一種新的生物堿類(lèi)化合物及其制備方法和醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從紫草的干燥根中分離得到的一種具有治療 黑色素瘤作用的生物堿類(lèi)化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫草為紫草科植物新疆軟紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.、紫草 Lithospermum erythrorhizon Sieb et Zucc·或內(nèi)蒙紫草Arnebia guttata Bunge的干燥 根。紫草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代諸家本草均有詳細(xì)記載。其性寒，味甘、咸，歸心、肝經(jīng)， 具有止血涼血之功效，用于治療血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、熱病斑疹、濕疹、尿血、血 淋、血痢、熱結(jié)便秘、瘡瘍、丹毒、燒傷、惡瘡、癬等。
[0003] 紫草在臨床上被廣泛有效的利用，激發(fā)了人們對(duì)紫草化學(xué)成分的研究。紫草化學(xué) 成分的發(fā)現(xiàn)及機(jī)制方面不斷深入的研究，為人們克服癌癥、病毒感染、艾滋病等疑難病癥提 供了依據(jù)和藥物治療手段。紫草中含有多種化學(xué)成分，包括萘醌類(lèi)、苯醌類(lèi)、生物堿類(lèi)、苯 酚、酚酸類(lèi)、三萜酸、留醇類(lèi)、黃酮類(lèi)以及多糖類(lèi)等物質(zhì)，目前研究較多的是脂溶性很強(qiáng)的萘 醌類(lèi)化合物和水溶性多糖。其中萘醌類(lèi)是紫草抗癌的主要化學(xué)成分，兩種分子量分別為 27336,1152的多糖混合物是其抗人乳頭瘤病毒的主要成分。
[0004] 紫草對(duì)多種細(xì)菌、真菌、病毒(皰疹病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒)均有抑制作用。從紫 草中提取的天然萘醌類(lèi)化學(xué)成分具有一定的抗腫瘤作用。紫草對(duì)白三烯和5-羥色胺的合成 有抑制作用，具抗組胺等炎癥介質(zhì)作用，故利用紫草這一藥理作用用于防治支氣管哮喘、蕁 麻疹等疾病。紫草還可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能及自然殺傷細(xì)胞活性，增加淋巴細(xì)胞的數(shù) 量，對(duì)小鼠特異性及非特異性免疫均有增強(qiáng)作用。此外，紫草還具有抗生育、降血糖、抗氧 化、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)傷口愈合、消斑、促進(jìn)角質(zhì)異常恢復(fù)等作用，在臨床上用于避孕，治療糖 尿病、肝臟脂質(zhì)氧化性損傷、外傷、燒傷、燙傷、銀肩病等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種從紫草的干燥根中分離得到的一種具有治療黑色素瘤 作用的生物堿類(lèi)化合物及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I)，
[0008 σ·
[0009]所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)紫草的干燥根粉碎，用70~ 80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正 丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中乙酸乙 酯萃取物用大孔樹(shù)脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫12個(gè)柱體積， 收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫物浸 膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80 :1、50:1、30:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為15:1、10:1和 5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟(a)中，用75%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0011] 進(jìn)一步地，所述大孔樹(shù)脂為AB-8型大孔吸附樹(shù)脂。
[0012] -種藥物組合物，該藥物組合物含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物（I)和 藥學(xué)上可接受的載體。
[0013] 所述的化合物(I)在制備治療黑色素瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 所述的藥物組合物在制備治療黑色素瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0016] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì) 人和動(dòng)物無(wú)毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0017] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過(guò)口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無(wú)菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0019] 圖2為化合物（I)理論ECD值與實(shí)驗(yàn)ECD值比較；
[0020] 圖3為BrdU免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0022]實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0023] 試劑來(lái)源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0024] 紫草經(jīng)鑒定為內(nèi)蒙紫草Arnebia guttata Bunge的干燥根。
[0025] 制備方法：（a)將紫草的干燥根(8kg)粉碎，用75%乙醇熱回流提取(25LX3次），合 并提取液，濃縮至無(wú)醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水飽和的正 丁醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(347g)和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹(shù)脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用 70%乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫物浸膏（129g); (c)步驟(b)中70%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1(8個(gè)柱體積）、50:1 (8個(gè)柱體積）、30:1(6個(gè)柱體積）、10:1(8個(gè)柱體積)和1:1(5個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4(31g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為 15:1(8個(gè)柱體積）、10:1(10個(gè)柱體積)和5:1(6個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3 個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2(14g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度 為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合 物（I)(28mg)。
