用于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的序列捕獲的組合物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明一般地涉及用于表征甲基化組（methylome)的組合物和方法，所述甲基化 組包括基因組的所有或基本上所有的甲基化狀態(tài)。具體地，本發(fā)明涉及多種寡核苷酸和使 用所述多種寡核苷酸鑒別目標(biāo)靶核酸的每個(gè)CG二核苷酸對的胞嘧啶位置的甲基化狀態(tài)的 方法。
[0002] 發(fā)明背景 用于表征位于胞嘧啶-鳥嘌呤（CG)二核苷酸對中的鳥嘌呤附近的胞嘧啶的復(fù)制后甲 基化的黃金標(biāo)準(zhǔn)方案是亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化并隨后DNA測序。在目標(biāo)核酸內(nèi)的每個(gè)CG二核苷 酸對的胞嘧啶位置的甲基化狀態(tài)將隨分子的序列而變化，且可以表現(xiàn)出在〇%甲基化（即， 所有這樣的胞嘧啶對亞硫酸氫鹽處理敏感）和100%甲基化（即，這樣的胞嘧啶都對亞硫酸 氫鹽處理不敏感）之間的任何水平。因而，在真核基因組（例如，人基因組）中，巨大數(shù)目 的潛在甲基化狀態(tài)可以是驚人的。為了鑒別基因組DNA樣品中的所有甲基化占據(jù)，可與亞 硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的基因組DNA雜交的寡核苷酸的集合必須代表每個(gè)和每種潛在甲基化狀態(tài)。
[0003] 本領(lǐng)域中需要能夠以單堿基分辨率、但是在全基因組規(guī)模表征DNA甲基化模式的 方法。還需要在全基因組規(guī)模鑒別甲基化占據(jù)的方法，其也能夠?qū)魏塑账岫鄳B(tài)性與未甲 基化的堿基區(qū)分開。
[0004] 發(fā)明概述 因而，本發(fā)明涉及多種可與靶生物的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的基因組核酸樣品的至少一部分 雜交的寡核苷酸，每種寡核苷酸在與靶生物的未轉(zhuǎn)化的基因組核酸中的胞嘧啶-鳥嘌呤二 核苷酸對互補(bǔ)的二核苷酸對的每個(gè)位置處包含在每個(gè)胞嘧啶互補(bǔ)位置處的擺動堿基。使用 核苷三磷酸（dNTP)的等摩爾混合物，可以在寡核苷酸合成過程中摻入所述擺動堿基。然 后，dNTP的等摩爾混合物包含脫氧胞苷三磷酸（dCTP)和脫氧胸苷三磷酸（dTTP)。所述dNTP 的等摩爾混合物可能進(jìn)一步包含脫氧腺苷三磷酸（dATP)、脫氧鳥苷三磷酸（dGTP)或脫氧 尿苷三磷酸（dUTP)。
[0005] 在所述多種寡核苷酸內(nèi)，每種寡核苷酸可能進(jìn)一步包含在所述寡核苷酸的任一端 或兩端處的連接序列。所述連接序列可能進(jìn)一步包含在所述寡核苷酸的任一端或兩端處的 生物素或熒光團(tuán)。如本領(lǐng)域中已知的，也可以將多種寡核苷酸用支持物固定化。
[0006] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸的至少一個(gè)子集能夠?qū)⑿叵汆奏魏塑账岫鄳B(tài) 性（SNP)與未轉(zhuǎn)化的基因組核酸中的未甲基化的胞嘧啶區(qū)分開。
[0007] 在第二方面，本發(fā)明提供了包含多個(gè)部件的雜交陣列，每個(gè)部件包含多種支持物 固定化的寡核苷酸，所述寡核苷酸可與靶生物的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的基因組核酸樣品的至少 一部分雜交，每種寡核苷酸在與靶生物的未轉(zhuǎn)化的基因組核酸中的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷 酸對互補(bǔ)的二核苷酸對的每個(gè)位置處包含在每個(gè)胞嘧啶互補(bǔ)位置處的擺動堿基。
[0008] 對于這樣的陣列，使用dNTP的等摩爾混合物，可以在寡核苷酸合成過程中摻入所 述擺動堿基。所述dNTP的等摩爾混合物可以包含脫氧胞苷三磷酸（dCTP)和脫氧胸苷三磷 酸（dTTP)。此外，所述dNTP的等摩爾混合物可能進(jìn)一步包含脫氧腺苷三磷酸（dATP)、脫氧 鳥苷三磷酸（dGTP)或脫氧尿苷三磷酸（dUTP)。
[0009] 在這樣的陣列內(nèi)，每種寡核苷酸可以進(jìn)一步包含在所述寡核苷酸的任一端或兩端 處的連接序列。所述連接序列可以包含在所述寡核苷酸的任一端或兩端處的生物素或熒光 團(tuán)。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的陣列的至少一些寡核苷酸能夠鑒別與靶生物的未轉(zhuǎn)化 的基因組核酸中的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸對互補(bǔ)的二核苷酸對的甲基化的堿基。具體 地，所述寡核苷酸的至少一個(gè)子集能夠?qū)⑿叵汆奏魏塑账岫鄳B(tài)性（SNP)與未轉(zhuǎn)化的基因 組核酸中的未甲基化的胞嘧啶區(qū)分開。
