不對(duì)稱干擾rna的組合物及其用圖
【專利說明】
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年8月27日，PCT申請(qǐng)進(jìn)入國家階段日為2010年4月26 日，申請(qǐng)?zhí)枮椋?00880113236. 9,發(fā)明名稱為"不對(duì)稱干擾RNA的組合物及其用途"的專利申 請(qǐng)之分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及不對(duì)稱干擾RNA的組合物及其用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 通過使用小或短干擾RNA(siRNA)經(jīng)由RNAi (RNA干擾）實(shí)現(xiàn)基因沉默，已顯現(xiàn)為 是有力的分子生物學(xué)工具，并且具有用于治療應(yīng)用的潛力（de Fougerolles等人，2007; Kim 和 Rossi，2007)。
[0004] 理論上RNAi可以用于特異地有效地敲低（knockdown)或沉默任何疾病基因。對(duì) 于治療目的而言RNAi的可能應(yīng)用范圍是廣泛的，包括遺傳性、外遺傳性和傳染性疾病，條 件是致病基因得到鑒定。
[0005] 然而，除突出的遞送問題外，基于RNAi藥物的開發(fā)還面臨著如下問題：siRNA的有 限功效、siRNA的非特異性作用例如干擾素樣應(yīng)答和有義鏈介導(dǎo)的脫靶基因沉默、以及與 siRNA合成相關(guān)的高得驚人的或高昂的成本。siRNA的基因沉默功效，對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 的大多數(shù)基因，局限在50%或更低。這些分子的制造是昂貴的（比制造反義脫氧核苷酸昂 貴得多）、低效的，并且需要化學(xué)修飾。最后，觀察到合成siRNAs的細(xì)胞外施用可能觸發(fā)干 擾素樣應(yīng)答，這為基于RNAi的研究和基于RNAi的治療開發(fā)增加了顯著的障礙。
[0006] RNAi可以通過合成的短干擾RNA(SiRNAs)、或編碼隨后可以被核糖核酸酶III樣 酶Dicer切割成siRNA的短發(fā)夾RNAs (shRNAs)的遺傳元件觸發(fā)。基因沉默的生化機(jī)制仍 未完全了解，看起來涉及多蛋白的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC)。RISC結(jié)合、展開且并入反 義siRNA鏈，隨后其識(shí)別并靶向完全互補(bǔ)的mRNA進(jìn)行切割，從而減少基因表達(dá)。有效的基 因沉默（1-10天）可歸因于RISC復(fù)合物的催化性質(zhì)。RNAi的力量源于能夠達(dá)到的精致特 異性。然而，已知會(huì)發(fā)生脫靶RNAi效應(yīng)。另一主要副作用是由siRNA激活的干擾素樣應(yīng) 答，其由dsRNA依賴性蛋白質(zhì)激酶（PKR)和Toll樣受體（TLR)介導(dǎo)。siRNA誘導(dǎo)干擾素樣 應(yīng)答的能力主要由其長度決定。（同上）。
[0007] 對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因沉默，現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)siRNA的結(jié)構(gòu)可以是19-21個(gè)核 苷酸長度和在2個(gè)末端上具有3'突出端的對(duì)稱雙鏈RNA，以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效，并且 避免細(xì)胞先天"抗病毒"應(yīng)答。（同上）。目前本領(lǐng)域已經(jīng)充分確立，這種"最佳"結(jié)構(gòu)仍會(huì) 觸發(fā)干擾素應(yīng)答，對(duì)基于RNAi的研究和基于RNAi的治療開發(fā)構(gòu)成顯著障礙（Sledz等人， 2003)〇
[0008] 需要通過新設(shè)計(jì)siRNAs開發(fā)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效RNAi的新方法，所述 siRNAs具有更佳功效和效力、作用啟動(dòng)快速、更佳持久和具有更短長度的RNA雙鏈體，以避 免非特異性干擾素樣應(yīng)答和減少用于RNAi治療劑的研究和藥物開發(fā)的合成成本。
[0009] 本文引用的參考文獻(xiàn)不應(yīng)視為承認(rèn)是請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明涉及新類型的小雙鏈體RNA的令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，此新類型的小雙鏈體RNA 可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)有效的基因沉默，其在本文中稱為不對(duì)稱干擾RNA (aiRNA)。這 種新類型的RNAi誘導(dǎo)物的標(biāo)志是2條RNA鏈的長度不對(duì)稱。此種新的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)不僅在實(shí) 現(xiàn)基因沉默方面是功能上有效的，而且提供了優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)siRNAs的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。