一種提取核酸的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種提取核酸的方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為攜帶遺傳信息的重要物質(zhì)，核酸通常存在于復(fù)雜的實(shí)際樣品中，例如血液，細(xì) 胞，糞便，樹(shù)葉等等。這些樣品中的核酸通常無(wú)法直接被用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)，需要 進(jìn)一步的純化以去除干擾物質(zhì)才能進(jìn)行下游的一些實(shí)驗(yàn)和分析。
[0003] 分離提取核酸的方法在文獻(xiàn)中多有報(bào)道（e.g.Chapter2(DNA)andChapter4 (RNA)ofF.Ausubeletal.,eds.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,ffiley-Interscience,NewYork, 1993)。這些方法通常需要將樣品在一定溶液中重懸并通過(guò)化學(xué) 試劑或者酶的方法將細(xì)胞破裂，將核酸釋放出來(lái)。這一過(guò)程稱為裂解。釋放出的核酸在溶液 中會(huì)可逆的結(jié)合于吸附核酸的材料上。這些材料包括玻璃顆粒，玻璃纖維，磁珠，硅藻土，硅 膠等，或者以上各種材料的變化或組合。高濃度的離液鹽將有利于核酸結(jié)合到上述材料上。 在接下來(lái)的步驟中，通過(guò)離心或者加入磁場(chǎng)等外界作用力，收集這些結(jié)合核酸的材料。這些 結(jié)合核酸的材料接下來(lái)會(huì)被特定溶液洗滌，例如80%乙醇，以去除雜質(zhì)。最后這些結(jié)合核酸 的材料會(huì)被洗脫液處理并將核酸洗脫下來(lái)，一般是加熱至60度并以重蒸水進(jìn)行洗脫。以此 原理為基礎(chǔ)，研究者報(bào)道了大量的提取核酸的方法。（e.g.US5,075,430;Markoetal.， Anal.Biochem.121,382-387,1982；Vogelsteinetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76, 615-619,1979；Boometal.,J.Clin.Microbiol.28,495-503,1990；ChenandThomas, Anal.Biochem. 101，339-341，1980)。但是，目前的核酸提取方法在經(jīng)過(guò)洗脫后所獲得的核 酸分子的量仍然不夠理想，需要進(jìn)一步改進(jìn)。
[0004] 另外，在實(shí)際應(yīng)用中，隨著時(shí)間的推移，洗脫下來(lái)的核酸并不能穩(wěn)定保存。這樣，通 過(guò)上述方法提取的核酸分子如果不能馬上進(jìn)行下游的分析實(shí)驗(yàn)，而是存放起來(lái)的話，核酸 分子就存在著不穩(wěn)定的風(fēng)險(xiǎn)，也不利于下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)在以后實(shí)驗(yàn)中的重復(fù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種提取核酸的方法及基于所述方法的試劑 盒，使得所述方法能夠提取更多量的核酸分子；
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種提取核酸的方法及基于所述方法的試劑盒，使 得所述方法提取的核酸分子在4度條件下保存20天后仍能成功擴(kuò)增并有效分型。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0008] -種提取核酸的方法，包括：
[0009] 步驟1、向待提取樣品中加入裂解液裂解解釋放核酸分子，然后加入吸附核酸的材 料以及結(jié)合液對(duì)核酸分子進(jìn)行吸附，獲得核酸-吸附材料復(fù)合物；
[0010]步驟2、將核酸-吸附材料復(fù)合物洗滌后，用含有表面活性劑的水溶液作為洗脫液 進(jìn)行洗脫，收集洗脫下來(lái)的溶液，獲得目標(biāo)核酸分子。
