烷基胺改進(jìn)甲醛固定的生物樣品組分的檢測(cè)的制作方法
【專利說明】
[00011 本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)日為2008年3月26日的國(guó)際申請(qǐng)PCT/EP2008/002356進(jìn)入中國(guó)、 申請(qǐng)?zhí)枮?00880010876.7的題為"烷基胺改進(jìn)甲醛固定的生物樣品組分的檢測(cè)"的發(fā)明專 利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域 [0002] 和【背景技術(shù)】
[0003] 在過去的100年中，病理學(xué)家已經(jīng)常規(guī)地通過用甲醛固定生物樣品來保存它們?nèi)?組織。雖然甲醛處理保持了組織的細(xì)胞特征，但甲醛處理也會(huì)導(dǎo)致化學(xué)交聯(lián)，這使得樣品的 許多生物組分不能充分適于或不適于檢測(cè)、量化和表征。甲醛通過使蛋白質(zhì)中的伯胺基團(tuán) 與蛋白質(zhì)或DNA中的其它附近的氮原子通過-CH 2-鍵交聯(lián)，而保存或固定組織或細(xì)胞。因此， 例如盡管聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可用于檢測(cè)和量化生物樣品中的核酸，但PCR通常不能充分 地或不能有效地分析甲醛交聯(lián)的樣品中的核酸，特別是在期望定量結(jié)果時(shí)。
[0004] 因此，在甲醛的作用下核酸交聯(lián)到細(xì)胞組分對(duì)檢測(cè)各種細(xì)胞組分提出了挑戰(zhàn)、包 括檢測(cè)核酸和蛋白質(zhì)。雖然已經(jīng)描述了一些途徑用于改進(jìn)從甲醛交聯(lián)的樣品擴(kuò)增核酸，但 該改進(jìn)通常僅僅包括降解樣品中的蛋白質(zhì)或提供通常不改變形成交聯(lián)的共價(jià)鍵的洗滌劑。 本發(fā)明解決這個(gè)及其他問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了用于分析甲醛交聯(lián)的生物樣品的一種或多種組分的方法。在一些實(shí) 施方案中，該方法包括使樣品與充足量的烷基胺接觸，以釋放至少一部分交聯(lián)的組分，從而 改進(jìn)用于分析的一種或多種組分的可檢測(cè)度(accessibility)。
[0006] 在一些實(shí)施方案中，生物樣品來自動(dòng)物的組織樣品。
[0007] 在一些實(shí)施方案中，烷基胺的量在0.01 % (約2mM)至5% (約800mM)之間。
[0008] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品和烷基胺被加熱一段時(shí)間。
[0009] 在一些其它的優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括檢測(cè)組分。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，在檢測(cè)步驟之前，將烷基胺基本上從樣品中除去。在一些實(shí)施 方案中，在檢測(cè)步驟前，烷基胺的濃度降低至小于約0.5% (約80mM)(例如小于約0.2%或 0.1%)〇
[0011] 在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟包括定量檢測(cè)組分。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，組分是核酸。在一些實(shí)施方案中，核酸是DNA。在一些實(shí)施方案 中，組分是RNA。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括檢測(cè)核酸。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟包 括擴(kuò)增核酸。在一些實(shí)施方案中，在允許形成探針和核酸的條件下，使核酸組分接觸探針， 并且檢測(cè)雙鏈體的存在。在一些實(shí)施方案中，探針連接到固相載體上。在一些實(shí)施方案中， 擴(kuò)增步驟包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，組分是蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括檢測(cè)蛋 白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟包括質(zhì)譜或電泳。在一些實(shí)施方案中，質(zhì)譜包括基質(zhì)輔 助激光解吸/離子化(MALDI)。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，在接觸步驟前，樣品被包埋在石蠟中。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，烷基胺選自乙二胺、乙醇胺和丙胺。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，與如果不進(jìn)行接觸步驟可用于分析的部分相比，可用于分析 的組分的部分被提高到至少約兩倍。在一些實(shí)施方案中，與如果不進(jìn)行接觸步驟可用于分 析的部分相比，可用于分析的組分的部分被提高到至少約十倍。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使樣品與蛋白酶接觸以降解樣品中的蛋白 質(zhì)，從而使得核酸更可用于分析。