在這些優(yōu) 點(diǎn)中，aiRNA可以具有比現(xiàn)有siRNA長度短得多的RNA雙鏈體結(jié)構(gòu)，這將減少合成成本且消 除/減少長度依賴性的非特異性干擾素樣應(yīng)答的觸發(fā)。此外，aiRNA結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱還消除/ 減少有義鏈介導(dǎo)的脫靶效應(yīng)。此外，aiRNA在誘導(dǎo)基因沉默方面比siRNA更有效、有力、快 速開始和持久。aiRNA可以用于目前siRNA或shRNA正在應(yīng)用或考慮應(yīng)用的所有領(lǐng)域，包括 生物學(xué)研究、生物技術(shù)和醫(yī)藥工業(yè)中的R&D研究、和基于RNAi的治療。
[0011] 本發(fā)明提供雙鏈體RNA分子。該雙鏈體RNA分子包括具有18-23個(gè)核苷酸長度的 第一鏈和具有12-17個(gè)核苷酸長度的第二鏈，其中第二鏈與第一鏈基本上互補(bǔ)，并且與第 一鏈形成雙鏈區(qū)，其中第一鏈具有1-9個(gè)核苷酸的3' -突出端、和0-8個(gè)核苷酸的5' -突出 端，其中所述雙鏈體RNA分子能夠在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)選擇性基因沉默。在一個(gè)實(shí)施方案中， 第一鏈包含與靶mRNA序列基本上互補(bǔ)的序列。在再一實(shí)施方案中，第一鏈包含與靶mRNA 序列至少70 %互補(bǔ)的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞或禽類細(xì)胞。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中，5'突出端的序列的至少一個(gè)核苷酸選自A、U和dT。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈區(qū)的GC含量是20% -70%。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈具有19-22個(gè)核苷酸的長度。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈具有21個(gè)核苷酸的長度。在再一實(shí)施方案中，第二鏈 具有14-16個(gè)核苷酸的長度。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈具有21個(gè)核苷酸的長度，并且第二鏈具有15個(gè)核苷酸 的長度。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第一鏈具有2-4個(gè)核苷酸的3'-突出端。在一個(gè)更 進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第一鏈具有3個(gè)核苷酸的3' -突出端。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈體RNA分子包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸或其類似物。 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸或其類似物是糖、主鏈和/或堿 基經(jīng)修飾的核糖核苷酸。在一個(gè)更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，主鏈經(jīng)修飾的核糖核苷酸在與另 一個(gè)核糖核苷酸的磷酸二酯鍵連接中具有修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，磷酸二酯鍵經(jīng)修飾而 包括氮或硫雜原子中的至少一種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類似物是包含硫代磷酸酯 基團(tuán)的主鏈經(jīng)修飾的核糖核苷酸。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸或其類似物是稀有堿基或經(jīng)修飾的 堿基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸或其類似物包括肌苷或三苯甲基化 喊基。
[0019] 在再一實(shí)施方案中，核苷酸類似物是糖經(jīng)修飾的核糖核苷酸，其中2' -OH基團(tuán)由 選自H、OR、R、鹵素、SH、SR、NH2、NHR、NR2S CN的基團(tuán)替代，其中每個(gè)R獨(dú)立地是C1-C6烷 基、鏈烯基或炔基，并且鹵素是F、C1、Br或I。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈包括至少一個(gè)脫氧核苷酸。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案 中，該至少一個(gè)脫氧核苷酸在選自3'-突出端、5'-突出端和雙鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二鏈包括至少一個(gè)脫氧核苷酸。
