專利名稱：一種基于受體傳感器檢測苦味物質地那的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測技術，尤其涉及一種基于受體傳感器用于液相環(huán)境中檢測苦味物質地那的方法。
背景技術：
苦味物質檢測在食品科學、生物醫(yī)學、環(huán)境保護等領域具有重要的應用，具有十分廣闊的應用前景和市場開發(fā)價值。苦味化合物的種類多樣、結構各異，給檢測帶來諸多困難。傳統(tǒng)的檢測方法是基于質譜分析技術，所需儀器昂貴、操作復雜、分析檢測周期長，難以滿足當今對苦味物質現(xiàn)場、快速檢測的需求。新興的生物傳感器為解決這一難題提供了新的技術途徑。但是目前用于苦味物質檢測的生物傳感器多是利用類脂膜、溴化物等材料作為敏感元件，存在特異性差、靈敏度低和不穩(wěn)定的缺點，其應用難以滿足特異性苦味物質檢測的要求。因此，如何獲得高度特異的敏感元件，并實現(xiàn)敏感元件與二級傳感器的穩(wěn)定耦合是目前苦味物質檢測傳感器進一步發(fā)展亟需解決的難題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種基于受體傳感器檢測苦味物質地那的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:一種基于受體傳感器檢測苦味物質地那的方法，該方法包括以下步驟:
(1)制備苦味受體蛋白T2R4;
(2)將苦味受體蛋白T2R4固定在石英晶體微天平傳感器表面制成受體傳感器；
(3)將不含任何苦味物質的水溶液泵入密閉的檢測腔內，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達到一個穩(wěn)定的狀態(tài)后，再將含有某一確定濃度的苦味物質地那的溶液泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率再次穩(wěn)定后，諧振頻率的改變量即為此確定濃度的傳感器響應值，最后再泵入不含任何苦味物質的水溶液，清洗檢測腔，即完成一次檢測過程；至少間隔IOmin后，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩(wěn)定后，再泵入含有另一確定濃度的苦味物質地那的溶液進行下一次檢測；重復上述步驟，可以得到一系列苦味物質地那的濃度對應的傳感器諧振頻率改變量，得到地那濃度-諧振頻率改變量曲線；
(4)對于未知濃度的苦味物質地那，首先將不含任何苦味物質的水溶液泵入密閉的檢測腔內，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達到一個穩(wěn)定的狀態(tài)Ftl后，再將含有未知濃度的苦味物質地那的待測溶液泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩(wěn)定到F1后，得到諧振頻率改變量F1- F0,最后根據(jù)上述步驟3得到的地那濃度-諧振頻率改變量曲線得到待測溶液中苦味物質地那的濃度，實現(xiàn)液相中苦味物質地那的濃度檢測。進一步地，所述步驟(I)包括以下子步驟:
(1.0構建表達載體:含有人苦味受體基因T2R4和rho-tag信號肽序列全長cDNA的jmLpCEP4/rho-T2R4的基因序列如SEQ ID N0.1，構建苦味受體基因22的表達載體過程如下:首先，設計相應的引物，獲取和擴增苦味受體基因序列全長cDNA，并對苦味受體基因進行適當?shù)男揎?，上游引物序列如SEQ ID N0.2所示，下游引物序列如SEQ ID N0.3所示，聚合酶鏈式反應使用高保真聚合酶STAR在50 μ L反應體系中進行，溫度循環(huán)首先是94°C預變性30秒，接著進行29個循環(huán)的95°C變性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸60秒，最后是20 0C降溫20秒；擴增后的產(chǎn)物通過限制性內切酶的雙酶切反應亞克隆到表達載體的多克隆位點治μ /和Afoi /之間，完成苦味受體的表達載體的構建，并通過測序對基因序列進行鑒定得表達載體的基因序列如SEQ IDN0.4所示；
(1.2)人胚胎腎細胞HEK-293的培養(yǎng)和轉染:HEK_293細胞培養(yǎng)液為添加了體積百分比為10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μ g/mL)的DMEM，培養(yǎng)條件為37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱；轉染之前一天，HEK-293細胞被接種于六孔培養(yǎng)皿中，每孔接種0.5 2X IO5 cells/mL濃度的細胞500 μ L，在不含抗生素的培養(yǎng)液里生長至轉染前90-95%的融合度；轉染試劑為Iipofectamin 2000，使用步驟1.1構建好的表達載體pCEP4/rho-T2R4-hise轉染HEK-293細胞；每孔使用4 μ g表達質粒，首先把表達質粒用無血清培養(yǎng)液稀釋到50 μ L，混勻；再用無血清細胞培養(yǎng)液稀釋10 UL的脂質體轉染試劑Iipfectamin 2000至50 yL,在室溫下孵育5 min ;接著把稀釋的表達質粒和Iipfectamin2000混合,搖勻，室溫孵育20 min ;把100 μ L的混合液加到六孔板中每一個含有細胞和培養(yǎng)液的孔中，前后搖板混勻后，在37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱孵育24 h;含有特異性抗融合表達的His6-tag的苦味受體蛋白T2R4即可在細胞膜表面表達；
