針對hpv16e6基因的小干擾rna及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及雙鏈核糖核酸（dsRNA)，并涉及其通過RNA干擾（RNAi)作用來預(yù)防及 治療人乳頭瘤病毒16亞型（HPV16)感染所引起的相關(guān)疾病的用途，其中所述疾病例如宮頸 癌、外陰癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌癥，W及由HPV16所引起的癌前病變和生殖器巧等疾 病。
【背景技術(shù)】
[000引 1998年，An化ew Z. Fire和化aig C. Mello共同發(fā)現(xiàn)了體內(nèi)RNA干擾的作用機制， 并于2006年共同獲得了諾貝爾生理醫(yī)學獎。從而為抵抗病毒、癌癥等嚴重疾病的新一代藥 物（RNA干擾類藥物）的研發(fā)開啟了一扇大口。此RNA干擾類藥物具有作用方式新穎、作用 機制明確、祀向性強和副作用小等優(yōu)點。
[0003] 人類乳突病毒（Human Papillomavirus,簡稱HPV)，屬于乳多空病毒科乳頭瘤病毒 屬，是一種小型無包膜的病毒顆粒，呈球形，二十面體對稱，直徑約45-55nm，病毒的核必為 雙鏈DNA ;病毒衣殼由兩種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成的72個殼微粒組成。病毒DNA包含約8000堿基 對，其中包括8個早期開放讀碼框架巧1-E8)、2個晚期讀碼框架（L1和L2)和1個非編碼 長控區(qū)化CR)。在早期開放讀碼框架中，E6和E7基因?qū)毎L刺激最為重要，單獨E7編 碼的E7蛋白就可W引起宮頸上皮細胞永生化。而晚期讀碼框L1和L2基因分別編碼HPV 的主要和次要衣殼蛋白，組裝成HPV的衣殼。
[0004] HPV是世界上最流行的性傳染疾病源之一，同時也是一類重要的人類腫瘤病毒。目 前已經(jīng)鑒定超過100種HPV病毒的亞型。HPV各型之間有共同抗原，存在于L1蛋白保守區(qū) 域，送些抗原具有屬特異。依其感染的上皮所在部位：分為皮膚上皮型HPV和粘膜上皮型 HPV。
[0005] 最早確定W及最重要的HPV相關(guān)腫瘤是宮頸癌，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，是嚴重 威脅女性健康的殺手。據(jù)統(tǒng)計每年世界范圍內(nèi)約有490, 000例左右的新發(fā)病例，其中約 130, 000發(fā)生在中國，每年約有270, 000人死于該疾病，約50, 000是中國人。隨后，更發(fā)現(xiàn) 外陰癌、食管癌、乳腺癌甚至肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展都與HPV感染相關(guān)。迄今發(fā)現(xiàn)的 100多種HPV亞型中，高致癌的HPV亞型（即高危型HPV)有10多種，包括HPV16、18、31、58 等。目前認為，HPV感染對宮頸癌的發(fā)生是必要但非充分的。據(jù)研究顯示，99. 7%宮頸癌患 者存在HPV感染。
[0006] 已感染HPV的女性初期癥狀不明顯。通過基于對異常宮頸細胞組織學評估的Pap 測試W及基于核酸的PCR及雜交技術(shù)可W確定HPV的存在并確定HPV亞型。異常宮頸細胞 分級為低度鱗狀上皮內(nèi)病變化SIL)和高度鱗狀上皮內(nèi)病變化SIL)。其中LSIL包括宮頸上 皮內(nèi)瘤變一級（CINI)的細胞巧SIL包括宮頸上皮內(nèi)瘤變二級（CIN II)和Η級（CIN III) 的細胞。
[0007] 目前用于治療HPV感染的藥物及療法主要有；1、鬼白樹脂（podophyllin) ;2、 鬼白毒素 podo地パlotoxin(podofilox);3、H氯己酸（TCA)/二氯己酸度CA);4、冷凍 療法；5、手術(shù)切除；6、干擾素（IFN) ;7、咪哇莫特11]11〇11；[1]1〇(1[1-(2-1]1日1:117191'〇97；〇-1護 imidazo(4,5-quinolin-4-amine)] ;8、5-氣尿嚼巧/腎上腺素；9、無環(huán)核巧酸類似物 Cidofovir(HPMPC ： [5]-1-[3-hydroxy-2-phosphonylmethoxy-propyl]-cytosine)等等。 然而，臨床上應(yīng)用的送些抗病毒W(wǎng)及其它抗腫瘤類藥物的不但特異性不強，而且副作用大。 目前世界上沒有一種特異、高效的抑制HPV的藥物來降低甚至抑制其相關(guān)癌癥的發(fā)生和發(fā) 展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種針對HPV16E6基因的小干擾RNA。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是提供包括針對HPV16E6基因的小干擾RNA的組合物。