[0021] 本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)細(xì)胞或生物中的基因表達(dá)的方法，其包括步驟：在可以發(fā)生 選擇性基因沉默的條件下，使所述細(xì)胞或生物與權(quán)利要求1的雙鏈體RNA分子接觸，和通過 該雙鏈體RNA分子介導(dǎo)針對(duì)與該雙鏈RNA具有基本上對(duì)應(yīng)的序列部分的靶基因或核酸的 選擇性基因沉默。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述接觸步驟包括步驟：將所述雙鏈體RNA 分子引入培養(yǎng)中的或生物體中的靶細(xì)胞內(nèi)，在所述靶細(xì)胞中可以發(fā)生選擇性基因沉默。在 一個(gè)更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，引入步驟選自轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔、感染、注射、經(jīng)口施用、吸 入、局部和區(qū)域施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，引入步驟包括使用藥學(xué)上可接受的賦形劑、載 體或稀釋劑，其選自藥學(xué)載體、正電荷載體、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)載體、聚合物、納米顆粒、納米乳 液（nanoemulsion)、脂質(zhì)和類脂（lipoid)。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該調(diào)節(jié)方法用于確定基因在細(xì)胞或生物中的功能或用途。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該調(diào)節(jié)方法用于治療或預(yù)防疾病或非期望的狀況。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施方案中，靶基因與哺乳動(dòng)物中的疾病、病理狀況或非期望的狀況相關(guān)。 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，靶基因是致病微生物的基因。在一個(gè)更進(jìn)一步的實(shí)施方案中， 靶基因是病毒基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶基因是腫瘤相關(guān)基因。在另外一個(gè)實(shí)施方案 中，靶基因是與選自下述的疾病相關(guān)的基因：自身免疫疾病、炎性疾病、退行性疾病、感染性 疾病、增生性疾病、代謝疾病、免疫介導(dǎo)的病癥、變應(yīng)性疾病、皮膚病學(xué)疾病、惡性疾病、胃腸 道病癥、呼吸病癥、心血管病癥、腎病癥、類風(fēng)濕性病癥、神經(jīng)學(xué)病癥、內(nèi)分泌紊亂和衰老。
[0025] 本發(fā)明提供了研究試劑。該試劑包括雙鏈體RNA分子。
[0026] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了試劑盒。該試劑盒包括具有18-23個(gè)核苷酸長度的第一 RNA 鏈和具有12-17個(gè)核苷酸長度的第二RNA鏈，其中第二鏈與第一鏈基本上互補(bǔ)，并且能夠 與第一鏈形成雙鏈體RNA分子，其中雙鏈體RNA分子具有1-9個(gè)核苷酸的3' -突出端、和 0-8個(gè)核苷酸的5' -突出端，其中所述雙鏈體RNA分子能夠在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)序列特異性基 因沉默。
[0027] 本發(fā)明還提供了制備雙鏈體RNA分子的方法。該方法包括步驟：合成第一鏈和第 二鏈，在形成能夠?qū)崿F(xiàn)序列特異性基因沉默的雙鏈體RNA分子的條件下，組合所合成的鏈。 在一個(gè)實(shí)施方案中，權(quán)利要求35的方法還包括在合成步驟過程中、在合成后且在組合步驟 前、或在組合步驟后，將至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸或其類似物引入雙鏈體RNA分子內(nèi)的步 驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述RNA鏈?zhǔn)腔瘜W(xué)合成的或生物合成的。
[0028] 本發(fā)明提供表達(dá)載體。該載體包括與至少一個(gè)表達(dá)控制序列可操作地連接的編碼 雙鏈體RNA分子的一個(gè)或多個(gè)核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體包括與第一表達(dá)控制序列 可操作地連接的編碼第一鏈的第一核酸、和與第二表達(dá)控制序列可操作地連接的編碼第二 鏈的第二核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該載體是病毒、真核或細(xì)菌表達(dá)載體。
[0029] 本發(fā)明還提供細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞包括載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 該細(xì)胞包括雙鏈體RNA分子。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該細(xì)胞是哺乳動(dòng)物、禽類或細(xì)菌 細(xì)胞。