(1.3)苦味受體蛋白T2R4的提取:轉染后的HEK-293細胞用PBS清洗，并從六孔板收集；收集的細胞用超聲波探頭超聲5 min，然后16000 g離心40 min ;浮在表面的是細胞溶質部分，小球是膜部分；浮在表面的部分用丙酮沉淀，沉淀物和尿素標本緩沖液混合；小球用含有蛋白酶抑制劑雞尾酒的細胞裂解液在0°C冰凍條件下溶解30 min ;然后，將尿素樣品緩沖液加入到溶解的小球溶液中，即可獲得粗提的膜蛋白，其中含有異源表達于細胞膜上的苦味受體蛋白T2R4 ;含有苦味受體蛋白T2R4的細胞膜組分用于構建石英晶體微天平傳感器，細胞膜的疏水環(huán)境有利于保持苦味受體的結構和功能。所述步驟(2)具體為:本發(fā)明的苦味受體傳感器制備過程如下；在干凈的石英晶體微天平傳感器的金電極表面通過金硫鍵共價固定一層可以特異性識別融合表達的Hi s6-tag標簽的自組裝巰基化單鏈DNA適配體，該適配體由5’末端共價修飾了 HS-(CH2)6基團的SEQ ID N0.5所示的基因序列組成,反應條件為室溫下反應I小時；用質量百分比為1%的牛血清白蛋白封閉石英晶體微天平傳感器的金電極表面未反應的位點，封閉條件為室溫下I小時；把含有異源表達的苦味受體蛋白T2R4的細胞膜均勻涂覆在石英晶體微天平傳感器的金電極表面，并放在室溫孵育過夜，使苦味受體蛋白通過融合表達的His6_tag與適配體發(fā)生特異性的結合，實現(xiàn)在石英晶體微天平傳感器的金電極表面特異性固定和純化苦味受體蛋白T2R4的目的；石英晶體微天平傳感器的金電極表面用PBS沖洗，除去未結合的多余物質；完成石英晶體微天平傳感器的構建。本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明采用苦味受體蛋白作為傳感器的敏感元件，克服了傳統(tǒng)的苦味物質檢測傳感器中所采用的類脂膜、溴化物等材料存在的特異差、靈敏度低的缺點，可以實現(xiàn)液相環(huán)境中特異性苦味物質地那的檢測。該傳感器采用自組裝適配體固定苦味受體蛋白，不僅可以形成高度穩(wěn)定的自組裝敏感膜，提高傳感器的穩(wěn)定性，而且由于適配體和苦味受體蛋白間特異性的相互作用，可以實現(xiàn)膜受體的片上純化，細胞膜上其它蛋白由于缺乏與適配體的親和力，在制備傳感器的過程中會被沖洗去除，進而有利于提高受體蛋白在傳感器表面的固定效率和分布密度，最終有助于提高傳感器的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。該檢測方法檢測腔小，可以大大節(jié)約檢測試劑，顯著減少樣品的消耗量。此外，該傳感器采用石英晶體微天平作為二級傳感器，可以實現(xiàn)對苦味物質的實時、快速檢測，克服了基于質譜的檢測方法存在的檢測周期長、檢測流程復雜、無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測的缺點，適合應用于進一步開發(fā)便攜式苦味物質檢測傳感器。以上這些優(yōu)點和功能可以滿足液相環(huán)境中特異性苦味物質的實時快速檢測，可廣泛用于生物醫(yī)學、環(huán)境保護和食品行業(yè)等相關領域。


圖1是本發(fā)明用于特異性苦味物質檢測傳感器的檢測腔體結構 圖2是本發(fā)明苦味受體蛋白T2R4固定在石英晶體微天平傳感器表面的結構示意圖
圖3是本發(fā)明制備苦味受體蛋白的基因表達結構 圖4是本發(fā)明制備苦味受體蛋白的RT-PCR檢測結果 圖5是本發(fā)明表達有苦味受體蛋白的HEK-293細胞在可見光視野下的圖片。圖6是與圖5同一視野下的表達有苦味受體蛋白的HEK-293細胞熒光照片。圖7是本發(fā)明的傳感器檢測不同苦味物質的結果 圖8是本發(fā)明的傳感器檢測不同濃度地那的結果 圖中，注射泵1、第一硅膠導管2、第二硅膠導管3、廢液缸4、腔蓋5、固定柱6、上環(huán)狀墊圈7、石英晶體微天平傳感器8、下環(huán)狀墊圈9、傳感器電極接口 10、傳感器底座11、脂質雙分子層12、苦味受體蛋白13、融合表達的His6-tagl4、牛血清白蛋白15、適配體16、金電極17、石英晶體\B、Kpn /酶切位點19、Μ /酶切位點20、rho-tag信號肽21，苦味受體基因22、His6-tag 標簽基因 23。
具體實施例方式下面詳細介紹以苦味受體蛋白T2R4作為敏感元件的石英晶體微天平傳感器檢測苦味物質的基本原理以及具體步驟。本發(fā)明基于受體傳感器檢測苦味物質地那的方法，包括以下步驟:
1、制備苦味受體蛋白T2R4，該步驟包括以下子步驟:
