一種用于Vip3A基因檢測的實時熒光檢測方法及其試劑盒的制作方法
【專利說明】-種用于Vi p3A基因檢測的實時巧光檢測方法及其試劑盒
[0001 ] 摘要 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測方法，具體設(shè)及Vip3A實時 巧光PCR檢測引物、探針、方法及試劑盒。本方法首先公開了用于精準檢測轉(zhuǎn)基因玉米中 Vip3A的特異性引物對和探針。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明建立了一種特異性強、靈敏度高的Vip3A 的實時巧光PCR檢測方法。本發(fā)明進一步公開了一種Vip3A的實時巧光PCR檢測試劑盒。實驗 證明，本發(fā)明提供的Vip3A實時巧光PCR檢測引物、探針、方法及試劑盒具有特異性強、靈敏 度高等優(yōu)點，適用于Vip3A的特異性精準檢測。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測方法，具體設(shè)及轉(zhuǎn)基 因玉米中Vip3A的實時巧光PCR檢測引物、探針、方法及試劑盒，適用于Vip3A的特異性精準 檢測。
【背景技術(shù)】
[0003] Vip3A是一種來自蘇云金芽抱桿菌的抗鱗翅目昆蟲蛋白基因。先正達公司將Vip3A 轉(zhuǎn)入玉米中，開發(fā)了轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品系。
[0004] 目前含有Vip3A基因的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162在美國、加拿大、阿根廷和己西獲得了種 植批準，已經(jīng)投入商業(yè)化生產(chǎn)。我國農(nóng)業(yè)部已經(jīng)批準MIR162轉(zhuǎn)基因玉米用于加工原料。目 前，已經(jīng)有針對MIR162品系插入位點側(cè)翼序列的檢測方法，尚無針對Vip3A實時巧光PCR檢 測方法。
[000引本研究通過設(shè)計針對Vip3A的特異引物、探針，開發(fā)了實時巧光PCR檢測方法及試 劑盒，實現(xiàn)了 Vip3A的高效靈敏快速檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供用于檢測Vip3A基因的特異性引物、探針 本發(fā)明需要解決的另一問題是提供包含上述引物、探針的PCR檢測試劑盒。
[0007] 本發(fā)明用于檢測Vip3A基因的PCR引物、探針序列為： 上游引物 Vip3A-F: 5'一AACGACGACGGCGTCTACA-3' 下游引物 Vip3A-R: 5'一CTCGCGCAGGTAGCTCTTACA-3' 探針 Vip3A-P: 5'FAM-TGACCCCGATCAACGGCTTTGG-冊Q1 3' 本發(fā)明的Vip3A基因檢測試劑盒，包括W下成分： (1 )Vip3A玉米DNA模板和陰性對照玉米DNA模板 (2)Vip3A基因上下游引物、探針： 上游引物 Vip3A-F: 5'一AACGACGACGGCGTCTACA-3' 下游引物 Vip3A-R: 5'一CTCGCGCAGGTAGCTCTTACA-3' 探針 Vip3A-P: 5'FAM-TGACCCCGATCAACGGCTTTGG-冊Q1 3' (3) 10XExTaqBuffer，孤出0,2.5mMdNTP，抓/μlExTaq服 (4) 判定結(jié)果:若無 Ct值或Ct值大于等于40,可W判定該樣品中不含有Vip3A基因；若Ct 值小于35,并且出現(xiàn)典型擴增曲線，可W判定該樣品含有Vip3A基因；若Ct值介于35到40之 間，并出現(xiàn)典型擴增曲線，則需要重新提取樣品基因組DNA，再次進行實時巧光PCR檢測，若 檢測結(jié)果Ct值仍小于40并出現(xiàn)典型擴增曲線，可判定該樣品含有Vip3A基因。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的進步在于:檢測速度快，節(jié)省時間，特異性強，靈敏度 高，穩(wěn)定性好，適合口岸檢疫實驗室快速鑒定轉(zhuǎn)基因玉米中Vip3A基因片段。
【附圖說明】
[0009] 圖1為Vip3A基因檢測試劑盒特異性測試結(jié)果，1-8號為8個不同的轉(zhuǎn)基因玉米品 系，分別為 M0N89034、化ll、Btl76、TC1507、MIR604、M0N88017、MIR162、M0N863,9號為非轉(zhuǎn)基 因玉米。從圖1可W看出，含有Vip3A的7號樣品MIR162玉米品系Ct值小于35,并且出現(xiàn)典型 擴增曲線，其他對照樣品玉米均不含Vip3A基因，無擴增曲線，用本試劑盒能準確地檢測出 Vip3A基因。
