一種醇脫氫酶lc3及其基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地設(shè)及一種醇脫氨酶LC3及其基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 酬還原酶廣泛存在于高等動、植物W及低等微生物體內(nèi)。酬還原酶在催化酬、醇時 表現(xiàn)出高度的化學(xué)、區(qū)域、對映體選擇性，受到頗多學(xué)者的青睞，現(xiàn)成為生物催化領(lǐng)域不可 或缺的催化劑。
[0003] 醇脫氨酶(ADH)家族來源的酶在手性化合物合成中占據(jù)了重要地位。醇脫氨酶對 醒基、酬基、單糖W及酬類固醇具有氧化還原能力。醇脫氨酶可分為鋒離子依賴性的ADH和 非離子依賴性的ADH(短鏈醇脫氨酶)兩個超家族。目前研究最多的是短鏈醇脫氨酶家族。酬 還原酶，作為氧化還原酶系中的一個分支，W還原型煙酷胺腺嚷嶺二核巧酸(NADH)或煙酷 胺腺嚷嶺二核巧憐酸(NADPH)為輔酶，可在溫和的條件下將一系列酬或者醒不對稱還原為 具有光學(xué)活性的手性醇。
[0004] 手性藥物是指引入手性的藥物有的一對互為鏡像關(guān)系的對映異構(gòu)體，它們的理化 性質(zhì)相似，但是立體結(jié)構(gòu)的旋光性有所差異。可分為外消旋、R型（右旋）和S型（左旋)Ξ種。 不同的對映體對于不同的目標(biāo)具有不同的生物活性，一個異構(gòu)體是有效的，可能另一個是 無效甚至有害的。手性藥物的用量低、藥效好的特點(diǎn)在臨床治療方面展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用 前景。近年來，隨著對藥物手性特征的深入研究W及對光學(xué)異構(gòu)體的認(rèn)識度的提高，手性藥 物的市場迅猛增長，而消旋藥物的市場W每年29.5%的速度遞減。如今市場上銷售藥品的 Ξ分之一都為單一的同分異構(gòu)型，即手性藥物進(jìn)行銷售。而目前開發(fā)的藥物Ξ分之二都是 手性藥物。
[0005] 手性醇一般可通過天然物質(zhì)提取、化學(xué)合成和生物合成方法獲得。(R)/(S)-4-氯- 3-徑基下酸乙醋(C皿E)是一種非常重要的合成許多藥物化合物的手性中間體。化學(xué)合成法 催化產(chǎn)物的能耗高、污染高，相對于生物法有很多缺陷。生物法又分為動力學(xué)拆分異構(gòu)體和 底物不對稱還原制備光學(xué)純的CHBE。外消旋體的拆分雖然簡單易行，但是其制備效率不高， 且所得產(chǎn)物為混合物，后期分離困難。
[0006] 生物催化轉(zhuǎn)化法制備手性化合物是W氧化還原酶及其相關(guān)的微生物作為催化劑 催化還原潛手性的底物幾基，生成相應(yīng)的手性醇。其中利用基因工程菌進(jìn)行全細(xì)胞催化已 成為生物催化生成手性CHBE的發(fā)展趨勢，生物催化法在制備高對映體過量的手性化合物方 面具有效率高、成本低、裝置簡單、對環(huán)境污染小等優(yōu)勢，近年來受到廣泛關(guān)注。具有良好的 工業(yè)化前景。
[0007] 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的能夠催化4-氯乙酷乙酸乙醋(C0BE)生成光學(xué)醇的4-氯-3-徑基下酸乙 醋(C皿E)的氧化還原酶中大都為生成(S)-C皿E的酶，生成(R)-CHBE的酶比較少見而且轉(zhuǎn)化 率比較低。現(xiàn)報(bào)道的單水相催化C0BE中最高濃度能夠達(dá)到800mM，24h完全轉(zhuǎn)化生成（R)- CH邸(ee〉99%)。（R)-C皿E可用于合成レ肉毒堿、大環(huán)內(nèi)醋A、阿法替尼、2,5-環(huán)己二締合成 纖維的關(guān)鍵手性中間體，并且能夠轉(zhuǎn)化為[+ ]負(fù)霉素。