[0030] 本發(fā)明提供雙鏈體RNA分子。該雙鏈體RNA分子包括第一鏈和第二鏈，其中第一 鏈長于第二鏈，其中第二鏈與第一鏈基本上互補(bǔ)，并且與第一鏈形成雙鏈區(qū)，其中所述雙鏈 體RNA分子能夠在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)選擇性基因沉默。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈體RNA分子 的2個(gè)末端獨(dú)立地選自1-10個(gè)核苷酸的3' -突出端、0-10個(gè)核苷酸的5' -突出端和平頭末 端。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈與靶mRNA序列基本上互補(bǔ)。在一個(gè)備選實(shí)施方案中，第二 鏈與靶mRNA序列基本上互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞或禽類細(xì)胞。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈體RNA分子是分離的雙鏈體RNA分子。
[0031] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈具有1-8個(gè)核苷酸的3'-突出端、和1-8個(gè)核苷酸的 5'-突出端。
[0032] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈具有1-10個(gè)核苷酸的3' -突出端和平頭末端。
[0033] 在另外一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈具有1-10個(gè)核苷酸的5' -突出端和平頭末端。
[0034] 在一個(gè)備選實(shí)施方案中，RNA雙鏈體具有兩個(gè)1-8個(gè)核苷酸的5' -突出端、或兩個(gè) 1-10個(gè)核苷酸的3'-突出端。
[0035] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈具有12-100個(gè)核苷酸、12-30個(gè)核苷酸、18-23個(gè)核苷 酸、19-25個(gè)核苷酸的長度。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第一鏈具有21個(gè)核苷酸的長度。
[0036] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二鏈具有5-30個(gè)核苷酸、12-22個(gè)核苷酸、12-17個(gè)核苷 酸的長度。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第二鏈具有15個(gè)核苷酸的長度。
[0037] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈具有12-30個(gè)核苷酸的長度，并且第二鏈具有10-29個(gè) 核苷酸的長度，條件是當(dāng)雙鏈區(qū)是27bp時(shí)，RNA分子的2個(gè)末端獨(dú)立地是3'突出端或5' 突出端。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第一鏈具有18-23個(gè)核苷酸的長度，并且第二鏈具有 12-17個(gè)核苷酸的長度。
[0038] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈具有19-25個(gè)核苷酸的長度，并且第二鏈具有12-17 個(gè)核苷酸的長度。
[0039] 在一個(gè)備選實(shí)施方案中，第一鏈具有19-25個(gè)核苷酸的長度，并且第二鏈具有 18-24個(gè)核苷酸的長度，
[0040] 條件是當(dāng)?shù)谝绘準(zhǔn)?br>[0041] 5' -UUCGAAGUAUUCCGCGUACGU(SEQ ID N0:1)
[0042] 5' -UCGAAGUAUUCCGCGUACGUG(SEQ ID N0:2)或
[0043] 5' -CGAAGUAUUCCGCGUACGUGA(SEQ ID N0:3)時(shí)
[0044] 第二鏈具有至多17個(gè)核苷酸的長度，或包含至少一個(gè)與第一鏈的錯(cuò)配，或包含至 少一個(gè)修飾。
[0045] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈具有21個(gè)核苷酸的長度，并且第二鏈具有12-17個(gè)核 苷酸、或14-16個(gè)核苷酸的長度。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈比第二鏈長1-10個(gè)核苷酸。
[0047] 在一個(gè)實(shí)施方案中，3' -突出端具有2-6個(gè)核苷酸的長度。
[0048] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，5' -突出端具有0-5個(gè)核苷酸的長度。
[0049] 在一個(gè)實(shí)施方案中，基因沉默包括RNA干擾、翻譯調(diào)節(jié)和DNA外遺傳調(diào)節(jié)中的一種 或兩種或全部。
[0050] 在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈體RNA分子還在所述第一鏈和第二鏈的至少一個(gè)中包括 切口。
[0051] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺口。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施方案中，5'突出端的至少一個(gè)核苷酸與革ElmRNA序列不互補(bǔ)。