[0019] 本發(fā)明還提供了試劑盒，其用于改進(jìn)甲醛交聯(lián)的生物樣品的一種或多種組分的利 用度。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包括烷基胺;和用于從生物樣品除去烷基胺的設(shè)備，例 如蛋白酶或試劑或設(shè)備。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包括用于從生物樣品除去烷基胺的試劑或設(shè)備。在 一些實(shí)施方案中，該設(shè)備是用于純化核酸的柱。
[0021 ]在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包括蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶是蛋白酶K。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，該試劑盒進(jìn)一步包括核苷酸和/或熱穩(wěn)定聚合酶。在一些實(shí)施 方案中，熱穩(wěn)定聚合酶是Taq聚合酶。
[0023] 本發(fā)明還提供了反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物包括甲醛交聯(lián)的生 物樣品；和充足量的烷基胺以釋放至少一部分交聯(lián)的組分。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，烷基胺的量在0.01 %至5 %之間。在一些實(shí)施方案中，烷基胺 選自乙二胺、乙醇胺和丙胺。在一些實(shí)施方案中，生物樣品來自動(dòng)物的組織樣品。
[0025] 定義
[0026] "甲醛交聯(lián)的生物樣品"是指已經(jīng)被甲醛處理成在蛋白質(zhì)中的氮與其他含氮的蛋 白質(zhì)和/或核酸之間形成交聯(lián)的生物樣品。生物樣品典型地包含細(xì)胞。生物樣品可以是例 如，來自動(dòng)物的組織樣品。通過將它們包埋在石蠟中而存儲(chǔ)許多甲醛處理的樣品。
[0027] 如本文中使用的，術(shù)語"烷基胺"是指直或支鏈的、飽和或不飽和的分子，其具有1-10或更多碳原子和一個(gè)或多個(gè)氨基。烷基胺的烷基部分可以是甲基、乙基、丙基、丁基、戊 基、己基、異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基等。氨基可以是伯氨基或仲氨基。烷基胺可進(jìn)一步 被不大于2(即0、1或2)個(gè)取代基取代，其包括但不限于一個(gè)或多個(gè)羥基基團(tuán)?？捎糜诒景l(fā)明 的烷基胺包括但不局限于乙胺、丙胺、異丙胺、乙二胺和乙醇胺。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解其 它烷基胺也可用于本發(fā)明。
[0028] 短語"檢測(cè)組分"是指至少測(cè)定組分的存在或不存在，并可以包括組分或部分組分 的進(jìn)一步定量測(cè)定或其它表征。
[0029] 生物樣品的"組分"是指一類分子(例如蛋白質(zhì)、核酸等)或人們希望檢測(cè)的具體的 目標(biāo)如具體的蛋白質(zhì)或核酸序列。
[0030] 如本文中使用的，術(shù)語"核酸"是指脫氧核糖核苷酸的聚合物(包含2-脫氧-D-核 糖）（即DNA)、多核苷酸(包含D-核糖）（即RNA)和任何其它嘌呤或嘧啶堿類的N-糖苷類似物、 或經(jīng)修飾的嘌呤或嘧啶堿基。
[0031] 短語"以釋放至少一部分交聯(lián)的組分"是指改變?cè)谏飿悠返膬煞N組分(例如核酸 和蛋白）指尖形成交聯(lián)的共價(jià)鍵，以便這兩種組分不再通過共價(jià)鍵連接。該短語包括但不限 于完全逆轉(zhuǎn)交聯(lián)過程。
[0032] 如本文中使用的，短語"用于分析的可檢測(cè)度"是指測(cè)定特定的靶分子存在或不存 在和/或量的檢測(cè)方法。例如許多檢測(cè)方法為至少部分阻止檢測(cè)甲醛交聯(lián)的生物樣品中的 蛋白質(zhì)或核酸，因此某些交聯(lián)的組分不〃可用于〃檢測(cè)。一旦通過用烷基胺處理釋放交聯(lián)，則 組分的提高量(例如至少多約10%和典型地是至少約2倍，或有時(shí)是約至少10或100倍)可以 被檢測(cè)和定量測(cè)定。
【附圖說明】
[0033] 圖1描繪了核酸甲醛交聯(lián)到賴氨酸以及在添加烷基胺后交聯(lián)逆轉(zhuǎn)的實(shí)例。
[0034]圖2描繪了實(shí)施例1中所述未經(jīng)處理的低聚核苷酸的質(zhì)譜分析。
[0035] 圖3描繪了實(shí)施例1中所述福爾馬林處理的低聚核苷酸的質(zhì)譜分析。
[0036] 圖4描繪了實(shí)施例1中所述福爾馬林處理的低聚核苷酸和賴氨酸的質(zhì)譜分析。
[0037] 圖5描繪了如實(shí)施例1中所述使用乙醇二胺(ethanoldiame)處理從而從交聯(lián)的DNA 再生起始DNA后福爾馬林處理的低聚核苷酸和賴氨酸混合物的質(zhì)譜分析。
[0038]圖6描繪了未經(jīng)處理的合成RNA的質(zhì)譜分析。
[0039]圖7描繪了在與福爾馬林孵育1小時(shí)后合成RNA的質(zhì)譜分析。
[0040]圖8描繪了與福爾馬林孵育5小時(shí)后合成RNA的質(zhì)譜分析。
[0041]圖9描