硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]生物力學(xué)的重要性已被越來越多的研究者關(guān)注。生物力學(xué)的出現(xiàn)使傳統(tǒng)只針對于基因水平疾病的藥物受到了強有力的挑戰(zhàn)，細(xì)胞力學(xué)、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)、而或細(xì)胞機械傳導(dǎo)都可能對許多的疾病發(fā)生起關(guān)鍵作用，包括動脈粥樣硬化、纖維化、哮喘、骨質(zhì)疏松、心臟衰竭、癌癥，甚至包括廣義的醫(yī)療殘疾如過敏性腸綜合癥。研究表明，當(dāng)生長在不同硬度的等價化學(xué)表面上時，有許多種類型的細(xì)胞可以改變它們自身的形態(tài)和基因表達(dá)圖譜。細(xì)胞周圍的微環(huán)境為細(xì)胞提供了復(fù)雜的生物化學(xué)活性結(jié)構(gòu)和物理調(diào)控。在這種環(huán)境中，細(xì)胞通過感知細(xì)胞外基質(zhì)或相鄰細(xì)胞來主動探測識別其所在微環(huán)境的硬度，并將其感受的機械擾動和環(huán)境壓力傳遞到細(xì)胞內(nèi)，調(diào)整自身表觀遺傳學(xué)表達(dá)。生物力學(xué)環(huán)境在胚胎發(fā)育、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和病理學(xué)中影響基因的選擇性表達(dá)，在細(xì)胞表觀遺傳學(xué)差異體現(xiàn)中起到了重要的作用。正常肝臟彈性模量不足1500帕，在這種條件下肝星形膠質(zhì)細(xì)胞可保持靜息狀態(tài)。I千帕左右的彈性模量可以保持肺成纖維細(xì)胞處于良好的生理水平。然而，當(dāng)細(xì)胞生長在更硬的環(huán)境中時(如8-22千帕)就會轉(zhuǎn)變分化形成不同的表型。研究證明，持續(xù)增加的外部機械力可以誘導(dǎo)更多的細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)和基質(zhì)沉積，從而導(dǎo)致纖維化的形成，引起體內(nèi)器官系統(tǒng)功能障礙。
[0003]聚合生物材料可作為體外細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，其中生物力學(xué)性質(zhì)可調(diào)的水凝膠為研究細(xì)胞在不同軟硬刺激中對于細(xì)胞外基質(zhì)的條件反應(yīng)提供了有力的工具。體外模型的建立對于了解傷口愈合和疾病發(fā)病的機制有著至關(guān)重要的作用，尤其是在細(xì)胞的表型和功能發(fā)揮的研究中的更是不可或缺的。然而，大多數(shù)的生物力學(xué)研究主要集中在機械條件如何影響粘附細(xì)胞活性以及它們細(xì)胞外基質(zhì)的形成，生物力學(xué)調(diào)控細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的研究僅局限在原位細(xì)胞，細(xì)胞收集對細(xì)胞的影響作用往往被研究者們所忽略。如何在不損傷細(xì)胞特性的前提下消化、重懸細(xì)胞仍然具有很大的挑戰(zhàn)性。
[0004]成功的再生醫(yī)學(xué)治療必須考慮細(xì)胞的天然特性，使得細(xì)胞能夠激發(fā)對于組織修復(fù)有利的信號通路從而融入天然的組織結(jié)構(gòu)。內(nèi)穩(wěn)態(tài)是維持細(xì)胞正常的生理功能的動態(tài)過程，其中包括所有與細(xì)胞生存所需的內(nèi)部和外部環(huán)境。體外細(xì)胞培養(yǎng)收集技術(shù)包括酶消化和物理剝離是細(xì)胞傳代中最經(jīng)常采用的方法。傳統(tǒng)常規(guī)細(xì)胞收集方法由于酶消化蛋白水解或機械刮削分離的作用而得到的單細(xì)胞或細(xì)胞團會造成細(xì)胞或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)連結(jié)地?fù)p失。由于酶促消化可以極大地改變了細(xì)胞自身所處的環(huán)境，例如胰酶會強效裂解幾乎全部蛋白肽鏈中靠近羧基端的賴氨酸或精氨酸，所以很可能會對細(xì)胞的特異性表達(dá)造成負(fù)面影響，考慮其在培養(yǎng)條件上所造成的差異(如細(xì)胞外基質(zhì)片段化)更有可能改變細(xì)胞的形態(tài)以及基因表達(dá)。研究表明胰酶消化會破壞細(xì)胞固有結(jié)構(gòu)和表觀遺傳學(xué)特征，細(xì)胞中組蛋白甲基化、乙?；浇?jīng)胰酶處理后明顯下降。物理剝離方法如細(xì)胞刮刀會顯著降低細(xì)胞的成活率，研究發(fā)現(xiàn)，物理刮剝的方法可能造成高達(dá)30%的細(xì)胞死亡。而且現(xiàn)在還不能確定這死細(xì)胞是否會釋放細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)對存活下來的細(xì)胞造成影響。值得期待的是，如果常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)不會對細(xì)胞自身表達(dá)造成干擾，由此便可區(qū)分實驗結(jié)果是否是實驗真正想要得到的結(jié)果，而不是因為由于培養(yǎng)技術(shù)條件所限而受到影響出現(xiàn)的假陽性數(shù)據(jù)。