阿法替尼是一種口服藥物，是表皮生 長因子受體化GFR)和人表皮受體2化ER2)酪氨酸激酶的不可逆抑制劑，用于EGFR外顯子19 缺失和外顯子化85R)取代突變的轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者的一線治療。阿法替尼 (a化t in i b)由德國勃林格殷翰研發(fā)，已于2013年7月獲美國FDA批準(zhǔn)上市。目前阿法替尼的 合成路線還是主要W化學(xué)合成法來進(jìn)行。所W生物催化轉(zhuǎn)化法制備(R)-CH邸具有良好的應(yīng) 用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種醇脫氨酶LC3及其基因和應(yīng)用，從而解決現(xiàn)有技術(shù)中制 備手性醇的生物酶的缺失。
[0009] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種醇脫氨酶LC3,其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所 /J、- 〇
[00川所述醇脫氨酶LC3來源于CCTCC Μ 2011381雷氏乳酸桿菌化actobacillus curieae sp.Nov.)。
[0012] 雖然GenBank上公布了一種雙乙酷還原酶，并且具有與上述沈Q ID N0:2相同的氨 基酸序列，也就是說，該段序列在此之前被認(rèn)為是一種雙乙酷還原酶。但是，所謂雙乙酷還 原酶，主要用于催化還原聯(lián)二酬，而醇脫氨酶屬于酬還原酶的一種，催化還原的是酬基，本 專利利用醇脫氨酶催化還原的是一種酬基。醇脫氨酶來源有很多，但針對該底物進(jìn)行催化 還原需要進(jìn)行大量的篩選試驗(yàn)探索。本領(lǐng)域技術(shù)人員一般不會從雙乙酷還原酶推斷出其可 W用來催化還原酬類，因此，目前對于雙乙酷還原酶還停留在催化還原聯(lián)二酬上。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種醇脫氨酶基因 lc3,其堿基序列如SEQ ID N0:1 所示。
[0014] 還提供一種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒由所述醇脫氨酶基因 lc3與表達(dá)載體質(zhì)粒連 接構(gòu)建而成。
[0015] 優(yōu)選地，該表達(dá)載體質(zhì)粒為祀T-28a，構(gòu)成重組質(zhì)粒lc3-pET-28a。
[0016] 還提供另一種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒由如上所述的醇脫氨酶基因 lc3W及葡萄 糖脫氨酶基因 gdh與表達(dá)載體質(zhì)粒連接構(gòu)建而成。
[0017] 優(yōu)選地，該表達(dá)載體質(zhì)粒為祀T-28a，構(gòu)成重組質(zhì)粒lc3-g化-pET-28a。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供一種表達(dá)醇脫氨酶LC3的基因工程菌株，所述基因工 程菌株是將包括醇脫氨酶基因 lc3的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌獲得的基因工程菌株。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供一種共表達(dá)醇脫氨酶LC3和葡萄糖脫氨酶GDH的基因 工程菌株，所述基因工程菌株是將包括醇脫氨酶基因 lc3W及葡萄糖脫氨酶基因 gdh的重組 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌獲得的基因工程菌株。
[0020] 該葡萄糖脫氨酶基因 GDH含有783bp堿基，其在Genbank中的收錄號為M12276,由該 基因編碼的幾基還原酶，包含260個氨基酸，其在Genbank中的收錄號為AAA22463。