[0053] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，5'突出端的至少一個(gè)核苷酸選自A、U和dT。
[0054] 在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈體RNA分子與選自肽、抗體、聚合物、脂質(zhì)、寡核苷酸、膽 固醇和適體（aptamer)的實(shí)體綴合。
[0055] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該RNA分子還包括至少一個(gè)未配對(duì)的或錯(cuò)配的核苷酸。
[0056] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈區(qū)的GC含量是20-70%。
[0057] 在一個(gè)實(shí)施方案中，3' -突出端和/或5' -突出端被穩(wěn)定化以抵抗降解。
[0058] 在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈體RNA分子包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸或其類似物。 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸或其類似物是糖、主鏈和/或堿 基經(jīng)修飾的核糖核苷酸。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，主鏈經(jīng)修飾的核糖核苷酸在與另一 個(gè)核糖核苷酸的磷酸二酯鍵連接中具有修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，磷酸二酯鍵經(jīng)修飾而 包括氮或硫雜原子中的至少一種。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類似物是包含硫代磷酸 酯基團(tuán)的主鏈經(jīng)修飾的核糖核苷酸。
[0059] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸或其類似物包括非天然堿基或經(jīng) 修飾的堿基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸或其類似物包括肌苷或三 苯甲基化堿基。
[0060] 在再一實(shí)施方案中，核苷酸類似物是糖經(jīng)修飾的核糖核苷酸，其中2' -OH基團(tuán)由 選自H、OR、R、鹵素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基團(tuán)替代，其中每個(gè)R獨(dú)立地是C1-C6烷 基、鏈烯基或炔基，并且鹵素是F、C1、Br或I。
[0061] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈包括至少一個(gè)脫氧核苷酸。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案 中，該至少一個(gè)脫氧核苷酸在選自3'-突出端、5'-突出端和靠近第一鏈的5'末端的雙鏈區(qū) 的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二鏈包括至少一個(gè)脫氧核苷酸。
[0062] 本發(fā)明還提供調(diào)節(jié)細(xì)胞或生物中的基因表達(dá)的方法。該方法包括步驟：在可以發(fā) 生選擇性基因沉默的條件下，使所述細(xì)胞或生物與權(quán)利要求1的雙鏈體RNA分子接觸，和由 該雙鏈RNA分子介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)針對(duì)與該雙鏈RNA具有基本上對(duì)應(yīng)的序列部分的靶核酸的選擇性 基因沉默。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述接觸包括步驟：將所述雙鏈體RNA分子引入 培養(yǎng)中的或生物體中的靶細(xì)胞內(nèi)，在所述靶細(xì)胞中選擇性基因沉默可以發(fā)生。在一個(gè)更進(jìn) 一步的實(shí)施方案中，引入步驟選自轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔、感染、注射、經(jīng)口施用、吸入、局部 和區(qū)域施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，引入步驟包括使用藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋 劑，其選自藥學(xué)載體、正電荷載體、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)載體、聚合物、納米顆粒、納米乳液、脂質(zhì) 和類脂。在一個(gè)實(shí)施方案中，該調(diào)節(jié)方法用于調(diào)芐基因在細(xì)胞或生物中的表達(dá)。
[0063] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，該調(diào)節(jié)方法用于治療或預(yù)防疾病或非期望狀況。
