達于人細胞上的Fc γ RIIA結合的此類抗體的親和力的至少10倍(記住 FcyRIIA和Fey RIIB的細胞外結構域享有高度同一性hEP 1 709 073公開了對Fey RIIB 具有高度特異性的抗體及其用于診斷和治療自身免疫性疾病、感染病、腫瘤和其他異常病 癥的用途。
[0010] 為了這樣的目的，十分需要使用對該受體具有高特異性和親和性的抗體。特別是 高特異性降低所述抗體交叉反應的風險，由此降低不利副作用，而高親和性增強其應用的 效力和功效。同時也需要這樣的抗體是非阻斷性的，即它們通過其可變區(qū)與Fc受體的結合 不會干擾免疫復合物（1C)或聚集的IgG與細胞的結合。而且，針對Fey RIIB的抗體的一個非 常有利的優(yōu)勢在于:其影響Fc γ RIIB抑制耦合機制以控制B細胞活化。也就是說，已知Fc γ RIIB的細胞內部分包含所謂的Ι??Μ，并且通過攜帶Ι??Μ的受體的信號傳導往往在免疫系統(tǒng) 的調節(jié)中是抑制性的。如上所述，已知Fc γ RIIB在被IgG分子的Fc部分結合時具有抑制性調 節(jié)功能。因此，需要利用Fey RIIB的抑制性調節(jié)功能，以期對包含在特別是自身免疫性疾病 中的B細胞進行控制?？偠灾M管現有技術已經公開了若干具有不同特異性和親和性的 抗Fc γ RIIB抗體，但仍然需要改善的抗Fc γ RIIB抗體用于治療、預防和診斷受試者的自身 免疫性疾病。
[0011]通過提供本文下文描述的、在權利要求中進行表征且通過隨附的實施例和附圖進 行說明的抗體，本申請滿足了這一需求。
[0012] 使本發(fā)明的發(fā)明人十分驚訝的是，他們觀察到本發(fā)明所提供的抗體顯著地增強了 ΙΤΙΜ的磷酸化。與現有技術中公開的也與Fc γ RIIB特異性結合的抗體相比，根據本發(fā)明所 述的抗體驚人地表現出意料之外的更強的對ΙΤΙΜ磷酸化的作用。這樣更強的作用是有益 的。尤其是活化-抑制耦合，即陽性信號與抑制環(huán)的配對，控制許多生物過程的量級和持續(xù) 時間。在Β淋巴細胞中，克隆型Β細胞受體(BCR)對抗原的識別誘導能夠指導克隆擴增、分化、 細胞因子釋放并最終產生Ig的信號。活化刺激物的枯竭以及包含抑制性Fc γ受體(Fc γ R) 即Fey RIIb(CD32B)的負反饋環(huán)的觸發(fā)防止不受控制的活化。后一種機制在BCR識別免疫復 合抗原時觸發(fā)，從而導致通過復合結合的IgG的Fc結構域的CD32B共存接合，因而防止與被 可溶性IgG識別的那種享有相同特異性的B細胞克隆的擴增。因此，成功的負調節(jié)策略應形 成用于負信號傳導環(huán)的分子基礎。

【發(fā)明內容】

[0013] 本發(fā)明提供的抗體在CD32B的ΙΤΙΜ磷酸化方面表現出顯著更強的作用，因而預期 它們對由CD32B的ΙΤΙΜ磷酸化觸發(fā)的負信號傳導環(huán)具有更強的影響，這繼而控制特別是包 含在自身免疫性疾病中的Β細胞。
[00?4]特別地，與未經所述抗體處理的Daudi細胞相比，本發(fā)明的抗體優(yōu)選地增強Daudi 細胞的？〇丫1?118的11']磷酸化。所述增強優(yōu)選為1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。從與〇)328 結合的現有技術抗體，既無法預料也無法預見本發(fā)明所述的抗體的有利性質，更不必說成 功提供它們的合理預期，特別是本文所表征的CDR或可變重和/或輕鏈。除了本發(fā)明抗體這 一改善的性質，本文所述的抗體還對人Fc γ RIIB具有高特異性和/或是非阻斷性的，即它們 通過其可變區(qū)與Fc受體的結合不會干擾免疫復合物(1C)或聚集的IgG與細胞的結合。
[0015]因此，本發(fā)明提供一種抗-Fc γ RIIB抗體，優(yōu)選為IgG型的抗-Fc γ RIIB抗體，所述 抗體在其重鏈可變區(qū)中包含SEQIDN0s.29、30和31中所示的H-CDRl、H-CDR2和H-CDR3，并 且在其輕鏈可變區(qū)中包含SEQ ID NOs. 32、33和34中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。相比 于未經所述抗體處理的Daudi細胞，所述抗體使Daudi細胞的Fc γ RIIB的ITIM磷酸化增強約 4至10倍。
[0016] 從圖7中明顯可見，現有技術抗體GB3(見W0 2005/051999)和2B6(見W0 2004/ 016750)不能如本發(fā)明的抗體(諸如8A6,或者作為嵌合的或作為人源化的8A6抗體)那樣增 強Fc γ RIIB的Ι??Μ磷酸化。故而能否增強Fc γ RIIB的Ι??Μ磷酸化似乎取決于CDR，特別是取 決于存在于8A6中而非GB3和/或2B6中的一些關鍵殘基。因此，僅存在于8A6的⑶Rs中的處于 對應于2B6或GB3的CDR內各自位置的位置處的氨基酸可以被看作"關鍵殘基"。
[0017] 對2B6、GB3和8A6中的CDR關鍵殘基的視覺比較表明，本發(fā)明的抗體在H-CDR1中包 含SEQIDN0.29中所示的氨基酸序列，在H-CDR2中包含SEQIDN0.30中所示的氨基酸序 列，在H-CDR3中包含SEQIDN0.31中所示的氨基酸序列，在L-CDR1中包含SEQIDN0.32中 所示的氨基酸序列，在L-⑶R2中包含SEQ ID NO.33中所示的氨基酸序列，在L-⑶R3中包含 SEQ ID NO.34中所示的氨基酸序列。