[0010] 本發(fā)明的第Η個目的是提供針對HPV16E6基因的小干擾RNA的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0012] 針對HPV16E6基因的小干擾RNA，該小干擾RNA分子的祀序列分離自HPV16E6基 因，其中所述祀序列為SEQ ID Ν0:2所示的序列。
[0013] 所述小干擾RNA指導細胞中存在的HPV16E6mRNA序列的剪切，從而實現(xiàn)對HPV16E6 基因表達的抑制，該小干擾RNA分子包含與SEQ ID NO: 2所示的序列互補的序列，正義鏈為 SEQ ID NO: 13所示的序列，反義鏈為SEQ ID NO: 14所示的序列。
[0014] 所述小干擾RNA中至少一個核巧酸為化學修飾的核巧酸，其中所述化學修飾為如 下修飾中的至少一種：
[0015] (1)連接核巧酸的磯酸二醋鍵的修飾；
[001引 似核糖的2'-OH的修飾；
[0017] 0)堿基的修飾。
[001引一種包含上述針對HPV16E6基因的小干擾RNA和藥學上可接受的載體組成的組合 物。
[0019] 所述藥學上可接受的載體為脂質(zhì)體或高分子聚合物。
[0020] 針對HPV16E6基因的小干擾RNA在制備抗癌藥物的應(yīng)用。
[0021] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了通過小干擾核酸分子抑制引起細胞良性和惡性增 生的HPV16E6基因表達，來預(yù)防和治療HPV16感染相關(guān)疾病的解決方案。
[0022] 在本發(fā)明的第一方面，提供了小干擾核酸分子在制備用于抑制HPV16E6基因在細 胞中表達的制劑中的應(yīng)用，所述小干擾核酸分子指導所述細胞中存在的HPV16E6mRNA序列 的剪切，從而實現(xiàn)所述的抑制。在本發(fā)明中，所述小干擾核酸分子包含正義核酸片段和反義 核酸片段，所述正義核酸片段和所述反義核酸片段含有互補區(qū)域，互補區(qū)域能形成雙鏈核 酸結(jié)構(gòu)，該雙鏈核酸能夠抑制HPV16E6基因在細胞中的表達。小干擾核酸的正義核酸片段 和反義核酸片段可W存在于兩條不同的核酸鏈上，也可W存在于同一條核酸鏈上。當正義 核酸片段和反義核酸片段分別位于兩條鏈上時，小干擾核酸的至少一條鏈具有長度為0至 6個核巧酸的3'突出端，優(yōu)選情況下兩條鏈都具有長度為2-3個核巧酸的3'突出端。當正 義核酸片段和反義核酸片段存在于同一條核酸鏈上時，優(yōu)選情況下該小干擾核酸為發(fā)夾型 單鏈核酸分子，其中正義核酸片段和反義核酸片段的互補區(qū)域形成雙鏈核酸結(jié)構(gòu)。上述小 干擾核酸分子中，正義核酸片段和反義核酸片段的長度為19至29個核巧酸，可W為19、20、 21、23、25、27和29個，優(yōu)選為19、21、25、27個核巧酸。上述小干擾核酸分子可W被直接導 入所述細胞中，也可W是將編碼該小干擾核酸分子的核巧酸序列導入所述細胞后在細胞內(nèi) 產(chǎn)生；所述細胞優(yōu)選為哺乳動物細胞，更優(yōu)選為人類細胞。上述細胞可W是離體的，如細胞 系，也可W存在于哺乳動物體中，如人體中。該人體是患有HPV感染癥狀的患者，并且所述 小干擾核酸分子被施用足夠的量W實現(xiàn)對所述癥狀的治療，所述HPV感染癥狀為子宮頸癌 或者尖銳濕巧。
[0023] 本發(fā)明第二方面提供了一種分離的HPV16E6基因小分子干擾核酸祀序列，其中所 述祀序列為HPV16E6的mRNA(cDNA)上任意連續(xù)19-30個核巧酸序列，優(yōu)選的，所述祀序列 為表1中SEQ ID NO :1-10中任意一條序列。
[0024] 在本發(fā)明的第Η方面，提供了一種小干擾核酸分子，其指導細胞中存在的 HPV16E6mRNA序列的剪切，從而實現(xiàn)對HPV16E6表達的抑制，優(yōu)選情況下該小干擾核酸分子 包含與表1中SEQ ID NO :1-10中任意一條序列互補的序列。上述小干擾核酸分子中所有 的核巧酸都可W為天然的未經(jīng)化學修飾的核巧酸，也可W至少有一個核巧酸是化學修飾的 核巧酸，化學修飾方式選自如下修飾中的至少一種：
[0025] (1)對所述小干擾核酸分子的核巧酸序列中連接核巧酸的磯酸二醋鍵的修飾；
[0026] 似對所述小干擾核酸分子的核巧酸序列中的核糖的2' -OH的修飾；
[0027] (3)對所述小干擾核酸分子的核巧酸序列中的堿基的修飾。
[0028] 本發(fā)明所述的小干擾核酸與表達HPV16E6mRNA的細胞接觸后可有效降低 HPV16E6mRNA的表達量。
[0029] 本發(fā)明最后還提供了一種包含上述任一項所述的小干擾核酸分子和藥學上可接 受的載體的組合物，