[0064] 在一個(gè)實(shí)施方案中，靶基因是與人或動(dòng)物疾病相關(guān)的基因。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施 方案中，靶基因是致病微生物的基因。在一個(gè)更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，靶基因是病毒基因。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶基因是腫瘤相關(guān)基因。
[0065] 在另外一個(gè)實(shí)施方案中，靶基因是與選自下述的疾病相關(guān)的基因：自身免疫疾病、 炎性疾病、退行性疾病、感染性疾病、增生性疾病、代謝疾病、免疫介導(dǎo)的病癥、變應(yīng)性疾病、 皮膚病學(xué)疾病、惡性疾病、胃腸道病癥、呼吸病癥、心血管病癥、腎病癥、類風(fēng)濕性病癥、神經(jīng) 學(xué)病癥、內(nèi)分泌紊亂和衰老。
[0066] 該調(diào)節(jié)方法還可以用于在體外或體內(nèi)研究藥物靶標(biāo)。
[0067] 本發(fā)明提供包括雙鏈體RNA分子的試劑。
[0068] 本發(fā)明還提供試劑盒。該試劑盒包括第一 RNA鏈和第二RNA鏈，其中第一鏈長于 第二鏈，其中第二鏈與第一鏈基本上互補(bǔ)，并且能夠與第一鏈形成雙鏈體RNA分子，其中 所述雙鏈體RNA分子能夠在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)序列特異性基因沉默。
[0069] 本發(fā)明還提供制備權(quán)利要求1的雙鏈體RNA分子的方法，其包括步驟：合成第一鏈 和第二鏈，和在形成能夠?qū)崿F(xiàn)序列特異性基因沉默的雙鏈體RNA分子的條件下，組合所合 成的鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，RNA鏈?zhǔn)腔瘜W(xué)合成的或生物合成的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第 一鏈和第二鏈?zhǔn)欠珠_或同時(shí)合成的。
[0070] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在合成步驟過程中、在合成后且在組合步 驟前、或在組合步驟后，將至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸或其類似物引入雙鏈體RNA分子內(nèi)的 步驟。
[0071] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了藥物組合物。該藥物組合物包括至少一種雙鏈體RNA分子作 為活性劑和一種或多種載體，所述載體選自藥學(xué)載體、正電荷載體、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)載體、聚 合物、納米顆粒、膽固醇、脂質(zhì)和類脂。
[0072] 本發(fā)明還提供治療方法。該方法包括給有需要的受試者施用有效量的藥物組合 物。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物經(jīng)由選自iv、sc、吸入、局部、PO和區(qū)域施用的途徑進(jìn)行 施用。
[0073] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈包括與基因的靶mRNA序列基本上互補(bǔ)的序列，所述基 因選自：發(fā)育基因，癌基因，腫瘤抑制基因和酶基因，以及粘附分子、細(xì)胞周期蛋白激酶抑 制劑、Wnt家族成員、Pax家族成員、Winged螺旋家族成員、Hox家族成員、細(xì)胞因子/淋 巴因子或其受體、生長/分化因子或其受體、神經(jīng)遞質(zhì)或其受體、激酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的基 因，病毒基因，感染性疾病的基因、ABLI、BCL1、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、 EBRB2, ETSl、ETSl、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、 MYC, MYCL1、MYCN、NRAS、P頂1、PML、RET、SRC、TALI、TCL3 和 YES、APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、 MCC, NF1、NF2, RB1、TP53、WT1、ACP去飽和酶或羥化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、醇脫 氫酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、過氧化氫酶、纖維素酶、環(huán)加氧酶、脫羧酶、糊精酶、DNA或RNA 聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纖維素酶、整合酶、轉(zhuǎn)化 酶、異構(gòu)酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、果膠酯酶、過氧化物酶、磷酸酶、磷脂 酶、磷酸化酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白水解酶或肽酶、普魯蘭酶、重組酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、拓?fù)洚悩?gòu) 酶、木聚糖酶、k-RAS、β -聯(lián)蛋白（β-catenin)、1^1^1、？〇熟、卩70361(、存活蛋白（3111^;^;[11)、 mTOR、PTEN、Parpl 或 p21 的基因。
