一種成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多功能干細(xì)胞的方法
【專利說明】一種成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多功能干細(xì)胞的方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及一種成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多功能干細(xì)胞的方法，具體涉及的是一種白癜風(fēng)病人皮損處皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多功能干細(xì)胞的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003]白癜風(fēng)(vitiligo)是一種常見的局部或全身色素脫失性皮膚病，該病發(fā)病率約為0.5-2%，臨床表現(xiàn)為色素脫失，及白斑形成，邊緣較清晰。白癜風(fēng)的發(fā)病機制不是很明確，近年來研究與遺傳因素、自身免疫因素、氧化應(yīng)激反應(yīng)、黑素細(xì)胞自身破壞以及精神神經(jīng)因素等方面有關(guān)。該病治療方法有多種，包括藥物治療、物理治療、外科手術(shù)治療等，但效果并不十分理想，對患者的生活造成一定影響。
[0004]用干細(xì)胞進(jìn)行疾病治療的研究近年來已有許多成果，對于白癜風(fēng)的治療也可以利用干細(xì)胞來實現(xiàn)。由于白癜風(fēng)病人皮損處的黑素細(xì)胞功能下降甚至缺失，可以利用干細(xì)胞誘導(dǎo)出黑素細(xì)胞后進(jìn)行相關(guān)治療。目前誘導(dǎo)分化出黑素細(xì)胞的干細(xì)胞有胚胎干細(xì)胞(EScell)、繆斯細(xì)胞(Muse cell)、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPS cell)。
[0005]誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞首先是由日本科學(xué)家Yamanaka利用小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)出來的(Takahashi，K.and S.Yamanaka, Induct1n of pluripotent stem cells frommouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell, 2006.126(4): p.663-76.)，通過過表達(dá)0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc四種轉(zhuǎn)錄因子使細(xì)胞從終末分化狀態(tài)變?yōu)楦杉?xì)胞狀態(tài)。后來又成功利用人成纖維細(xì)胞實現(xiàn)了向干細(xì)胞的誘導(dǎo)。iPS細(xì)胞在形態(tài)、表觀遺傳、功能等方面與ES細(xì)胞相似，但卻避免了 ES細(xì)胞所要面臨的倫理學(xué)問題。
[0006]自從iPS技術(shù)問世后，其成為一個全球的研究熱點。全世界許多實驗室都在逐步利用不同病人來源的體細(xì)胞重編程出相應(yīng)的iPS細(xì)胞，這類細(xì)胞不僅具有相應(yīng)疾病的特征性改變，并且對疾病模型的建立、研究以及藥物篩選等方面具有重要意義。目前已經(jīng)成功建立iPS細(xì)胞系的疾病包括高雪氏癥、帕金森病、21三體綜合征(Park，1.H.，et al.，Disease-specific induced pluripotent stem cells.Cell, 2008.134(5): p.877-86.)、擴張型心肌病(Sun, N., et al., Patient-specific induced pluripotent stemcells as a model for familial dilated card1myopathy.Sci Transl Medj 2012.4(130): p.130ra47.)、色素性視網(wǎng)膜炎(Jin，Z.B., et al., Modeling RetinalDegenerat1n Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.Plos One,2011.6(2).)、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤(Larribere，L., et al., NFl loss inducessenescence during human melanocyte differentiat1n in an iPSC—based model.Pigment Cell Melanoma Res , 2015.)、白血病(Kurokawa，M.and M.Miyauchi ,[Induced pluripotent stem cells from leukemia patients as a platform fordissecting pathogenesis].Rinsho Ketsueki，2014.55(10): p.2202-7.)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Lee, J., et al., Generat1n of disease-specific induced pluripotentstem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis.Arthritis Research & Therapy, 2014.16(1).)等，在皮膚病相關(guān)疾病中利用病人體細(xì)胞重編程出病人iPS細(xì)胞的實例較少。
[0007]由于iPS細(xì)胞可以來源于多種成體細(xì)胞，病人的iPS細(xì)胞成為一個研究熱點。利用病人的成體細(xì)胞誘導(dǎo)出的iPS細(xì)胞具有此類疾病的特點，所以病人iPS細(xì)胞在疾病治療、疾病模型建立以及藥物篩選等方面具有重要的意義。通過基因修飾等手段使病人iPS細(xì)胞不具有疾病特征，從而誘導(dǎo)分化出相關(guān)的細(xì)胞、組織或者器官，進(jìn)行病人自體移植治療，不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，這是iPS細(xì)胞與ES細(xì)胞相比較的另一個優(yōu)勢。目前已有多種病人的體細(xì)胞唄誘導(dǎo)為多功能細(xì)胞，而利用白癜風(fēng)病人的體細(xì)胞誘導(dǎo)為多功能干細(xì)胞未見文獻(xiàn)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種白癜風(fēng)病人皮損處成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多功能干細(xì)胞的方法。
