Cdk18在制備診斷冠心病產(chǎn)品中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子診斷領(lǐng)域，涉及一種用于冠心病診斷的分子標志物，具體涉及血 液中的分子標志物-CDK18基因在制備診斷冠心病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 動脈粥樣硬化性心腦血管病已成為世界范圍關(guān)注的主要健康問題。2004年的世界 衛(wèi)生組織(WHO)報告顯示，全世界每年心血管疾病以冠心病和腦卒中為主導致的死亡人數(shù) 達高達1720萬，占所有死亡人數(shù)的三分之一。預(yù)計2020年這一數(shù)字將進一步增加50%，高達 2500萬，心血管疾病是全球人類的"頭號殺手"。在中國進行的一項大規(guī)模前瞻性研究也顯 示，心臟疾病已經(jīng)成為中國人群的主要死亡原因，分列男、女性死亡原因的第2位和第1位。 我國每年新發(fā)心肌梗死50萬人，隨著生活方式的改變以及動脈粥樣硬化相關(guān)的危險因素持 續(xù)增加，冠心病與心肌梗死發(fā)病也還將呈持續(xù)上升趨勢。
[0003] 大量的研究資料表明，冠心病是一種復(fù)雜疾病，是由多個微效基因與環(huán)境因素長 期相互作用所致。因此鑒定出與冠心病相關(guān)的易感基因或致病基因，在人群中進一步篩選 增加疾病風險的易感基因確定易感個體，將有助于冠心病的發(fā)病風險預(yù)測、新藥開發(fā)、診斷 和個體化治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于冠心病早期診斷的 分子標志物。相比傳統(tǒng)的冠心病的診斷方法，使用基因標志物來診斷冠心病具有及時性、特 異性和靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知曉疾病風險，針對風險高低，采取相應(yīng)的預(yù)防 和治療措施。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了檢測CDK18基因表達的產(chǎn)品在制備診斷冠心病的工具中的應(yīng)用。
[0007] 進一步，上面所提到的檢測CDK18基因表達的產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實時定量 PCR、免疫檢測、原位雜交、芯片或高通量測序平臺檢測CDK18基因表達水平以診斷冠心病的 產(chǎn)品。
[0008] 進一步，所述用RT-PCR診斷冠心病的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增⑶K18基因的引 物;所述用實時定量PCR診斷冠心病的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增CDK18基因的引物;所述 用免疫檢測診斷冠心病的產(chǎn)品包括:與CDK18蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診斷 冠心病的產(chǎn)品包括:與CDK18基因的核酸序列雜交的探針;所述用芯片診斷冠心病的產(chǎn)品包 括:蛋白芯片和基因芯片;其中，蛋白芯片包括與CDK18蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包 括與CDK18基因的核酸序列雜交的探針。
[0009] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述用實時定量PCR診斷冠心病的產(chǎn)品至少包括一 對特異擴增CDK18基因的引物的序列如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示。
[0010] 優(yōu)選地，所述診斷工具包括芯片、試劑盒、試紙或高通量測序平臺。其中，高通量測 序平臺是一種特殊的診斷工具，檢測CDK18基因表達的產(chǎn)品可以應(yīng)用于該平臺實現(xiàn)對CDK18 基因的表達情況的檢測。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構(gòu)建將成 為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的 異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知CDK18基因的異常與冠心病相關(guān)也屬于CDK18 基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種診斷冠心病的工具，所述診斷工具包括芯片、試劑盒、試紙、 或高通量測序平臺。
[0012] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述基因芯片包括固相載體以及固定 在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測CDK18基因轉(zhuǎn)錄水平的針對 CDK18基因的寡核苷酸探針;所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的CDK18蛋 白的特異性抗體;所述基因芯片可用于檢測包括CDK18基因在內(nèi)的多個基因（例如，與冠心 病相關(guān)的多個基因）的表達水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測包括CDK18蛋白在內(nèi)的多個蛋 白質(zhì)(例如與冠心病相關(guān)的多個蛋白質(zhì)）的表達水平。通過將多個與冠心病的標志物同時檢 測，可大大提高冠心病診斷的準確率。
[0013] 其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒;所述基因檢測試 劑盒包括用于檢測CDK18基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測試劑盒包括CDK18蛋白的 特異性抗體。進一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或芯片 方法檢測CDK18基因表達水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對CDK18基因的 引物和/或探針。根據(jù)CDK18基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計出可以用于檢測CDK18基因表 達水平的引物和探針。
[0014] 與CDK18基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它 衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合， 任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的 長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜 交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超 過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序 列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