[0074] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈體RNA分子選自
[0075]
[


[0078] 其中A、U、G和C是核苷酸，而a、t、g和c是脫氧核苷酸。
[0079] 本發(fā)明提供修飾第一雙鏈體RNA分子的方法，所述雙鏈體RNA分子具有形成雙鏈 區(qū)的反義鏈和有義鏈。該方法包括：縮短有義鏈的長度，從而使得反義鏈具有1-8個(gè)核苷酸 的3' -突出端和0-8個(gè)核苷酸的5' -突出端，和形成第二雙鏈體RNA分子；其中第一雙鏈體 RNA分子的至少一種性質(zhì)得到改善。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述性質(zhì)選自大小、功效、效力、開 始的速度、持久性、合成成本、脫靶效應(yīng)、干擾素應(yīng)答和遞送。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法 進(jìn)一步包括在形成第二雙鏈體RNA分子的條件下組合反義鏈和縮短的有義鏈。在一個(gè)進(jìn)一 步的實(shí)施方案中，第一雙鏈體RNA分子是siRNA、或dicer-底物siRNA、或siRNA前體。
[0080] 本發(fā)明提供表達(dá)載體。該載體包括與至少一個(gè)表達(dá)控制序列可操作地連接的編碼 權(quán)利要求1的雙鏈體RNA分子的一個(gè)或多個(gè)核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該表達(dá)載體包括與 第一表達(dá)控制序列可操作地連接的編碼第一鏈的第一核酸、和與第二表達(dá)控制序列可操作 地連接的編碼第二鏈的第二核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該表達(dá)載體是病毒、真核表達(dá)載體 或細(xì)菌表達(dá)載體。
[0081] 本發(fā)明還提供細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞包括表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，該細(xì)胞包括雙鏈體RNA分子。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞、禽類 細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。
[0082] 從本文提供的其它描述，包括不同實(shí)施例，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易 見的。所提供的實(shí)施例舉例說明在實(shí)踐本發(fā)明中有用的不同組分和方法。實(shí)施例不限制請(qǐng) 求保護(hù)的本發(fā)明?；诒竟_內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以鑒定和采用對(duì)于實(shí)踐本發(fā)明有用 的其他組分和方法。
【附圖說明】
[0083] 圖IA顯示在第一鏈上具有3' -突出端和5' -突出端的雙鏈體RNA分子結(jié)構(gòu)。
[0084] 圖IB顯示在第一鏈上具有3' -突出端和5' -突出端以及在雙鏈體中具有切口的 雙鏈體RNA分子的結(jié)構(gòu)。
[0085] 圖IC顯示在第一鏈上具有3'-突出端和5'-突出端以及在第二鏈中具有缺口的 雙鏈體RNA分子的結(jié)構(gòu)。
[0086] 圖2A顯示具有一個(gè)平頭末端和在第一鏈上的5' -突出端的雙鏈體RNA分子的結(jié) 構(gòu)。
[0087] 圖2B顯示具有一個(gè)平頭末端和在第一鏈上的3' -突出端的雙鏈體RNA分子的結(jié) 構(gòu)。
[0088] 圖2C顯示在雙鏈體的2個(gè)末端上均具有3' -突出端并且第一鏈長于第二鏈的雙 鏈體RNA分子的結(jié)構(gòu)。
[0089] 圖2D顯示在雙鏈體的2個(gè)末端上均具有5' -突出端并且第一鏈長于第二鏈的雙 鏈體RNA分子的結(jié)構(gòu)。
[0090] 圖3顯示通過aiRNA(不對(duì)稱干擾RNAs)誘導(dǎo)的β -聯(lián)蛋白的基因沉默。
[0091] 圖3Α顯示寡聚物的驗(yàn)證。在退火后，寡聚物通過20%聚丙烯酰胺凝膠加以證實(shí)。 泳道 1，21nt/21nt ;泳道 2,12nt (a) /21nt ;泳道 3,12nt (b) /21nt ;泳道 4,13nt/13nt ;泳 道 5,13nt/21nt ;泳道 6,14nt/14nt ;泳道 7,14nt (a) /21nt ;泳道 8,14nt (b) /21nt ;泳道 9， 15nt/15nt ;泳道 10,15nt/21nt〇
[0092] 圖3B顯示寡聚物在基因沉默中的作用。HeLa細(xì)胞以200, 000細(xì)胞/孔接種到6 孔培養(yǎng)板內(nèi)。24小時(shí)后，它們用scramble siRNA(泳道1)、靶向E2F1的21-bp siRNA(泳 道2,作為特異性的對(duì)照）或靶向β-聯(lián)蛋白的21-bp SiRNA(泳道3,作為陽性對(duì)照）、 或相同濃度的不同長度混合的aiRNA :12nt(a)/21nt (泳道4) ;12nt(b)/21