使用合成信使rna無飼養(yǎng)層衍生人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制作方法
【專利說明】使用合成信使RNA無飼養(yǎng)層衍生人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞
[0001 ] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002]本申請(qǐng)要求2013年5月13日提交的美國申請(qǐng)序列號(hào)13/893，166的權(quán)利并是它的部分連續(xù)案；該申請(qǐng)要求2012年5月13日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/646,292的優(yōu)先權(quán)的權(quán)利。這些申請(qǐng)的每一個(gè)的內(nèi)容在此以其整體引為參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003]本公開主要涉及用于通過受控方法使用一種或多種工程化的重編程因子來生成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)的新方法和組合物。具體地，本公開涉及建立重編程因子的組合，所述組合包括常規(guī)重編程因子與反式激活結(jié)構(gòu)域間的融合，其經(jīng)優(yōu)化用于多種細(xì)胞類型的重編程。更具體地，本文所公開的示例性方法可用于從多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型，包括非人的靈長類動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。還公開了使用合成的信使RNA，無飼養(yǎng)層衍生人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的示例性方法。
【背景技術(shù)】
[0004]以下包括了可能有助于理解本公開各個(gè)方面和實(shí)施方式的信息。這并非承認(rèn)任何此處所提供的信息是現(xiàn)有技術(shù)，或與本文描述或要求保護(hù)的發(fā)明相關(guān)，或者任何明確或隱含引用的出版物或文件是現(xiàn)有技術(shù)。
[0005]誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)的治療潛能激發(fā)了開發(fā)重編程方法的努力，來回避對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行基因修飾以實(shí)現(xiàn)重編程進(jìn)入多能狀態(tài)的需求。第一批在這方面成功實(shí)現(xiàn)的“非整合”方式一一蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和利用腺病毒載體一一由于得到的iPSC的轉(zhuǎn)化率低而在應(yīng)用中受到限制。最近已證明，采用游離型DNA、仙臺(tái)病毒、和合成的信使RNA(mRNA)的技術(shù)產(chǎn)生的“無足跡” iPSC，得到的效率相當(dāng)于或超過使用整合病毒載體得到的效率。RNA轉(zhuǎn)染原則上是這些方法中最有吸引力的，因?yàn)樗峁?duì)重編程因子(RF)表達(dá)時(shí)間過程的精確控制，而完全避免了對(duì)于“清理”被重編程的細(xì)胞以清除載體的殘余痕跡的任何要求。然而，由于為誘導(dǎo)人細(xì)胞中的多能性而要求每日重新轉(zhuǎn)染持續(xù)約2周的這一需求，目前基于mRNA的重編程流程相對(duì)勞動(dòng)強(qiáng)度較大。這些過程還依賴于使用飼養(yǎng)層細(xì)胞，這增加了過程的復(fù)雜性和技術(shù)上的可變性，同時(shí)引入了非人源的(“異種”)的生物材料的潛在污染源。
[0006]生成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)的主要困難是將分化細(xì)胞重編程為多能細(xì)胞的效率低。先前已經(jīng)報(bào)道，當(dāng)用由0ct4和MyoD的反式激活結(jié)構(gòu)域(稱為M30)組成的融合基因，連同Sox2，Klf4和c-Myc(SKM)轉(zhuǎn)導(dǎo)的時(shí)候，5%的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)被重編程成iPSC。此夕卜，在大多數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)的MEF中，包括沒有成為iPSC的細(xì)胞中，M30促進(jìn)多能性基因的染色質(zhì)重塑。這些觀察表明了在給予更有利的培養(yǎng)條件下超過5%的細(xì)胞獲得成為iPSC的能力的可能性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]由于RNA分子一旦被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)由其引起的潛在的細(xì)胞免疫應(yīng)答，用mRNA成功重編程非人源細(xì)胞一直難以實(shí)現(xiàn)。在重編程人成纖維細(xì)胞的過程中，通常的做法是使用一種病毒蛋白作為誘餌受體使轉(zhuǎn)染的mRNA分子誘導(dǎo)的干擾素減效。然而，使用誘餌受體的這種策略或其它類似策略都沒有成功地將源自非人類物種，包括狒狒、馬和狗的成纖維細(xì)胞重編程。
[0008]因此，為了解決這些缺陷，本公開提供了用于生成能夠產(chǎn)生身體的所有的不同組織的干細(xì)胞的方法和組合物。在某些方面，使用信使RNA分子且不需要病毒載體或飼養(yǎng)層細(xì)胞，本文公開的方法可用于將非人源成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)。與之前報(bào)道的細(xì)胞重編程方法學(xué)相比，使用的示例性方法和組合物產(chǎn)生了令人驚訝的和意想不到的改進(jìn)效率，并且克服了先前未解決的在非人類哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)的問題。