1.1表達載體的構建 含有苦味受體基因22 (人苦味受體基因T2R4)和rho-tag信號肽21序列全長cDNA的質粒的基因序列如SEQ ID N0.1。采用基因工程技術，對苦味受體基因22進行適當改造，構建苦味受體基因22的表達載體。首先，設計相應的引物，獲取和擴增苦味受體基因序列全長cDNA，并對苦味受體基因進行適當?shù)男揎?。上游引物序列如SEQ ID N0.2所示:5’ -CGGGGTACCGAGAGCCGCAGCCATGAACGGCACAGAGGGCCC-3，，其中下劃線部分為 kozak序列，有助于提高受體蛋白的表達量；下游引物序列如SEQ ID N0.3所示:5’ -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTAATGGTGATGGTGATGATGTTTTTTGAAACAAAGAATC-3’，其中下劃線部分為序列23的反向互補序列，用于苦味受體蛋白13的標記以及與二級傳感器的耦合。聚合酶鏈式反應(PCR)使用高保真聚合酶STAR在50 μ L反應體系中進行，包括IyL pCEP4/rho~T2R4質粒，I μ L上游引物，I μ L下游引物，4 μ L濃度為IOmM的dNTP混合物，0.5 μ L高保真聚合酶STAR ，10 μ L PCR緩沖液(含Mg2+)和32.5 μ L去離子水；溫度循環(huán)首先是94°C預變性30秒，接著進行29個循環(huán)的95°C變性30秒、58 V退火30秒、72°C延伸60秒，最后是20 V降溫20秒。擴增后的產(chǎn)物通過限制性內切酶的雙酶切反應亞克隆到表達載體的多克隆位點命/7 /和/之間，完成苦味受體的表達載體的構建，并通過測序對基因序列進行鑒定得表達載體的基因序列如SEQ ID N0.4所示。1.2人胚胎腎細胞HEK-293的培養(yǎng)和轉染
HEK-293細胞培養(yǎng)液為添加了體積百分比為10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μ g/mL)的DMEM，培養(yǎng)條件為37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱。轉染之前一天，HEK-293細胞被接種于六孔培養(yǎng)皿中，每孔接種0.5 2X105 cells/mL濃度的細胞500μ L，在不含抗生素的培養(yǎng)液里生長至轉染前90-95%的融合度。轉染試劑為Iipofectamin2000 (Invitrogen,美國)，使用步驟1.1構建好的表達載體轉染HEK-293細胞。每孔使用4 μ g表達質粒，首先把表達質粒用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋到50UL,混勻。再用無血清細胞培養(yǎng)液稀釋10 μ L的脂質體轉染試劑Iipfectamin 2000至50 μ L,在室溫下孵育5 min。接著把稀釋的表達質粒和Iipfectamin 2000混合(總體積為100 μ L),搖勻，室溫孵育20 min。把100 μ L的混合液加到六孔板中每一個含有細胞和培養(yǎng)液的孔中，前后搖板混勻后，在37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱孵育24 h-48 h。含有特異性抗融合表達的His6-tagl4的苦味受體蛋白13即可在細胞膜表面表達，苦味受體蛋白13即為苦味受體蛋白T2R4。1.3逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)
采用RT-PCR的方法檢測苦味受體蛋白T2R4在mRNA水平的表達。HEK-293細胞轉染48 h后，按Trizol —步法提取細胞總RNA。首先，取出六孔板細胞至已滅好菌的超凈工作臺中，吸棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)洗一次。每孔加入0.5 mL Trizol試劑，用移液器吹打細胞，使細胞脫落，裂解。再將上述細胞的Trizol裂解液轉入1.5 mL EP管中，在室溫(15°C 30°C)下放置5 min。在上述EP管中，按照每I mL Trizol加0.2 mL氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15 S，在室溫下(15°C 30°C )放置2 3min后，12000 g(2°C 8°C )離心18 min ;樣品分為三層，底層為黃色的有機相，上層為水相和一個中間層。取上層水相置于新1.5 mL EP管中，按照每I mL Trizol加0.5 mL異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下(15°C 30°C)放置10 min, 12000 g (2°C 8°C )離心10 min。棄上清，按照每I mL Trizol加I mL 75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7500 g (2°C 8°C)離心5 min，棄上清。讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥。用不含RNA酶的水溶解RNA沉淀，提取的RNA放在-70°C冰箱保存。取5 yL RNA溶液在260 nm及280 nm波長下檢測紫外吸光度，估計其純度，并計算核酸含量(RNA 260 nm吸光度為I相當于40 μ g/mL)。