[0005]因而，目前關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的研究仍有待深入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種能夠有效用于細(xì)胞培養(yǎng)、可以非侵入性收集細(xì)胞、調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)與細(xì)胞形態(tài)、或者維持細(xì)胞代次間穩(wěn)定性，保存細(xì)胞表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)免受破壞的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料。
[0007]在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料(可簡稱水凝膠)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料是由溫敏交聯(lián)材料和非溫敏交聯(lián)材料三維網(wǎng)狀交聯(lián)形成的，其中，溫敏交聯(lián)材料為選自N-異丙基丙烯酰胺、N-丙烯?；哙?、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N，N_ 二乙基丙烯酰胺、N-異丙基丙烯甲基酰胺、N-環(huán)丙基丙烯酰胺、N-丙烯酰基吡咯烷、N，N_乙基甲基丙烯酰胺、N-環(huán)丙基甲基其他可、N-乙基丙烯酰胺中的至少一種，非溫敏交聯(lián)材料為選自人工合成生物材料和天然生物材料中的至少一種，人工合成生物材料為選自丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羥基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚縮醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯中的至少一種，天然生物材料為選自明膠、明膠衍生物、藻酸鹽、藻酸鹽衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、層連接蛋白和纖維連接蛋白中的至少一種。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明實施例的該水凝膠具有良好的硬度可控性、溫度敏感性和擴增支持性，應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)時，可隨所培養(yǎng)細(xì)胞需求改變硬度或通過主動調(diào)控硬度調(diào)節(jié)細(xì)胞基因和形態(tài)表達(dá)，同時在體溫范圍內(nèi)呈疏水、團縮狀態(tài)，當(dāng)其處于室溫時即變?yōu)橛H水、膨脹狀態(tài)，且兩種狀態(tài)可隨溫度變化可逆的改變，且在水凝膠表面貼附的細(xì)胞可反復(fù)在水凝膠表面生長，其生長狀態(tài)不會因細(xì)胞收集而間斷；另外，通過降低環(huán)境溫度可使水凝膠表面貼附的細(xì)胞主動脫離水凝膠，從而完整的保存細(xì)胞表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)，維持細(xì)胞特性在代次傳遞間的統(tǒng)一性，及表觀遺傳學(xué)的穩(wěn)定性。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的實施例，溫敏交聯(lián)材料為N-異丙基丙烯酰胺，非溫敏交聯(lián)材料為丙烯酰胺和聚乙二醇二丙烯酸酯。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的實施例，溫敏交聯(lián)材料和非溫敏交聯(lián)材料的質(zhì)量比為1:(0.1?2.0)。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的實施例，硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的硬度彈性模量為1帕?100千帕，優(yōu)選100?1500帕。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的實施例，硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的相轉(zhuǎn)變臨界溫度為O?120攝氏度，優(yōu)選為4?33攝氏度。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的實施例，溫敏交聯(lián)材料和非溫敏交聯(lián)材料三維網(wǎng)狀交聯(lián)是在基底材料的表面上進行的，其中，所述基底材料為玻片、塑料、金屬和硅膠中的至少一種，優(yōu)選為玻片、細(xì)胞培養(yǎng)皿、硅膠、PMMA、PCL中的至少一種。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的實施例，基底材料的表面預(yù)先利用甲基丙烯酸3_(三甲氧基硅烷)丙酯進行修飾。