[0009]因此，提供了方法、試劑和/或組合物，其可用于通過改進(jìn)重編程因子(RF)混合物，特別是通過應(yīng)用常規(guī)重編程因子，如0ct4(也被稱為0ct3/4)，SoX2等的工程化變體，并結(jié)合已知的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子如VP16和MyoD的反式激活結(jié)構(gòu)域而加速mRNA介導(dǎo)的重編程。本文所公開的方法和組合物得到了一個(gè)無飼養(yǎng)層的方案，其極大地減少了涉及基于mRNA的重編程的時(shí)間，成本和精力。
[0010]一方面，本公開提供了一種用于對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行去分化或重編程的方法，其包含:a)用組合物轉(zhuǎn)染分離的體細(xì)胞，所述組合物包含有效量的融合產(chǎn)物，該融合產(chǎn)物為選自0ct4、3(?2、1(1￡4、015^、他1108和1^1128的任意一種或多種合成1]11?嫩重編程因子與反式激活結(jié)構(gòu)域之間形成的融合產(chǎn)物，從而所述體細(xì)胞被重編程或去分化。
[0011]在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了權(quán)利要求1的方法，其中組合物包含融合于N末端的MyoD反式激活結(jié)構(gòu)域的0ct4。在一個(gè)實(shí)施方式中，0ct4融合到三倍串聯(lián)形式的N-末端的MyoD反式激活結(jié)構(gòu)域。
[0012]在一個(gè)方面，提供了用于通過使用權(quán)利要求1的重編程因子的合成mRNA中的任意一種或多種對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行重編程的方法，所述方法包含:a)將靶細(xì)胞以1.5萬到50萬個(gè)細(xì)胞每標(biāo)準(zhǔn)6孔板的孔的密度生長在無飼養(yǎng)層表面上;b)重編程期間用每次50ng/ml到800ng/ml mRNA的不同劑量轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方式中，靶細(xì)胞以3萬、7.5萬、10萬、或15萬細(xì)胞/標(biāo)準(zhǔn)6孔板的孔的密度生長在無飼養(yǎng)層表面上;b)重編程期間用每次50ng/ml到800ng/ml mRNA的不同劑量轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而更早的時(shí)間點(diǎn)比稍后的時(shí)間點(diǎn)使用較低劑量;c)無需傳代而獲得iPSC。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方式中，靶細(xì)胞以1.5萬、7.5萬、10萬、或15萬細(xì)胞/標(biāo)準(zhǔn)6孔板的孔的密度生長在無飼養(yǎng)層表面上，而每孔的體積調(diào)整為0.5ml至5ml之間的適當(dāng)培養(yǎng)基；重編程期間用每次50ng/ml到800ng/ml mRNA的不同劑量轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而更早的時(shí)間點(diǎn)比稍后的時(shí)間點(diǎn)使用較低劑量;無需傳代而獲得iPSC。
[0015]在特定實(shí)施方式中，在整個(gè)重編程過程中使用較低劑量減少了細(xì)胞免疫應(yīng)答并產(chǎn)生了提高的iPSC成功率。在其他實(shí)施方式中，使用高純度的mRNA分子，即沒有來自體外轉(zhuǎn)錄的污染性異常轉(zhuǎn)錄本，使細(xì)胞得以以較低的密度植入，在重復(fù)轉(zhuǎn)染下存活，并獲得更高的iPSC的產(chǎn)量。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法無異種。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是非人靈長類動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人靈長類動(dòng)物細(xì)胞是食蟹猴細(xì)胞。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一種或多種因子選自mRNA、調(diào)控RNA、siRNA、miRNA以及它們的組合。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述體細(xì)胞用至少兩種不同的RNA轉(zhuǎn)染。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述體細(xì)胞選自單能、專能(multipotent)、多能(pluripotent)、以及分化的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一種或多種RNA誘導(dǎo)體細(xì)胞去分化成單能細(xì)胞、專能細(xì)胞、或多能細(xì)胞。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種因子選自0CT4，S0X2，NANOG，LIN28，KLF^PMYCmRNA。在一個(gè)實(shí)施方式中，0CT4，S0X2，NANOG，和LIN28的mRNA組合施用。在一個(gè)實(shí)施方式中，0CT4，S0X2，KLF4 和 MYC 的 mRNA 組合施用。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方式中，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞保持在培養(yǎng)物中作為誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞形成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，其進(jìn)一步包含誘導(dǎo)iPS細(xì)胞形成分化細(xì)胞。