[0011] 為了能夠獲得更多量的核酸分子，本發(fā)明在洗脫液中增加了表面活性劑，一方面 有利于提高洗脫的得率，獲得更多量的核酸分子；另一方面表面活性劑也有利于提取后的 核酸長(zhǎng)久保存而不被吸附在管壁或者被核酸酶降解。
[0012] 其中，作為優(yōu)選，所述表面活性劑為離子型表面活性劑或非離子型表面活性劑。進(jìn) 一步優(yōu)選地，所述離子型表面活性劑為陰離子表面活性劑;更進(jìn)一步優(yōu)選，所述陰離子表面 活性劑為SDS，所述非離子型表面活性劑為TritonX-100。
[0013] 作為優(yōu)選，所述洗脫液中表面活性劑的質(zhì)量百分比濃度為0.1-1%，在本發(fā)明的一 些實(shí)施方式中，所述洗脫液為包含SDS的重蒸水，SDS濃度可以為0.1 %、0.5%或1 %，或者洗 脫液為包含TritonX-100的重蒸水，TritonX-100濃度為0 · 1 %。
[0014] 對(duì)于本發(fā)明所采用的裂解液、核酸吸附材料以及結(jié)合液(也稱為裂解結(jié)合液），本 領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)現(xiàn)有的提取方法進(jìn)行選擇并根據(jù)所提取的核酸種類以及所選擇的試 劑確定合適的加入量，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是可以實(shí)現(xiàn)的。
[0015] 在本領(lǐng)域中，所述裂解液一般為離液試劑、蛋白酶、堿、表面活性劑，可以采用其中 一種或兩種以上對(duì)樣品進(jìn)行裂解。而其中的離液試劑主要是離液鹽或其組合。離液試劑指 的是通過(guò)其水溶液能夠破壞其他分子主要指生物大分子(例如核酸和蛋白質(zhì)）的氫鍵從而 影響其穩(wěn)定性的試劑。在高濃度的離液試劑中，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)通常被破壞但其一級(jí)結(jié) 構(gòu)仍然保持。本發(fā)明給出了更加優(yōu)選的裂解液方案，為離液試劑和蛋白酶。其中蛋白酶優(yōu)選 蛋白酶K。而離液試劑優(yōu)選為鹽酸胍，異硫氰酸胍，碘化鈉，尿素中的一種或兩種以上。進(jìn)一 步優(yōu)選地，所述裂解液為異硫氰酸胍和蛋白酶K，濃度為25ηιΜ/μ1異硫氰酸胍，1.5yg/yl蛋白 酶K，以此增強(qiáng)裂解細(xì)胞的效果，釋放更多核酸分子。
[0016] 本發(fā)明所述核酸的吸附材料指的是能在一定的液體環(huán)境中，與核酸相互作用，能 可逆的形成核酸-吸附材料復(fù)合物的材料。吸附核酸的材料在吸附的溶液環(huán)境中是固態(tài)的， 常常以顆粒，粉末，纖維或者薄膜的形式出現(xiàn)。常見(jiàn)的吸附核酸的材料包括但不限于硅珠， 磁珠，娃藻土等，其中廣泛使用的是磁珠，通過(guò)對(duì)磁性顆粒進(jìn)行一定的包被(如娃基、氨基、 羧基等），形成磁珠，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的高通量、自動(dòng)化提取。這一技術(shù)產(chǎn)生于20世紀(jì)80 年代，已經(jīng)有了成熟的試劑盒并形成為產(chǎn)業(yè)。磁性顆粒的內(nèi)核通常由T-Fe203或者Fe304等 材料組成。
[0017] 在結(jié)合液存在的情況下，核酸將更有利于被吸附至吸附核酸的材料上，形成核酸-吸附材料復(fù)合物。本發(fā)明給出包含離液試劑的結(jié)合液選擇方案，更加優(yōu)選的結(jié)合液方案為 離液試劑和異丙醇，離液試劑采用上述優(yōu)選方案。更加優(yōu)選的為異硫氰酸胍和異丙醇，濃度 為4000πιΜ/μ1異硫氰酸胍，10 %異丙醇。
[0018] 本發(fā)明所述核酸是指由許多核苷酸聚合而成的生物大分子，它是一種極為重要的 生命物質(zhì)。核酸廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞，微生物體內(nèi)。根據(jù)化學(xué)組成，核酸主要分為脫氧核 糖核酸(DNA)與核糖核酸(RNA)兩種，而本發(fā)明所述核酸分子也指DNA、RNA或兩者的混合。
[0019] 作為優(yōu)選，所述洗滌采用乙醇洗滌，乙醇的濃度為30-100%，在本發(fā)明的具體實(shí)施 方式中采用80 %乙醇進(jìn)行洗滌。