[0011] 在第三方面，本發(fā)明涉及一種用于鑒別亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的靶核酸序列內(nèi)的甲基化 的堿基的方法，所述方法包括下述步驟： (a) 使多種寡核苷酸與亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的核酸樣品接觸，每種寡核苷酸可與靶生物的 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的基因組核酸樣品的至少一部分雜交，且每種寡核苷酸在與靶生物的未轉(zhuǎn) 化的基因組核酸中的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸對互補(bǔ)的二核苷酸對的每個(gè)位置處包含在 每個(gè)胞嘧啶互補(bǔ)位置處的擺動堿基，其中所述接觸會用所述多種寡核苷酸的至少一部分捕 獲雜交復(fù)合物中的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的靶核酸分子； (b) 使所述雜交復(fù)合物與未結(jié)合的和非特異性地結(jié)合的核酸分子分離； (c) 從所述雜交復(fù)合物洗脫捕獲的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的靶核酸分子； (d) 將洗脫的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的靶核酸序列測序；和 (e) 鑒別洗脫的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的靶核酸序列的甲基化的堿基，其中鑒別包括，將所 述靶生物的未轉(zhuǎn)化的基因組核酸與所述洗脫的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的靶核酸序列對比，其中如 果所述洗脫的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的靶核酸序列中的對應(yīng)位置是胸腺嘧啶，則將所述未轉(zhuǎn)化的 基因組核酸的胞嘧啶鑒別為未甲基化的，且其中如果所述洗脫的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的靶核酸 序列中的對應(yīng)位置是胞嘧啶，則將所述未轉(zhuǎn)化的基因組核酸的胞嘧啶鑒別為甲基化的。
[0012] 使用dNTP的等摩爾混合物，可以在寡核苷酸合成過程中摻入所述擺動堿基。所述 dNTP的等摩爾混合物可以包含脫氧胞苷三磷酸（dCTP)和脫氧胸苷三磷酸（dTTP)，且也可 以進(jìn)一步包含脫氧腺苷三磷酸（dATP)、脫氧鳥苷三磷酸（dGTP)或脫氧尿苷三磷酸（dUTP)。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增洗脫的亞硫酸氫鹽 轉(zhuǎn)化的靶核酸序列的步驟。
[0014] 所述靶核酸序列經(jīng)常是基因組DNA，但是在例外情況下，也可以是其它DNA或RNA。
[0015] 所述接觸步驟a)可以在有亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的COtl DNA存在下發(fā)生，以便避免非 特異性的假堿基配對。所述亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的COtl DNA和所述靶生物可以屬于相同物種。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，每種寡核苷酸進(jìn)一步包含在所述寡核苷酸的任一端或兩端處 的連接序列。所述連接物質(zhì)可以包含在所述寡核苷酸的任一端或兩端處的標(biāo)記諸如生物素 或熒光團(tuán)。
[0017] 此外，所述新方法可以包括將胸腺嘧啶單核苷酸多態(tài)性（SNP)與未轉(zhuǎn)化的基因組 核酸中的未甲基化的胞嘧啶區(qū)分開的步驟。
[0018] 發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及用于生物的全基因組的甲基化狀態(tài)或生物的"甲基化組"的全基因組繪圖 的方法和組合物。本發(fā)明至少部分地基于發(fā)明人的用于產(chǎn)生多種寡核苷酸的方法的發(fā)現(xiàn)， 每種寡核苷酸代表目標(biāo)靶序列內(nèi)的每個(gè)CG二核苷酸對的胞嘧啶位置的幾乎每種可能的甲 基化狀態(tài)。CG二核苷酸不均勻地分布在基因組中，而是集中在重復(fù)基因組序列區(qū)域中和 CpG "島"中，它們通常與基因啟動子有關(guān)。鑒于使用常規(guī)探針合成方案來得到多種足夠廣 泛以表征長亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的核酸樣品（包括象真核基因組那么大的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的核 酸樣品）中的所有或幾乎所有可能甲基化位點(diǎn)的寡核苷酸在技術(shù)上或在經(jīng)濟(jì)上尚不可行， 發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)和本文提供的發(fā)明是特別重要的。
[0019] 組合物 因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了多種寡核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多種寡核 苷