一種高分子蒙脫石載菌凝膠球的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高分子水凝膠球的制備方法,屬于生物化工和環(huán)保功能材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]固定化細胞的應(yīng)用極其廣泛,目前該技術(shù)己經(jīng)普遍應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)療診斷、化學分析、環(huán)境保護、能源開發(fā)與相關(guān)理論研究等多個領(lǐng)域。一個理想的固定化微生物材料要基本具備以下條件:(I)密集微生物,維持反應(yīng)器中的生物量濃度;(2)載體具有較高的機械強度,傳質(zhì)阻力小;(3)載體可再生,并可重復使用;(4)載體價格低廉,固定化方法費用低;
(5)載體與微生物的固定結(jié)合強度高,能耐水力波動的沖擊;(6)載體對微生物無毒,能抗微生物分解。
[0003]常用的固定化材料包括無機載體、有機高分子載體、復合載體等多種類型。無機載體具有機械強度大、對微生物無毒性、不易被微生物分解、耐酸堿、成本低、壽命長等特性。蒙脫石屬于天然無機載體,為蒙皂石族單斜晶系,TOT型,其單位晶胞是由兩層S1-O四面體夾一層Al-O八面體構(gòu)成,晶格置換、破鍵、八面體片層解離等因素都會導致蒙脫石具有電負性,使蒙脫石易于吸附帶正電荷的有機陽離子。此外,蒙脫石還具有較大的比表面積、優(yōu)良的吸附特性、良好的納米空間結(jié)構(gòu),這使它在作為固定化細胞載體等方面的應(yīng)用具有更多的優(yōu)越性。但是無機載體固定化細胞時,主要靠吸附作用和電荷效應(yīng)(范德化力、氫鍵及靜電作用),細胞結(jié)合不牢固,容易脫落。
[0004]有機高分子載體中的天然高分子凝膠載體一般具有生物相容性好、制備工藝簡單、傳質(zhì)性能好等優(yōu)點。常見的天然高分子凝膠有瓊脂、角叉萊膠、海藻酸鈣、甲殼素等。在這幾種天然載體中,瓊脂強度最差,角叉萊膠價格較貴,甲殼素不溶于普通試劑。相比之下,海藻酸鈣具有價格低廉、制備容易、傳質(zhì)性能好等優(yōu)點,應(yīng)用最為廣泛。但海藻酸鈉強度較低,在厭氧條件下易被微生物分解,壽命較短。由于有機和無機載體材料各有其優(yōu)缺點,而兩類材料在許多方面互補。因此,可將這兩類材料結(jié)合在一起,組成復合載體材料,以改進材料的性能。
[0005]包埋法是將微生物限定在凝膠的微小格子或微膠囊等有限空間內(nèi),同時能讓基質(zhì)滲入和產(chǎn)物擴散出來。包埋法對微生物活性影響小、顆粒強度高,是目前研究最多的固定化方法。交聯(lián)法是通過微生物與具有兩個或兩個以上的官能基團的試劑反應(yīng),使微生物菌體相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),而達到固定微生物的目的。在包埋過程中讓天然有機高分子發(fā)生交聯(lián),會使高分子凝膠更加穩(wěn)定、堅固。雖然,固定化微生物細胞的凝膠基質(zhì)可以防止細胞的泄漏,但同時也是底物和氧分子擴散的屏障。擴散阻礙會引起表觀反應(yīng)速率的下降。有時,甚至會由于質(zhì)量傳遞限制而改變包埋固定在凝膠顆粒中細胞的代謝行為。因此,在固定化細胞動力學研究過程中應(yīng)考慮凝膠內(nèi)物質(zhì)的擴散行為。同時,顆粒的完整性受其機械強度、相互碰撞、摩擦和剪切力的影響,這些因素都會導致顆粒破裂。因此,包埋顆粒的機械強度和耐久性也是固定化微生物操作是否成功的關(guān)鍵。