[0021]在一個(gè)方面，提供了一種用于治療或抑制患者中的疾病或病癥的一種或多種癥狀的方法，其包括在體外去分化細(xì)胞和對(duì)所述患者施用所述細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物還包含Rarg和LrH-1反式激活結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物包含融合于VP16反式激活結(jié)構(gòu)域的0CT4。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方式中，本公開提供了源自非人靈長類動(dòng)物細(xì)胞的iPSC，該細(xì)胞用于建立疾病模型系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈兛梢援a(chǎn)生沒有其他動(dòng)物產(chǎn)品的無內(nèi)整合(in-1ntegrat1n-free)、無飼養(yǎng)層測(cè)試環(huán)境。因此，本文所述非人iPSC可用于臨床前測(cè)試。
[0023]本文描述和要求保護(hù)的發(fā)明具有許多屬性和實(shí)施方式，包括但不限于
【發(fā)明內(nèi)容】
中闡述或描述或引用的屬性和實(shí)施方式。不意味著全部包含在內(nèi)，本文描述和要求保護(hù)的發(fā)明并不限于或通過在
【發(fā)明內(nèi)容】
中限定的特征和實(shí)施方式，其只以說明而非限制為目的包括在內(nèi)。另外的實(shí)施方式可在以下【具體實(shí)施方式】中公開。
【附圖說明】
[0024]圖1.用基于M30的mRNA重編程混合物衍生得到的iPSC集落。
[0025](A)從第一基于M30的BJ重編程試驗(yàn)衍生得出的增殖的iPSC克隆中的兩個(gè)的10倍亮場(chǎng)圖像。(B)增殖克隆針對(duì)多能性標(biāo)志物的免疫染色。
[0026]圖2.使用基于M30混合物的無飼養(yǎng)層重編程。
[0027](A)免疫熒光成像顯示由5萬XFF成纖維細(xì)胞上的無飼養(yǎng)層衍生產(chǎn)生的TRA-1-60+集落，其比較了基于c-Myc和L-Myc混合物和4小時(shí)和24小時(shí)轉(zhuǎn)染方案。所有孔轉(zhuǎn)染9天。4小時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物在實(shí)驗(yàn)的第15天進(jìn)行固定染色，24小時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物在第11天。(B)來自同一實(shí)驗(yàn)的400ng/ml的Stemfect孔的10倍亮場(chǎng)成像，其示出了在衍生的第9天，培養(yǎng)物中主要為近融合的hESC樣集落。(C)在再次用400ng/mL的Stemfect方案轉(zhuǎn)染10萬XFFs 9天的后續(xù)試驗(yàn)中，標(biāo)記視場(chǎng)的1X亮場(chǎng)時(shí)序，其示出上皮化和隨后出現(xiàn)了hESC樣集落。
[0028]圖3.使用4種不同的mRNA混合物的重編程效率的比較。流程圖總結(jié)了4種混合物對(duì)比試驗(yàn)。
[0029]圖4.在HDF-a無飼養(yǎng)層重編程培養(yǎng)物中的hESC樣集落。在7.5萬HDF-a成體成纖維細(xì)胞無飼養(yǎng)層衍生的第9天，出現(xiàn)的hESC樣集落的10倍亮場(chǎng)圖像，使用Stemfect轉(zhuǎn)染試劑遞送作為培養(yǎng)基增補(bǔ)劑的400ng/ml mRNA混合物(M30+c_Myc+Nanog+)來處理所述成纖維細(xì)胞9天。
[0030]圖5.合成mRNA混合物的產(chǎn)生。(A)示意圖總結(jié)了制備mRNA重編程混合物的過程。
(B)在SYBR E-凝膠上的編碼數(shù)個(gè)RF和熒光報(bào)告分子的合成mRNA。每個(gè)泳道加入500ng的RNA0
[0031 ]圖6.用2-硫尿嘧啶產(chǎn)生合成mRNA混合物用作重編程混合物。在SYBR E-凝膠上的編碼數(shù)個(gè)RF的合成mRNA。所述mRNA的尿嘧啶堿基的1 %被2-硫尿嘧啶取代。每個(gè)泳道加入10ng的RNA。
[0032]圖7.使用mRNA混合物產(chǎn)生的人iPSC，其中mRNA被2-硫尿嘧啶修飾。在(A)Pluriton或(B)Allele重編程培養(yǎng)基中的不同重編程過程期間，重編程(A)7天后或(B)Il天后的人iPSC 群。
[0033]圖8.利用mRNA混合物在無飼養(yǎng)層重編程培養(yǎng)中產(chǎn)生的食蟹猴iPSC集落。圖中所示的是在第10天及13天出現(xiàn)的hESC樣集落的10倍亮場(chǎng)圖像。在第10天的圖中，鄰近中心的細(xì)胞顯示出從成纖維細(xì)胞向干細(xì)胞的形態(tài)變化。在第13天的圖中，細(xì)胞形成完全轉(zhuǎn)化的猴iPSC大集落。
【具體實(shí)施方式】
[0034]描述本發(fā)明時(shí)，所有未在本文中定義的術(shù)語具有本領(lǐng)域公認(rèn)的其常用的含義。就下面的描述是本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】或具體用途的程度而言，其意圖僅是說明性的，并不限制所要求保護(hù)的發(fā)明。以下的描述意在涵蓋包括在本發(fā)明的精神和范圍中的所有替換、修改和等同物。
[0035]通過選定的一組轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，分化的細(xì)胞可以恢復(fù)為多能狀態(tài)，這打開了患者特異性細(xì)胞可能用于產(chǎn)生任何所需類型的細(xì)胞以用于遺傳性疾病的體外研究和最終用于細(xì)胞替代療