將RNA溶液稀釋為0.2 yg/yL，取11 μ L RNA溶液，I yL隨機六聚引物，混勻，短暫離心數(shù)秒，70°C溫育5 min ;于冰浴下冷卻，依次加入4 μ L逆轉錄緩沖液、I μ LRnasin (20 U)和 2 μ L dNTP,混勻,短暫離心,25°C溫育 5 min ;加入 I μ L PrimeScript RTase (200 U/ μ L)逆轉錄酶，混勻，短暫離心，總量為20 μ L的反應體系于30°C溫育10min ；42° C反應45 min，在95°C條件下放置5 min停止反應。立即置冰上。產(chǎn)物放在_20°C保存。然后在50 μ L反應體系中加入2 μ g的逆轉錄產(chǎn)物作為模板進行PCR擴增，上游引物序列如 SEQ ID N0.2 所示:5’ -CGGGGTACCGAGAGCCGCAGCCATGAACGGCACAGAGGGCCC-3’ ；下游引物序列如 SEQ ID N0.3 所示:5’ -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTAATGGTGATGGTGATGATGTTTTTTGAAACAAAGAATC-3’ ；冰浴下，取2.5 U Taq DNA 聚合酶、2.0 μ L。0嫩模板、5.0 μ L PCR緩沖液、4.0 uL MgCl2U-O yL dNTP、上下游引物各0.4 Ug及去離子水35.5 μ L混勻，短暫離心；總量為50 μ L的反應體系于94°C預變性30 S，再以29個循環(huán)的95°C變性30秒、58°C退火30秒、720C延伸60秒擴增，最后20 V降溫20秒。稱取I g瓊脂糖，加入96 mLTBE緩沖液加熱使溶解，加入4 μ L 1% DNA green，配成質量百分比為I %的瓊脂糖凝膠；取標準DNA marker和PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠上點樣；110 V電壓下電泳30 min ;電泳后通過紫外成像系統(tǒng)觀察電泳條帶。1.4細胞免疫熒光鑒定
通過使用帶有突光標記的特異性抗His6-tagl4的單克隆抗體檢測融合了 His6-tagl4的苦味受體蛋白13在HEK-293的表達及其細胞膜上的分布情況。為進行熒光顯微鏡的觀察，先將轉染孵育好的細胞接種在六孔板中，370C，體積百分比濃度為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。再用0-4°C甲醇在_20°C靜置20 min，用PBS洗2遍，每次5 min。用體積百分比為10%的胎牛血清(FBS)封閉，37°C恒溫培養(yǎng)箱，封閉30 min，PBS洗2遍，每次5 min。取出蓋玻片，在保濕盒中孵育一抗(His6-tag兔抗一抗，CST公司)，4°C過夜(一抗按1:500的比例稀釋，用體積百分比10% FBS/PBS稀釋)。用體積百分比為10%的FBS/PBS洗3次，每次5 min。隨后進行二抗孵育:FITC標記的二抗(FITC-抗兔二抗，1:200用體積百分比為10%的FBS/PBS稀釋)在室溫或4°C側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時，避光，之后用體積百分比為的10%的FBS/PBS洗3遍，每次5min。最后是封片:將蓋玻片取出，放在干凈的載玻片上，體積百分比為90%的甘油封片，用指甲油封片固定四周。封片后就可以使用激光共聚焦顯微鏡觀察，激發(fā)波長為492 nm，最大發(fā)射波長為520 nm。1.5苦味受體蛋白T2R4的提取
轉染后的HEK-293細胞用PBS (pH 7.4)清洗，并從六孔板收集。收集的細胞用超聲波探頭超聲5 min，然后16000 g離心40 min。浮在表面的是細胞溶質部分，小球是膜部分。浮在表面的部分用丙酮沉淀，沉淀物和尿素標本緩沖液混合。小球用含有蛋白酶抑制劑雞尾酒的細胞裂解液在0°C冰凍條件下溶解30 min。然后，將尿素樣品緩沖液加入到溶解的小球溶液中，即可獲得粗提的膜蛋白，其中含有異源表達于細胞膜上的苦味受體蛋白13。含有苦味受體蛋白13的細胞膜組分用于構建石英晶體微天平傳感器8，細胞膜的疏水環(huán)境有利于保持苦味受體蛋白13的結構和功能。本步驟I中，子步驟1.3和1.4用于驗證苦味受體13已在細胞膜表面成功表達，并非本步驟I的必要子步驟。2、苦味受體蛋白T2R4在石英晶體微天平傳感器表面的固定
本發(fā)明的受體傳感器制備過程如下；在干凈的石英晶體微天平傳感器的金電極表面17通過金硫鍵共價固定一層可以特異性識別融合表達的His6-tagl4的巰基化單鏈DNA適配體16，該適配體16的序列由HS-(CH2)6和SEQ ID N0.5所示的基因序列共價連接組成:(5，-HS-(CH2)6-GCTATGGGTGGTCTGGTTGGGATTGGCCCCGGGAGCTGGC-3’)，反應條件為室溫下反應I小時；用體積百分比為1%的牛血清白蛋白15封閉石英晶體微天平傳感器的金電極17表面未反應的位點，封閉條件為室溫下I小時；把含有異源表達的苦味受體蛋白13的細胞膜均勻涂覆在石英晶體微天平傳感器的金電極17表面，并放在室溫孵育過夜，使苦味受體蛋白13通過融合表達的His6-tagl4與適配體16發(fā)生特異性的結合,實現(xiàn)在石英晶體微天平傳感器的金電極17表面特異性固定和純化苦味受體蛋白13的目的。石英晶體微天平傳感器的金電極17表面用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)沖洗，除去未結合的多余物質。完成用于苦味物質地那檢測的受體傳感器的構建。3、苦味物質地那的檢測