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]包埋載體應(yīng)具備對微生物無毒,制備容易,傳質(zhì)性能好,價格便宜等特點,海藻酸鈉作為載體具有操作方便,包埋微生物的活性高。明膠是一種常用的蛋白質(zhì)膠凝劑,溶解性好而且價格低廉,可以很好的改善海藻酸鈉的成型效果。利用海藻酸鈉與明膠聯(lián)合固定化制備的膠粒與單一的應(yīng)用海藻酸鈉相比可以提供更大的固定化空間,有利于物質(zhì)的擴散。蒙脫石結(jié)構(gòu)特征決定其層間域具有優(yōu)良的離子交換性能和分子吸附特征。將海藻酸鈉、明膠與蒙脫石一起制備凝膠小球,可以解決蒙脫石在水中具有的分散懸浮性強、固液分離速度慢、絮凝物脫水效果差、不易分離等缺點。
[0007]稱取適量海藻酸鈉置于沸水中攪拌使其充分溶解,冷卻至室溫,配制濃度為5.0%的海藻酸鈉母液;稱取適量明膠置于沸水中攪拌使其充分溶解,冷卻至室溫,配制濃度為30.0%的明膠母液;取適量配制好的明膠母液、海藻酸鈉母液,加入適量蒙脫石及蒸餾水混合均勻,使海藻酸鈉濃度為1_4%,明膠濃度為0.5-3%,蒙脫石濃度為0.02-0.lg/mL,混合溶液體積為5-20mL。通過注射器(針頭型號22-27G)的針頭將上述混合液以5cm高度注入30mL含有濃度為0.4-0.7%的戊二醛及濃度為3_6%的氯化鈣混合溶液中,立即形成光滑的微球體。將此固定化小球在上述溶液中靜置3-10h,倒掉混合溶液,用適量蒸餾水洗滌小球兩次,備用。
[0008]向上述制得的小球中加入30mL蒸餾水后,再加入500 μ L濃度為0.2%的次甲基藍溶液,30 0C, 130rpm屏幕振蕩40min后取出溶液,用可見分光光度計測定其在620nm波長下的吸光度。吸光度值越小,說明其傳質(zhì)性能越好。蒙脫石的用量選定為:0.02、0.04、0.06、0.08,0.lg/mL (此時明膠濃度固定為3%,海藻酸鈉濃度固定物1%),OD620從0.684下降到
0.071。使用Folin酚法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量,蒙脫石濃度為0.lg/mL時,上清液中蛋白質(zhì)含量最低。明膠濃度選定為:3%、5%、7%、9%、11%(此時蒙脫石濃度固定為0.08 g/mL,海藻酸鈉濃度固定物1%),0D62。從1.215下降到0.061 ;使用Folin酚法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量,明膠濃度為3%時,上清液中蛋白質(zhì)含量最低。當海藻酸鈉濃度選定為:1.0%、1.5%、
2.0%、2.5%、3.0%(此時明膠濃度固定為3%,蒙脫石濃度固定物0.08 g/mL),OD620從0.196下降到0.096。使用Folin酚法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量,海藻酸鈉濃度為3%時,上清液中蛋白質(zhì)含量最低。
[0009]取上述不同條件下制備的固定化小球置于30mL蒸餾水中,用磁力攪拌器以30°C、最大轉(zhuǎn)速進行攪拌振蕩,2h后測量溶液在660nm處的吸光值,吸光值越小,說明機械強度越大。經(jīng)過測定其0D66。約為0.006-0.025,小球破碎率0-5%。
【具體實施方式】
[0010]具體實施例一
從冰箱中取出大腸桿菌JM109,取其中20 μ L接入到10mL的LB培養(yǎng)基中,37 °C、140rpm搖床培養(yǎng)48h。取上述LB培養(yǎng)基80毫升,于離心機4000r/min,離心15min,用生理鹽水洗滌菌體兩次。將上述離心分離得到的菌團的一部分加入到1mL含海藻酸鈉、明膠、蒙脫石的液體中,使海藻酸鈉終濃度為4%,明膠終濃度為3%