[0020] 作為優(yōu)選，所述洗脫在50-70°C下洗脫5-20min，更優(yōu)選為在65°C下洗脫lOmin。
[0021] 采用相同樣品分別按照本發(fā)明方法和現(xiàn)有方法提取DNA，并通過(guò)熒光定量PCR反應(yīng) 檢測(cè)Ct平均值，結(jié)果顯示，在本發(fā)明方法下Ct平均值小于現(xiàn)有方法，這表明通過(guò)本發(fā)明方法 能提取出更多量的DNA。
[0022] 同時(shí)將相同DNA分別處于本發(fā)明洗脫液和重蒸水中在4°C下保存20天，然后進(jìn)行毛 細(xì)管凝膠電泳，結(jié)果顯示，在本發(fā)明洗脫液中的多個(gè)DNA樣品全部能夠擴(kuò)增，且可以有效分 型，而重蒸水中的多個(gè)DNA樣品不能全部擴(kuò)增，且出峰不完全。
[0023] 基于上述技術(shù)效果，本發(fā)明同時(shí)提供了一種提取核酸的試劑盒，包括：
[0024] 離液試劑、結(jié)合液、核酸吸附材料和洗脫液，所述洗脫液為包含表面活性劑。
[0025] 其中，作為優(yōu)選，所述表面活性劑為離子型表面活性劑或非離子型表面活性劑。進(jìn) 一步優(yōu)選地，所述離子型表面活性劑為陰離子表面活性劑;更進(jìn)一步優(yōu)選，所述陰離子表面 活性劑為SDS，所述非離子型表面活性劑為TritonX-100。
[0026] 作為優(yōu)選，所述洗脫液中表面活性劑的質(zhì)量百分比濃度為0.1-1%。
[0027] 作為優(yōu)選，所述裂解液為離液試劑、蛋白酶、堿、表面活性劑中的一種或兩種以上。 進(jìn)一步優(yōu)選為離液試劑和蛋白酶。最優(yōu)選地，所述裂解液為異硫氰酸胍和蛋白酶K
[0028] 作為優(yōu)選，所述結(jié)合液為離液試劑和異丙醇。
[0029] 作為優(yōu)選，所述離液試劑為鹽酸胍，異硫氰酸胍，碘化鈉，尿素中的一種或兩種以 上。
[0030] 作為優(yōu)選，所述吸附核酸的材料為硅珠，磁珠，硅藻土或硅膠。
[0031] 在本發(fā)明所述試劑盒中，可以將上述各種試劑配制成各種濃度規(guī)格的溶液，只需 在使用時(shí)進(jìn)行調(diào)配即可。
[0032] 由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有提取核酸的方法的缺陷，在洗脫環(huán)節(jié)中將 表面活性劑加入到洗脫液中，進(jìn)而提高了洗脫核酸的得率，獲得更多量的核酸分子，同時(shí)提 取后的核酸長(zhǎng)久保存而不被吸附在管壁或者被核酸酶降解，眼饞了核酸分子的保存時(shí)間。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1所示為采用不同洗脫液提取的DNA的熒光定量PCR擴(kuò)增圖；
[0034] 圖2所示為本發(fā)明洗脫液下保存的DNA的毛細(xì)管凝膠電泳圖；
[0035]圖3所示為重蒸水下保存的DNA的毛細(xì)管凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種提取核酸的方法及試劑盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本 文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù) 人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法和試劑盒已經(jīng)通過(guò)較 佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的 產(chǎn)品及方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0037] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種提取核酸的方法及 試劑盒進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0038] 實(shí)施例1:本發(fā)明所述提取方法以及對(duì)比試驗(yàn)
[0039]取5ul的新鮮的人血液，滴在濾紙片上，并在烘箱中用60度烘干，將烘干后的血斑 用剪刀剪下作為待提取DNA的樣品。用相同的方法一共制作15個(gè)樣品，并分為5組，每組3