[0026] 結(jié)構(gòu)確證:淺黃色油狀物;HR-ESMS顯示[M+Na]+為m/z 456.2312，結(jié)合核磁特征 可得分子式為C26H31N3〇3，不飽和度為13。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δ Η(ΡΡπι，DMS〇-d6，600MHz):H-3 (1.94，m)，H-3(2.31，m)，H-7(6.41，br，s)，H-9(7.45，d，J=8)，H-10(7.01，m)，H-ll(7.09， m)，H-12(7.28，d，J = 8)，H-14(1.62，m)，H-14(1.79，m)，H-15(3.41，br，d，J = 7)，H-17 (4.17，d，J=12)，H-17(4.38，d，J=12)，H-18(0.87，s)，H-19(2.02，m，2H)，H-21(5.57，s)， H-2'（8.28，br，s)，H-4'（7.39，br，t，J=7)，H-5'（7.05，m)，H-6'（8.32，m)，H-7'（3.19，m)， !1-8'（1.18，1^，(1，了 = 8)，16<0:^(3.71，8)，順(9.82，1^，8);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)6。(卯 111， DMSO-de ,150MHz)： 135.4(C, 2-0,45.7(CH2,3-C) ,101.3(CH,7-C) ,127.2(C, 8-0,119.8 (CH，9-C)，119.3(CH，10-C)，121.4(CH，11-C)，110.6(CH，12-C)，135.7(C，13-C)，25.8(CH2， 14-C)，38.7(CH，15-C)，57.3(C，16-C)，65.5(CH2，17-C)，12.7(CH 3，18-C)，25.7(CH2，19-C)， 115.1(C，20-C)，131.9(CH，2卜C)，148.8(CH，2'-C)，132.7(C，3'-C)，134.5(CH，4'-C)， 123.8(CH，5'-C)，148.1(CH，6'-C)，61.0(CH，7'-C)，18.9(CH 3,8'-C)，173.8(C，16-C〇2Me)， 52.2(CH3，16-C0 2Me);碳原子標(biāo)記參見(jiàn)圖1。IR光譜表明該化合物含有胺基，羥基(3380CHT1) 和酯羰基（1725〇^1);群光譜顯示出吲哚的特征吸收帶231，282和290腹。 1!1匪1?譜顯示八個(gè) 芳族共振信號(hào)0!17.〇1，7.〇5,7.〇9,7.28,7.39,7.45,8.28,8.32)，一個(gè)吲哚順0!19.82)，一 個(gè)甲基酯基（δΗ3·71)，一個(gè)羥甲基 0H4.17,4.38;d，J=12Hz)，一fCHMe(SH1.18,3.19)& 及一個(gè)乙基側(cè)鏈(δΗΟ. 87，2.02)。130 NMR譜26個(gè)碳顯示了 26個(gè)共振碳信號(hào)，包括三個(gè)甲基， 四個(gè)亞甲基，十二個(gè)次甲基，四個(gè)季碳，一個(gè)酯羰基，并且有兩個(gè)叔碳(C-2和C-13)與吲哚氮 相連。根據(jù)COSY譜可知，八個(gè)共振芳?xì)渲杏羞B續(xù)四個(gè)分配到吲哚結(jié)構(gòu)中（Η-9，Η-10，Η-11和 H-12)。芳香氫質(zhì)子雙峰信號(hào)δΗ7.28與吲哚ΝΗ(δΗ9.88)的N0E相關(guān)性表明這一雙峰信號(hào)為H-12,另一個(gè)雙峰信號(hào)δΗ7.45為Η-9。此外，Η-9與另一個(gè)芳香族氫質(zhì)子單峰δΗ6.41(δα〇1.3) 的NOE相關(guān)性表明這些氫近似，且這個(gè)相對(duì)屏蔽芳香質(zhì)子為6,7_開(kāi)環(huán)單萜吲哚的Η-7。另外 四個(gè)共振芳?xì)?，五個(gè)芳香族碳信號(hào)（SC123.8，132.7，134.5，148.1和148.8)以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)叔 胺的存在，表明該化合物含有一個(gè)3-取代吡啶環(huán)。吡啶部分特征性的質(zhì)子和碳信號(hào)δΗ8.28 (δα48.8)和δΗ8.32(δ(：148.1)驗(yàn)證了上述推論。從 1H NMR譜可知吡啶部分C-3'位的烷基取 代基為-CHCH3，此基團(tuán)與單萜吲哚的Ν-4位相連。季碳C-l 6 (SC57.3)連有一個(gè)羥甲基和甲酯 基，一邊與吲哚部分的C-2相連，一邊通過(guò)C-15與C-20位含有乙基側(cè)鏈的乙基吡啶基取代的 2，3-脫氫哌啶部分相連。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類(lèi)型核磁數(shù) 據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過(guò)ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基 本一致(圖2)。
[0027]實(shí)施例2:化合物（I)藥理作用試驗(yàn) [0028] -、材料和儀器
[0029] 人Α375黑色素瘤細(xì)胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)贈(zèng)。化合物（I)自制，制備方法見(jiàn)實(shí)施例1， HPLC歸一化純度大于98%<^ΜΕΜ培養(yǎng)基、0.25%胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。ΜΤΤ(3-(4,5-二甲 基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽；四甲基偶氮唑藍(lán)）、DMS0(二甲基亞砜）、BrdU購(gòu)自美國(guó) Sigma公司。鼠抗BrdU多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)ABcam公司。山羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Cel 1 signaling公司。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。
[0030] 恒溫C02培養(yǎng)箱，普通冰箱，-80度冰箱均為美國(guó)Forma公司產(chǎn)品。超凈工作臺(tái)（中國(guó) 蘇州凈化工程公司）。倒置顯微鏡，倒置熒光顯微鏡(Olympus公司）。電熱恒溫培養(yǎng)箱（中國(guó) 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。自動(dòng)酶標(biāo)儀（日本W(wǎng)ako公司）。紫外分光光度儀(美