[0014]在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種制備前面所述的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括:將溫敏交聯(lián)材料、非溫敏交聯(lián)材料和交聯(lián)劑混合，并使所得到的混合物進行交聯(lián)反應(yīng)，得到硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料。
[0015]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該方法工藝流程簡單、可自動化生產(chǎn)、可實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，同時可根據(jù)實際需求制備出各種形狀的聚合物材料系統(tǒng)，如圓形、橢圓形、多邊形等，且所制得的聚合物材料系統(tǒng)厚度、大小均一，各種尺度級別(>lmm)均可實現(xiàn)，另外，制得的聚合物材料具有前面所述的聚合物材料的全部特征和優(yōu)點，在此不再一一贅述。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的實施例，制備前面所述的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的方法進一步包括:將溫敏交聯(lián)材料、非溫敏交聯(lián)材料和交聯(lián)劑混合，得到預(yù)聚混合物;將預(yù)聚混合物置于基板的表面上，并在預(yù)聚混合物上覆蓋基底材料，然后使預(yù)聚混合物進行交聯(lián)反應(yīng)。其中，基底材料為選自玻片、細(xì)胞培養(yǎng)皿、硅膠、PMMA、PCL及各類塑料和金屬等中的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，制備前面所述的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的方法進一步包括:將溫敏交聯(lián)材料和部分交聯(lián)劑混合，將得到的溫敏混合物修飾于基底材料表面，得到溫敏基底材料;將非溫敏交聯(lián)材料和余量交聯(lián)劑混合，并將得到的非溫敏混合物置于基板的疏水表面上，然后將溫敏基底材料覆蓋于非溫敏混合物上，使其進行所述交聯(lián)反應(yīng)。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的實施例，將溫敏混合物修飾于基底材料表面進一步包括:將溫敏混合物置于基底材料的表面，并于20?60攝氏度下反應(yīng)5?30分鐘或于紫外下照射10?1000秒，然后將所得基底材料進行烘干處理。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述制備前面所述的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的方法中，交聯(lián)反應(yīng)是通過化學(xué)成膠、光學(xué)成膠、物理成膠、熱成膠、電解質(zhì)成膠中的至少一種進行的。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的實施例，化學(xué)成膠的條件為于室溫下反應(yīng)5?30分鐘。根據(jù)本發(fā)明的實施例，光學(xué)成膠的條件為于光下照射10?1000秒，其中，光學(xué)成膠采用的光為紫外光、可見光、紅外光中的至少一種。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述制備前面所述的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的方法中采用的基板的表面預(yù)先利用十八烷基三氯硅烷進行修飾，基底材料的表面預(yù)先利用甲基丙烯酸3_(三甲氧基硅烷)丙酯進行修飾。
[0021]在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了前面所述的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料在以下之一中的用途:a.調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)與細(xì)胞形態(tài);b.非侵入性收集細(xì)胞;c.維持細(xì)胞代次間穩(wěn)定性，保存細(xì)胞表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)免受破壞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將上述水凝膠用于