[0021 ] 本發(fā)明從雷氏乳酸桿菌(Xactobacillus curieae sp.Nov.)中提取了醇脫氨酶基 因 lc3,并構(gòu)建了含有醇脫氨酶基因 lc3的基因工程菌株，從而實(shí)現(xiàn)了該醇脫氨酶基因 lc3的 異源表達(dá)，所產(chǎn)生的醇脫氨酶LC3具有優(yōu)良的酶學(xué)特性，催化還原的溫度范圍為25-50°C，催 化還原pH值為5.0-8.0，在40°C條件下保存2地后還有70 % W上的的殘余酶活。
[0022] 所述醇脫氨酶LC3的催化溫度優(yōu)選為30-40°C，pH優(yōu)選為5.0-7.0。
[0023] 所述醇脫氨酶LC3的催化溫度最優(yōu)選為35°C，抑最優(yōu)選為6.0。
[0024] 目前本領(lǐng)域?qū)τ陔p乙酷還原酶的研究還僅限于催化還原二碳基，尤其是聯(lián)二酬， 如2,3-下二酬，因此，根據(jù)本領(lǐng)域公知常識，雙乙酷還原酶并不能被用來催化4-氯乙酷乙酸 乙醋生成(R)-4-氯-3?基下酸乙醋。
[0025] 而本發(fā)明還提供一種所述醇脫氨酶LC3W及所述基因工程菌株在合成手性醇類產(chǎn) 品中的應(yīng)用。
[0026] 特別是所述醇脫氨酶LC3W及所述基因工程菌株被用于催化4-氯乙酷乙酸乙醋生 成(R)-4-氯-3?基下酸乙醋的應(yīng)用。
[0027] 具體地，本發(fā)明還提供了一種將共表達(dá)醇脫氨酶LC3和葡萄糖脫氨酶GDH的基因工 程菌株用于催化4-氯乙酷乙酸乙醋生成(R)-4-氯-3?基下酸乙醋的應(yīng)用，該應(yīng)用包括:將 共表達(dá)醇脫氨酶LC3和葡萄糖脫氨酶GDH的基因工程菌株培養(yǎng)所得菌體作為催化劑，在W下 反應(yīng)體系中進(jìn)行催化反應(yīng)：pH 5.0~8.0憐酸鹽、LC3-GDH濕菌體、1.5M~2.25M葡萄糖、 0.2mM NA護(hù)、1.0M~1.5M C0邸于30~45°C水浴鍋中，攬拌，反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)液用乙酸乙醋萃 取，收集萃取相，離屯、，取有機(jī)相減壓蒸饋回收乙酸乙醋，得到油狀的液體即為(R)-4-氯-3 徑基下酸乙醋的粗品。
[00%]雖然現(xiàn)有技術(shù)將該氨基酸序列編碼的蛋白定義為一種雙乙酷還原酶，但是根據(jù)本 領(lǐng)域公知常識，雙乙酷還原酶主要用于催化還原聯(lián)二酬，并不用于催化還原酬基，本發(fā)明首 次發(fā)現(xiàn)由該序列編碼的蛋白也是一種醇脫氨酶，并驚奇地發(fā)現(xiàn)可將其用于催化4-氯乙酷乙 酸乙醋生成重要的手性中間體(R)-4-氯-3?基下酸乙醋。因此，本發(fā)明將由該段序列編碼 的蛋白作為一種醇脫氨酶LC3應(yīng)用于生物酶法合成手性醇4-氯-3?基下酸乙醋和其他手性 醇類產(chǎn)品的生產(chǎn)中相對現(xiàn)有技術(shù)均具有創(chuàng)造性。其中，基于氧化還原反應(yīng)，在高底物(C0肥） 濃度條件下，在單水相中該醇脫氨酶LC3就已實(shí)現(xiàn)高濃度催化合成(R)-CHBE的反應(yīng)。本發(fā)明 的生物催化法單水相制備手性醇(R)-4-氯-3?基下酸乙醋，產(chǎn)量高達(dá)1.46M/L(243.2g/L)。 在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明還成功構(gòu)建了含有葡萄糖脫氨酶g化基因和醇脫氨酶lc3基因共表達(dá)的 質(zhì)粒W及含有該重組質(zhì)粒的共表達(dá)基因工程菌株。與雙菌禪合催化合成手性(R)-CH肥相 比，該共表達(dá)基因工程菌具有反應(yīng)速率快、方便、底物濃度高的特點(diǎn)。
【附圖說明】
[0029] 圖1是本發(fā)明純化的醇脫氨酶LC3的SDS-PAGE圖，其中，Μ為蛋白Marker，1為