【具體實施方式】
[0010] PCR引物、探針設(shè)計：

根據(jù)Vip3A基因序列，利用Primer巧.0軟件，在Vip3A基因序列上設(shè)計一組實時巧光 PCR引物、探針，由Invitrogen (上海英俊生物技術(shù)有限公司）公司合成： 上游引物 vip3A-F: 5'一AACGACGACGGCGTCTACA-3' 下游引物 vip3A-R: 5'一CTCGCGCAGGTAGCTCTTACA-3' 探針 vip3A-P: 5'FAM-TGACCCCGATCAACGGCTTTGG-冊Q1 3' 樣品來源 本實驗測試了 9個玉米種類，其中包括8個轉(zhuǎn)基因玉米品系，1個非轉(zhuǎn)基因玉米，見下 表：
實施例l、Vip3A的檢測 DM提取:按照TIANamp Genomic DNA Kit組織基因組DM提取試劑盒說明書進行操作， 提取包括玉米MIR162等共9個樣品的基因組DNA，溶于lOOuL TE中，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0011] 擴增：W無菌水作為空白對照，分別W9種玉米基因組DM作為模板，進行PCR擴增。
[0012] PCR反應體系：
?〇?反應條件:95°(3預變性2 111111，95°(3變性1〇3,60°(3退火3〇3,40個循環(huán)，4°(3降 溫〇
[0013] 結(jié)果： 從圖1可W看出，7號樣品為含有Vip3A的MIR162玉米品系，Ct值小于35,并且出現(xiàn)典型 擴增曲線，其他對照樣品玉米均不含Vip3A基因，無擴增曲線。結(jié)果表明，本發(fā)明中的Vip3A 特異引物、探針只能對Vip3A基因進行擴增，形成典型擴增曲線，其它陰性對照都沒有出現(xiàn) 擴增曲線，顯示了該引物、探針良好的特異性。
【主權(quán)項】
1. 一種用于Vip3A基因檢測的特異性引物、探針，其特征在于，序列為： 上游引物 Vip3A-F: 5'一AACGACGACGGCGTCTACA-3' 下游引物 Vip3A -R: 5'一CTCGCGCAGGTAGCTCTTACA-3' 探針 Vip3A -P: 5' FAM-TGACCCCGATCAACGGCTTTGG-B冊1 3'。2. -種用于檢測Vip3A基因的試劑盒其特征在于，包括如下成分： (1) 陽性對照MIR162玉米DNA模板和陰性對照玉米DNA模板 (2) Vip3A基因上下游引物、探針 上游引物 Vip3A -F: 5'一AACGACGACGGCGTCTACA-3' 下游引物 Vip3A -R: 5'一CTCGCGCAGGTAGCTCTTACA-3' 探針 Vip3A -P: 5' FAM-TGACCCCGATCAACGGCTTTGG-B冊 13' (3) 10XTaq PCR Buffer，dd出0,2.5mM dNTP，5υ/μ1 Taq酶。3. -種Vip3A基因的快速檢測方法，包括如下步驟： (1) PCR反應體系：(2) PCR反應條件：95 °C預變性2 min，95 °C變性10s，60 °C退火30 s，40個循環(huán)，4 °C降溫 (3)判定結(jié)果:若無 Ct值或Ct值大于等于40,可W判定該樣品中不含有Vip3A基因；若 Ct值小于35,并且出現(xiàn)典型擴增曲線，可W判定該樣品含有Vip3A基因；若Ct值介于35到40 之間，并出現(xiàn)典型擴增曲線，則需要重新提取樣品基因組DNA，再次進行實時巧光PCR檢測， 若檢測結(jié)果Ct值仍小于40并出現(xiàn)典型擴增曲線，可判定該樣品含有Vip3A基因。
【專利摘要】本發(fā)明“一種用于Vip3A基因檢測的實時熒光檢測方法及其試劑盒”涉及轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域。通過設(shè)計針對Vip3A基因特異序列的特異引物，應用PCR擴增技術(shù)，實現(xiàn)了Vip3A基因的快速檢測。該方法特異性強，靈敏度高和穩(wěn)定性好，對于提高Vip3A基因檢測的準確性、縮短檢測時間具有重要的作用。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105543360
【申請?zhí)枴緾N201610003483
【發(fā)明人】趙璟源, 王仲敏, 胡佳續(xù), 于堯, 賀艷, 張裕君
【申請人】天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月6日