3.1石英晶體微天平傳感器原理
石英晶體微天平傳感器是一種質量敏感型傳感器，其基本原理是石英晶體的諧振頻率與其表面的表面微小的壓力變化相關，通過記錄石英晶體諧振頻率的變化監(jiān)測石英晶體表面微小的壓力變化?；谶@一原理，石英晶體表面微小的質量變化也可以通過監(jiān)測石英晶體諧振頻率的變化來檢測。因此，可以利用這個原理構建生物傳感器，用來測定敏感元件與待測物質的特異性吸附作用。當苦味物質被固定于石英晶體表面的苦味受體蛋白特異性吸附時，石英晶體表面的質 量發(fā)生變化，這一變化將引起石英晶體諧振頻率的改變，而且頻率的改變與石英晶體表面質量的改變成正比，滿足公式:^ F=KA &其中J A為石英晶體諧振頻率的變化量(Hz)，^為石英晶體表面的質量變化(g)，f為相關系數(shù)，F(xiàn)為石英晶體的初始頻率(MHz)，A為電極總的表面積(cm2)，r為晶體的密度(g/cm3)， 為晶體的厚度(cm)。因此，通過監(jiān)測石英晶體諧振頻率的變化可以計算出其表面的質量變化，獲得苦味物質與表面受體蛋白相互作用信息，最終實現(xiàn)對苦味物質的檢測。3.2檢測過程
石英晶體微天平傳感器8諧振頻率的信號通過傳感器電極接口 10傳送到QCM200系統(tǒng)，用于記錄石英晶體微天平傳感器8諧振頻率的改變。由注射泵I通過第一硅膠導管2將不含任何苦味物質的水溶液泵入密閉的檢測腔內，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率達到一個穩(wěn)定的狀態(tài)后，再由注射泵I將濃度確定的含有苦味物質地那的待測溶液通過第一硅膠導管2泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率再次穩(wěn)定后，諧振頻率的改變量即為對應濃度的傳感器響應值。最后再由注射泵I通過第一硅膠導管2泵入不含任何苦味物質的水溶液，清洗檢測腔，即完成一次檢測過程。至少間隔IOmin后，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率穩(wěn)定后可泵入待測溶液到檢測腔進行下一次檢測。重復上述步驟，可以確定一系列濃度的苦味物質地那對應的傳感器諧振頻率改變量，得到地那濃度-諧振頻率改變量曲線。對于未知濃度的苦味物質地那，首先由注射泵I通過第一硅膠導管2將不含任何苦味物質的水溶液泵入密閉的檢測腔內，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率達到一個穩(wěn)定的狀態(tài)Ftl后，再由注射泵I將待測未知濃度的苦味物質地那通過第一硅膠導管2泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器8的諧振頻率穩(wěn)定到F1后，得到諧振頻率改變量F1- F0,根據(jù)上述步驟得到的地那濃度-諧振頻率改變量曲線推算出待測苦味物質地那的濃度，實現(xiàn)液相中苦味物質的檢測。
下面結合附圖和實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。如圖1所示，本發(fā)明用于特異性苦味物質檢測傳感器的檢測腔體結構圖，包括:圖中，注射泵1、第一硅膠導管2、第二硅膠導管3、廢液缸4、腔蓋5、固定柱6、上環(huán)狀墊圈7、石英晶體微天平傳感器8、下環(huán)狀墊圈9、傳感器電極接口 10、傳感器底座11。其中，由腔蓋
5、上環(huán)狀墊圈7、石英晶體微天平傳感器8和傳感器底座11的側壁組成一個密閉的檢測腔，通過固定柱6實現(xiàn)腔蓋5與傳感器底座11的連接和固定。注射泵I通過第一硅膠導管2向檢測腔泵入溶液，檢測廢液由第二硅膠導管3輸出到廢液缸4。石英晶體微天平傳感器8通過上環(huán)狀墊圈7和下環(huán)狀墊圈9固定于檢測腔底部。石英晶體微天平傳感器8通過傳感器電極接口 10與外圍檢測系統(tǒng)連接?？辔妒荏w表達載體的構建如圖3所示，使其更加適合應用于構建生物傳感器，包括在苦味受體基因22的5’端引入rho-tag信號肽基因21，以利于表達的受體蛋白定位于細胞膜上；在苦味受體基因22的3 ’端引入Hi s6-tag標簽基因23，用于表達Hi s6-tag標簽，通過與適配體16特異性結合,實現(xiàn)苦味受體蛋白13的固定和純化。其中，5’端的治7/7 J酶切位點19和3’端的Afoi /酶切位點用于將苦味受體基因亞克隆到表達載體的多克隆位點區(qū)域。圖4是本發(fā)明制備苦味受體蛋白13的RT-PCR檢測結果圖，提示苦味受體蛋白13在mRNA水平上有顯著表達。圖5是本發(fā)明中表達有備苦味受體蛋白13的HEK-293細胞在可見光視野的照片；圖6是與圖5同一視野下的熒光照片；結果提示在蛋白質水平，苦味受體蛋白13有顯著表達，而且表達的苦味受體蛋白13主要分布在細胞脂膜。如圖2所示，本發(fā)明固定有苦味受體的石英晶體微天平傳感器結構示意圖，包括:脂質雙分子層12、苦味受體蛋白13、融合表達的His6-tagl4、牛血清白蛋白15、適配體16、金電極17、石英晶體18。