[0009]本發(fā)明首次提供用白癜風(fēng)病人皮損處成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多功能干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟:白癜風(fēng)病人皮損處成纖維細(xì)胞的獲?。话遵帮L(fēng)病人多功能干細(xì)胞的誘導(dǎo);獲得的白癜風(fēng)病人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的鑒定。
[0010](I)白癜風(fēng)病人皮損處成纖維細(xì)胞的獲取:
A.取得白癜風(fēng)病人皮損組織后，在超凈臺取出，用含1%雙抗(青霉素和鏈霉素)PBS緩沖液洗滌3次，剪碎成Imm3小塊。
[0011]B.滅菌后的蓋玻片蓋于組織塊上，加含10%血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(Hycl0ne)37度培養(yǎng)，10至15天可見成纖維細(xì)胞出現(xiàn)，2至3天換液。
[0012](2)白癜風(fēng)病人多功能干細(xì)胞的誘導(dǎo):
A.步驟(I)所得的白癜風(fēng)病人皮損處成纖維細(xì)胞取15細(xì)胞量，再加入0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc四種逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，病毒量分別為400仙，過表達(dá)0ct4、Sox2、Klf4、c_Myc四種轉(zhuǎn)錄因子。
[0013]B.細(xì)胞培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)層細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)上，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C、5%C02、5%θ2，每天換液，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)拍照，12天后挑單克隆至新的飼養(yǎng)層細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)上。
[0014]其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為ES培養(yǎng)基加維生素C(50mg/ml)，ES培養(yǎng)基包括80% DMEM/F12、20% KSR、1% Non-essential amino acids、lmM L-gIutaMAX > 0.1mM β-mercaptoethanol、5ng/ml bFGFo
[0015]C.用ES培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于低氧培養(yǎng)箱內(nèi)，條件為37°C、5%C02、5%02，每天更換培養(yǎng)基，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。
[0016](3)鑒定白癜風(fēng)病人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的特征，確定其具有干細(xì)胞的特點以及功會K。
[0017]本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)點
(I)iPS細(xì)胞是與ES細(xì)胞及其相似的一類誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞，在表觀遺傳、功能等方面均有很高的相似性，而ES細(xì)胞自問世以來卻具有爭議，因為人的ES細(xì)胞來源于流產(chǎn)胎兒，不符合倫理學(xué)，并且不適合批量生產(chǎn)，對于其應(yīng)用產(chǎn)生了阻礙，但是iPS細(xì)胞在來源方面不具備這樣的問題，已經(jīng)有多種細(xì)胞建立了 iPS細(xì)胞系，包括成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞，甚至尿液細(xì)胞等；
(2)iPS細(xì)胞不僅來源廣泛，也可以在利用其過程中避免免疫排斥反應(yīng)，因為人ES細(xì)胞畢竟還是同種異體細(xì)胞，利用ES細(xì)胞來治療疾病的話存在免疫排斥問題，而病人自體的iPS細(xì)胞在治療過程中則不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。
[0018](3)來自于病人的iPS細(xì)胞證實了具有相應(yīng)疾病的特征，通過對病人iPS的研究就可以清楚了解到疾病在某基因方面的缺陷等，有利于疾病的研究。同時也可以利用病人iPS細(xì)胞建立相應(yīng)的疾病模型，將其輸入至小鼠體內(nèi)，建立出人源化小鼠疾病模型，可以進(jìn)行藥物篩選等方面的研究。
[0019](4)病人iPS細(xì)胞系的建立成為一個熱點，許多實驗室已經(jīng)建立了多種疾病的iPS細(xì)胞系，比如高雪氏癥、帕金森病、21三體綜合征、擴張型心肌病、色素性視網(wǎng)膜炎、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤、白血病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。在皮膚病學(xué)的研究中，也可以利用這項技術(shù)來研究相關(guān)疾病，但是目前來說實例并不多，并且在色素脫失方面疾病的研究更是稀少。本發(fā)明首次利用白癜風(fēng)病人皮損處的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)出多功能干細(xì)胞，對以后白癜風(fēng)的干細(xì)胞治療以及白癜風(fēng)發(fā)病機制的研究具有重要意義。
【附圖說明】
[0020]圖1.白癜風(fēng)病人皮損處成纖維細(xì)胞形態(tài)觀察圖，圖中標(biāo)尺大小為ΙΟΟμπι;
圖2.白癜風(fēng)病人皮損處成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多功能干細(xì)胞過程中第4天細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Γ4)，箭頭處表示出現(xiàn)的iPS小克隆;2幅圖中標(biāo)尺大小均為ΙΟΟμπι;
圖3.第二代白癜風(fēng)病人iPS(VP-1PS)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察圖；a: x4;b:xl0;圖a和b中標(biāo)尺大小均為ΙΟΟμπι;
圖4.VP-1PS細(xì)胞堿性磷酸酶染色結(jié)果;a: x4; b: XlO;圖a和b中標(biāo)尺大小為ΙΟΟμπι;
圖5.VP-1PS細(xì)胞免疫熒光染色檢測干細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)結(jié)果;標(biāo)記物包括0CT4、NANOG、TRA-1-60、SSEA4;
圖6.VP-1PS細(xì)胞在干細(xì)胞相關(guān)基因的相對表達(dá)圖(*:P<