[0018] 8A6、GB3和2B6的⑶R的氨基酸序列之間的差異還可以被表示為在使用8A6的⑶R作 為參考序列時在本發(fā)明的抗體的CDR中所允許的同一性程度（以同一性百分比表示）。因此， 本發(fā)明的抗體的H-⑶R1優(yōu)選地表征為與SEQ ID N0.20中所示的H-⑶R1具有60%或更多（諸 如70%、80%或90% )同一性。
[0019] 本發(fā)明的抗體的H-CDR2優(yōu)選地表征為與SEQ ID如.21中所示的!《^2具有36% 或更多(諸如 40%、50%、60%、70%、80% 或 90%)同一性。
[0020] 本發(fā)明的抗體的H-CDR3優(yōu)選地表征為與SEQ ID ^).22中所示的!1-〇)1?具有50% 或更多（諸如60%、70%、80%或90% )同一性。
[0021] 本發(fā)明的抗體的L-CDR1優(yōu)選地表征為與SEQ ID ^).23中所示的1^-〇?1具有64% 或更多（諸如70%、80%或90% )同一性。
[0022] 本發(fā)明的抗體的L-CDR2優(yōu)選地表征為與SEQ ID ^).24中所示的1^-〇?2具有29% 或更多（諸如 30%、40%、50%、60%、70%、80% 或 90%)同一性。
[0023] 本發(fā)明的抗體的L-CDR3優(yōu)選地表征為與SEQ ID ^).25中所示的1^-〇?3具有78% 或更多(諸如80 %或90 % )同一性。
[0024]因此，本發(fā)明提供一種抗-Fey RIIB抗體，所述抗體在其重鏈可變區(qū)中包含與SEQ IDN0.20中所示的H-CDR1序列具有60%或更多同一性的H-CDR1序列，與SEQIDN0.21中所 示的H-CDR2序列具有36%或更多同一性的H-CDR2序列，與SEQ ID勵.22中所示的!1-〇)1?序 列具有50%或更多同一性的H-CDR3序列，與SEQ ID勵.23中所示的1^-〇)1?1序列具有64%或 更多同一性的L-⑶R1序列，與SEQ ID N0.24中所示的L-⑶R2序列具有29%或更多同一性的 L-CDR2序列，和與SEQ ID如.25中所示的1^-〇)1?3序列具有78%或更多同一性的1^-〇)1?3序 列。
[0025] 優(yōu)選地，所述抗體在其重鏈和輕鏈可變區(qū)⑶R中仍然包含如SEQ ID N0s.29、30、31 (Η-CDR)和SEQ ID從^.32、33、34〇^-〇)1〇中所定義的"關鍵殘基"。
[0026] 優(yōu)選地，相比于未經所述抗體處理的Daudi細胞，所述抗體使Daudi細胞的Fc γ RIIB的Ι??Μ磷酸化增強約4至10倍。
[0027] 本文所用術語"同一性百分比"是指在以如可得自www.clustal .org的ClustalW或 X技術或者等同技術所示例的最佳序列比對來比較兩個氨基酸序列時，序列內相應位置處 的相同氨基酸殘基的百分數。例如，在⑶R比對的情況下，SEQ ID NOs . 20-25中所示的每個 CDR(分別來自重鏈和輕鏈可變區(qū)）都分別作為重鏈或輕鏈可變區(qū)的目標CDR序列的參考序 列，例如SEQ ID N0.20的H-⑶R1與目標H-⑶R1比對。因此，比對兩個序列（參考序列和目標 序列），兩個序列之間相同的氨基酸殘基被識別，然后將相同氨基酸的總數分別除以SEQ ID 勵.20、21、22、23、24或25氨基酸的總數(氨基酸長度），具體取決于是比對!1-〇)1?1、!1-〇)1?2、 !1-〇?3、1^-〇01?1、1^-〇?2還是1^-〇)1?3。相除的結果是一個百分比值，即同一性百分比值/程 度。
[0028] SEQ ID NOs.14和20中所示的H-CDR1序列是SEQ ID勵.29中所示的!1-〇)1?1的優(yōu)選 序列種類。
[0029] SEQ ID N0s.l5和21中所示的H-CDR2序列是SEQ ID勵.30中所示的!1-〇)1?2的優(yōu)選 序列種類。
[0030] SEQ ID NOs.16和22中所示的H-CDR3序列是SEQ ID N0.31中所示的H-CDR3的優(yōu)選 序列種類。
[0031] SEQ ID NOs.17和23中所示的L-CDR1序列是SEQ ID勵.32中所示的1^-〇?1的優(yōu)選 序列種類。
[0032] SEQ ID N0s.l8和24中所示的L-CDR2序列是SEQ ID勵.33中所示的1^-〇?1的優(yōu)選 序列種類。
[0033] SEQ ID N0s.l9和25中所示的L-CDR3序列是SEQ ID勵.34中所示的1^-〇?3的優(yōu)選 序列種類。
[0034]因此，本發(fā)明提供一種抗-Fc γ RIIB抗體，優(yōu)選為IgG型的抗-Fc γ RIIB抗體，所述 抗體
[0035] (a)在其重鏈可變區(qū)中包含SEQ ID N0s.l4、15和16中所示的H-CDR1、H-CDR2和Η-CDR3,并且在其輕鏈可變區(qū)中包含SEQ ID N0s.l7、18和19中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3;或者
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