[0015] 所述高通量測序平臺包括檢測CDK18基因表達水平的試劑。
[0016] 所述試紙包括試紙載體和固定在試紙載體上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能夠檢測 CDK18基因的轉(zhuǎn)錄水平。
[0017]進一步，所述⑶K18蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述⑶K18蛋 白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與CDK18蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平 的抗體的制備時本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗體。
[0018] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述針對CDK18基因的引物序列如下:正向引物序列 如SEQ ID N0.3所示，反向引物如SEQ ID N0.4所示。
[0019] 用于診斷冠心病的⑶K18基因及其表達產(chǎn)物的來源包括但不限于血液、組織液、尿 液、唾液、脊髓液等可以獲得基因組DNA的體液。在本發(fā)明的具體實施方案中，用于診斷冠心 病的CDK18基因及其表達產(chǎn)物的來源是血液。
[0020] 在本發(fā)明的上下文中，"⑶K18基因"包括⑶K18基因以及⑶K18基因的任何功能等 同物的多核苷酸。CDK18基因包括與目前國際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫GeneBank中⑶K18基因 (%_000001.11)0嫩序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的0嫩序列；
[0021] 優(yōu)選地，CDK18基因的編碼序列包括以下任一一種DNA分子：
[0022] (1)序列表中SEQ ID N0.1所示的DNA序列；
[0023] (2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0024] (3)與（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、優(yōu)選地，90%以上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0025]在本發(fā)明的具體實施方案中，所述⑶K18基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[0026] 在本發(fā)明的上下文中，CDK18基因表達產(chǎn)物包括⑶K18蛋白以及⑶K18蛋白的部分 肽。所述CDK18蛋白的部分肽含有與冠心病相關(guān)的功能域。
[0027] "CDK18蛋白"包括⑶K18蛋白以及⑶K18蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物 包括CDK18蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變 體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與CDK18的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。
[0028] 優(yōu)選地，CDK18蛋白是具有下列氣基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0029] (1)由序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0030] (2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個數(shù)通常為1-50個，較佳地1-30 個，更佳地1-20個，最佳地1-10個。
[0031] (3)與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又稱為序列同一性）， 更優(yōu)選地，與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0032]在本發(fā)明的具體實施方案中，所述CDK18蛋白是具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。
[0033]通常，已知的是，一個蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0034]通過添加一個氨基酸或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是CDK18蛋白的融合 蛋白。對于與CDK18蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留CDK18蛋 白的生物學活性即可。
[0035]本發(fā)明的⑶K18蛋白也包括對SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要 經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留CDK18蛋白的生物學活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中突變 的氨基酸數(shù)目通常是10個或者更少，例如6個或者更少，例如3個或者更少。
[0036]在本發(fā)明的上下文中，"診斷冠心病"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有冠心病、也 包括判斷受試者是否存在患有冠心病的風險。
[0037]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0038] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了⑶K18基因表達與冠心病相關(guān)，通過檢測受試者中⑶K18的表 達，可以判斷受試者是否患有冠心病、或者判斷受試者是否存在患有冠心病的風險，從而指 導臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。
[0039] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標記物-CDK18基因，相比傳統(tǒng)的檢測手段，基因診斷 更及時、更特異、更靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)冠心病的早期診斷，從而降低冠心病的死亡率。
【附圖說明】
[0040] 圖1顯示利用QPCR檢測CDK18基因在冠心病患者和正常人中的表達差異。
[0041] 具體的實施方式
[0042] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0043]實施例1篩選冠心病患者和正常人中差異表達的基因 [0044] 1、研究對象：
[0045]收集冠心病患者5例，正常人5例。
[0046] 冠心病組的納入標準：按照世界衛(wèi)生組織制定的缺血性心臟病的診斷標準，選擇 經(jīng)冠狀動脈造影證實有一支或多支血管狹窄程度2 50%的冠心病患者。對照組的入選標準 為：1)在流行病學調(diào)查時篩選年齡、性別、民族均與CAD組相