上述石英晶體微天平傳感器8主要應用于液相環(huán)境中苦味物質的檢測。實驗中，采用不同的苦味物質測試傳感器的特異性，包括硫酸鎂(30 mM)、地那(I mM)、水楊素(D-(-)-salicin, I mM)和奎寧(I mM)。采用不同濃度的T2R4天然配體地那測試傳感器的靈敏度。圖7是傳感器檢測不同苦味物質的結果。采用不含苦味受體蛋白T2R4的HEK-293細胞膜作為陰性對照。其中，傳感器對不同苦味物質的響應以含有苦味受體蛋白T2R4的傳感器對地那的響應進行了歸一化處理。結果表明，含有苦味受體蛋白T2R4的傳感器對地那的響應顯著高于對奎寧的響應，也顯著高于不含苦味受體蛋白T2R4的傳感器對地那的響應(*# < 0.0Ln = 6)。說明該傳感器檢測苦味物質地那具有良好的特異性。圖8是傳感器檢測不同濃度的地那的結果。傳感器對不同濃度地那的響應以傳感器對0.1 mM地那的響應進行了歸一化處理。在地那濃度為0.01 mM到0.3 mM的范圍內，該傳感器對地那具有濃度依賴的線性響應特征。<110>浙江大學〈120〉一種基于受體傳感器檢測苦味物質地那的方法
〈160〉5
<170>PatentIn version 3.3
〈210〉I
〈211〉11193
〈212〉DNA
<213>Homo sapiens
〈400〉 I
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac240
atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc tacttggcag tacatctacg360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacaccaat gggcgtggat420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa taaccccgcc ccgttgacgc540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc600
gtcagatctc tagaagctgg gtaccgagag ccgcagccat gaacggcaca gagggcccca660
atttttatgt gcccttctcc aacgtcacag gcgtggtgcg gagccccttc gagcagccgc720agtactacct ggcggaacca tggcagttct ccatgcttcg gttattctat ttctctgcta780
ttattgcctc agttatttta aattttgtag gaatcattat gaatctgttt attacagtgg840
tcaattgcaa aacttgggtc aaaagccata gaatctcctc ttctgatagg attctgttca900
gcctgggcat caccaggttt cttatgctgg gactatttct ggtgaacacc atctacttcg960
tctcttcaaa tacggaaagg tcagtctacc tgtctgcttt ttttgtgttg tgtttcatgt1020
ttttggactc gagcagtgtc tggtttgtga ccttgctcaa tatcttgtac tgtgtgaaga1080
ttactaactt ccaacactca gtgtttctcc tgctgaagcg gaatatctcc ccaaagatcc1140
ccaggctgct gctggcctgt gtgctgattt ctgctttcac cacttgcctg tacatcacgc1200
ttagccaggc atcacctttt cctgaacttg tgactacgag aaataacaca tcatttaata1260
tcagtgaggg catcttgtct ttagtggttt ctttggtctt gagctcatct ctccagttca1320
tcattaatgt gacttctgct tccttgctaa tacactcctt gaggagacat atacagaaga1380
tgcagaaaaa tgccactggt ttctggaatc cccagacgga agctcatgta ggtgctatga1440
agctgatggt ctatttcctc atcctctaca ttccatattc agttgctacc ctggtccagt1500
atctcccctt ttatgcaggg atggatatgg ggaccaaatc catttgtctg atttttgcca1560
ccctttactc tccaggacat tctgttctca ttattatcac acatcctaaa ctgaaaacaa1620
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gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtatggctg attatgatcc1920ggctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag1980
acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca ggcgtcagcg2040
ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg aggtcgactc tagaggatcg atgccccgcc2100
ccggacgaac taaacctgac tacgacatct ctgccccttc ttcgcggggc agtgcatgta2160
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cacaacattg cctttatgtg taactcttgg ctgaagctct tacaccaatg ctgggggaca2400
tgtacctccc aggggcccag gaagactacg ggaggctaca ccaacgtcaa tcagaggggc2460
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ttacatgggg tcaggattcc acgagggtag tgaaccattt tagtcacaag ggcagtggct2760
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cgtttagcta atagaataac tgctgagttg tgaacagtaa ggtgtatgtg aggtgctcga2880
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ttgtgctatg acaccaatat aaccctcaca aaccccttgg gcaataaata ctagtgtagg3000
aatgaaacat tctgaatatc tttaacaata gaaatccatg gggtggggac aagccgtaaa3060gactggatgt ccatctcaca cgaatttatg gctatgggca acacataatc ctagtgcaat3120
atgatactgg ggttattaag atgtgtccca ggcagggacc aagacaggtg aaccatgttg3180
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cgccgccctg cggttttgga ctgtaaaata agggtgtaat aacttggctg attgtaaccc3420
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catatgctat cctaatctat atctgggtag catatgctat cctaatctat atctgggtag4020
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tggccttcta cctggagggg gcctgcgcgg tggagacccg gatgatgatg actgactact5400
權利要求
1.一種基于受體傳感器檢測苦味物質地那的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)制備苦味受體蛋白T2R4； (2)將苦味受體蛋白T2R4固定在石英晶體微天平傳感器表面制成受體傳感器； (3)將不含任何苦味物質的水溶液泵入密閉的檢測腔內，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達到一個穩(wěn)定的狀態(tài)后，再將含有某一確定濃度的苦味物質地那的溶液泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率再次穩(wěn)定后，諧振頻率的改變量即為此確定濃度的傳感器響應值，最后再泵入不含任何苦味物質的水溶液，清洗檢測腔，即完成一次檢測過程；至少間隔IOmin后，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩(wěn)定后，再泵入含有另一確定濃度的苦味物質地那的溶液進行下一次檢測；重復上述步驟，可以得到一系列苦味物質地那的濃度對應的傳感器諧振頻率改變量，得到地那濃度-諧振頻率改變量曲線； (4)對于未知濃度的苦味物質地那，首先將不含任何苦味物質的水溶液泵入密閉的檢測腔內，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達到一個穩(wěn)定的狀態(tài)Ftl后，再將含有未知濃度的苦味物質地那的待測溶液泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩(wěn)定到F1后，得到諧振頻率改變量F1- F0,最后根據(jù)上述步驟3得到的地那濃度-諧振頻率改變量曲線得到待測溶液中苦味物質地那的濃度，實現(xiàn)液相中苦味物質地那的濃度檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述苦味物質地那的檢測方法，其特征在于，所述步驟I包括以下子步驟: (1.0構建表達載體:含有人苦味受體基因T2R4和rho-tag信號肽序列全長cDNA的jmLpCEP4/rho-T2R4的基因序列如SEQ ID N0.1，構建苦味受體基因22的表達載體過程如下:首先，設計相應的引 物，獲取和擴增苦味受體基因序列全長cDNA，并對苦味受體基因進行適當?shù)男揎棧嫌我镄蛄腥鏢EQ ID N0.2所示，下游引物序列如SEQ ID N0.3所示，聚合酶鏈式反應使用高保真聚合酶STAR在50 μ L反應體系中進行，溫度循環(huán)首先是94°C預變性30秒，接著進行29個循環(huán)的95°C變性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸60秒，最后是.20 0C降溫20秒；擴增后的產(chǎn)物通過限制性內切酶的雙酶切反應亞克隆到表達載體的多克隆位點治μ /和Afoi /之間，完成苦味受體的表達載體的構建，并通過測序對基因序列進行鑒定得表達載體的基因序列如SEQ IDN0.4所示； (1.2)人胚胎腎細胞HEK-293的培養(yǎng)和轉染:HEK_293細胞培養(yǎng)液為添加了體積百分比為10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μ g/mL)的DMEM，培養(yǎng)條件為37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱；轉染之前一天，HEK-293細胞被接種于六孔培養(yǎng)皿中，每孔接種0.5 2X IO5 cells/mL濃度的細胞500 μ L，在不含抗生素的培養(yǎng)液里生長至轉染前90-95%的融合度；轉染試劑為Iipofectamin 2000，使用步驟1.1構建好的表達載體pCEP4/rho-T2R4~his6轉染HEK-293細胞；每孔使用4 μ g表達質粒，首先把表達質粒用無血清培養(yǎng)液稀釋到50 μ L，混勻；再用無血清細胞培養(yǎng)液稀釋10 UL的脂質體轉染試劑Iipfectamin 2000至50 yL,在室溫下孵育5 min ;接著把稀釋的表達質粒和Iipfectamin/2000混合,搖勻，室溫孵育20 min ;把100 μ L的混合液加到六孔板中每一個含有細胞和培養(yǎng)液的孔中，前后搖板混勻后，在37°C、體積百分比為5% CO2的培養(yǎng)箱孵育24 h;含有特異性抗融合表達的His6-tag的苦味受體蛋白T2R4即可在細胞膜表面表達；(1.3)苦味受體蛋白T2R4的提取:轉染后的HEK-293細胞用PBS清洗，并從六孔板收集；收集的細胞用超聲波探頭超聲5 min，然后16000 g離心40 min ;浮在表面的是細胞溶質部分，小球是膜部分；浮在表面的部分用丙酮沉淀，沉淀物和尿素標本緩沖液混合；小球用含有蛋白酶抑制劑雞尾酒的細胞裂解液在0°C冰凍條件下溶解30 min ;然后，將尿素樣品緩沖液加入到溶解的小球溶液中，即可獲得粗提的膜蛋白，其中含有異源表達于細胞膜上的苦味受體蛋白T2R4 ;含有苦味受體蛋白T2R4的細胞膜組分用于構建石英晶體微天平傳感器，細胞膜的疏水環(huán)境有利于保持苦味受體的結構和功能。
3.根據(jù)權利要求1所述苦味物質地那的檢測方法，其特征在于，所述步驟2具體為:本發(fā)明的受體傳感器制備過程如下:在干凈的石英晶體微天平傳感器的金電極表面通過金硫鍵共價固定一層可以特異性識別融合表達的His6-tag標簽的巰基化單鏈DNA適配體，該適配體的序列由HS-(CH2)6和SEQ ID N0.5所示的基因序列共價連接組成；反應條件為室溫下反應I小時；用質量百分比為1%的牛血清白蛋白封閉石英晶體微天平傳感器的金電極表面未反應的位點，封閉條件為室溫下I小時；把含有異源表達的苦味受體蛋白T2R4的細胞膜均勻涂覆在石英晶體微天 平傳感器的金電極表面，并放在室溫孵育過夜，使苦味受體蛋白通過融合表達的His6-tag與適配體發(fā)生特異性的結合，實現(xiàn)在石英晶體微天平傳感器的金電極表面特異性固定和純化苦味受體蛋白T2R4的目的；石英晶體微天平傳感器的金電極表面用PBS沖洗，除去未結合的多余物質；完成用于苦味物質地那檢測的受體傳感器的構建。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于受體傳感器檢測苦味物質地那的方法，首先在HEK-293細胞表面表達了帶有His6-tag標簽的苦味受體蛋白T2R4，并提取苦味受體蛋白T2R4將其利用適配體有效地固定在石英晶體微天平表面構建成受體傳感器；通過測試一系列含已知確定濃度苦味物質地那的溶液，得到地那濃度-諧振頻率改變量標準曲線；然后測試含有未知濃度苦味物質地那的待測溶液，根據(jù)石英晶體微天平諧振頻率的改變量和地那濃度-諧振頻率改變量標準曲線得到待測溶液中苦味物質地那的濃度。本發(fā)明方法所需儀器簡單、操作方便，解決了敏感元件苦味受體蛋白T2R4與石英晶體微天平的穩(wěn)定耦合，實現(xiàn)了液相環(huán)境中苦味物質地那的快速檢測。
文檔編號G01N5/02GK103149110SQ20131006024
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月26日 優(yōu)先權日2013年2月26日
發(fā)明者吳春生, 鄒玲, 杜立萍, 王平 申請人:浙江大學