專利名稱：基于頂復(fù)蟲Ferlin、Ferlin樣蛋白和其它含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白的瘧疾疫苗的制作方法
基于頂復(fù)蟲Fer I in、Fer I in樣蛋白和其它含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白的瘧疾疫苗 本發(fā)明涉及用作痕疾疫苗的肽,所述肽含有至少一種頂復(fù)蟲Ferlin、Ferlin樣蛋白和/或另外的含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白的抗原決定簇或表位。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有所述肽的組合物以及該組合物作為瘧疾疫苗的應(yīng)用。
_2]
背景技術(shù)：
瘧疾每年導(dǎo)致超過2百萬人死亡，主要在非洲。然而，可持續(xù)控制該疾病所必需的有效疫苗仍未出現(xiàn)?？汞懠差A(yù)防接種的可行性已經(jīng)通過使用輻射減毒子孢子(RAS)得到了充分地證明，RAS通過靶向子孢子(由叮咬的按蚊接種于皮膚內(nèi))和隨后的寄生蟲肝期來保護(hù)嚙齒類動(dòng)物、非人靈長類動(dòng)物和人類。RAS的發(fā)育在肝內(nèi)中斷，因此這些寄生蟲沒有發(fā)展到誘導(dǎo)疾病的血液期感染(圖I)。然而，盡管由經(jīng)Y-輻射的寄生蟲提供了滅菌免疫，實(shí)踐中的問題(包括大規(guī)模生產(chǎn)和確保最終產(chǎn)品的一致性)使得該疫苗不太可能被允許用于人體。然而，RAS是實(shí)驗(yàn)室研究較好的實(shí)驗(yàn)預(yù)防接種模型。RAS模型中最占優(yōu)勢的免疫應(yīng)答是由環(huán)子孢子表面蛋白(CSP ;圖2)所激活的。這些發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了基于CS蛋白的RTS，S疫苗的發(fā)展。 迄今為止RTS，S是市場上最先進(jìn)的瘧疾疫苗，目前已處于臨床III期。對(duì)健康志愿者和生活在發(fā)病地區(qū)的非洲兒童的研究顯示了該疫苗的良好耐受性及安全性。然而，RTS，S和不同佐劑系統(tǒng)的有效性僅為40-60%。此外在CS轉(zhuǎn)基因小鼠中的觀察結(jié)果表明，在耐受CSP的小鼠內(nèi)也觀察到了保護(hù)作用，這提示了有其它的誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的抗原存在。研究RAS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答總受這樣的事實(shí)所限制注入的子孢子的遺傳學(xué)背景在子孢子個(gè)體以及不同批次的子孢子之間高度變化，這也導(dǎo)致了不同表達(dá)的抗原?；虬邢蚣夹g(shù)的最新發(fā)展促進(jìn)了基因減毒寄生蟲(GAP)的廣生，所述GAP在對(duì)寄生蟲發(fā)育所必需的基因內(nèi)帶有確定的突變。類似于RAS，GAP也在肝內(nèi)減弱，并且賦予階段特異性的滅菌免疫，但是GAP在感染開始后的特定的時(shí)間點(diǎn)C24小時(shí))以及很特定的分化階段被阻滯(圖I)。作為對(duì)比，RAS帶有多個(gè)非均一的突變并且生長阻滯發(fā)生在多個(gè)階段。因此，明確的基因減毒寄生蟲(uis3(_)和/或uis4(-))成為進(jìn)一步表征對(duì)肝期寄生蟲的保護(hù)性免疫應(yīng)答的理想工具?；蚯贸∈蟮难芯勘砻?，產(chǎn)生Y-干擾素的T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)GAP誘導(dǎo)的免疫，而B細(xì)胞并不重要。進(jìn)一步的研究甚至披露了 CD8+ T細(xì)胞是主要的參與者。然而，涉及該免疫的抗原特異性和效應(yīng)子機(jī)制仍未被了解。本發(fā)明的目的在于提供有效的瘧疾疫苗的手段。更特別地，本發(fā)明的目的在于鑒定對(duì)免疫很重要的新抗原。
_4] 本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的描述
在下面更詳細(xì)描述本發(fā)明之前，需要理解的是，本發(fā)明不限于本文描述的特定的方法學(xué)、方案和試劑，因?yàn)檫@些可變化。還需要理解的是，本文所用的術(shù)語僅僅為了描述特定的實(shí)施方式，而非用于限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅僅受所附的權(quán)利要求所限制。除非另有說明，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所通常理解的相同含義。為了本發(fā)明的目的，本文引述的所有參考文獻(xiàn)以全文參照的方式結(jié)合于此。按照本發(fā)明，上面的目的通過用作瘧疾疫苗的含有至少一種頂復(fù)蟲蛋白的抗原決定簇或表位的肽來解決，所述的頂復(fù)蟲蛋白選自
Ferlin,
Ferlin樣蛋白家族的成員，和 其它含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白。本文使用的術(shù)語“肽”是指肽，在其長度或尺寸方面沒有限制。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽是頂復(fù)蟲蛋白本身或其(較大的)片段。在另外的實(shí)施方式中，所述肽具有5 - 50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選8 - 25個(gè)氨基酸，更優(yōu)選8 - 15個(gè)氨基酸。本文使用的術(shù)語“頂復(fù)蟲蛋白”是指來自頂復(fù)蟲生物的蛋白。頂復(fù)蟲生物(也稱作apicomplexa或apicomplexia)是一個(gè)大的原生生物群,它們中的大部分都具有獨(dú)特的被稱為頂質(zhì)體(apicoplast)的細(xì)胞器以及涉及穿透宿主細(xì)胞的頂端復(fù)合結(jié)構(gòu)。它們是形成孢子的單細(xì)胞哺乳動(dòng)物寄生蟲。優(yōu)選地，所述頂復(fù)蟲生物選自惡性痕原蟲{Plasmodium
、伯氏痕原蟲{Plasmodium、約氏痕原蟲(Plasmodium yoelii)和剛
地弓形蟲{Toxoplasma gondif)。優(yōu)選地,所述頂復(fù)蟲蛋白為痕疾頂復(fù)蟲蛋白，即它來自引起哺乳動(dòng)物瘧疾的頂復(fù)蟲生物，優(yōu)選惡性瘧原蟲和伯氏瘧原蟲，更優(yōu)選惡性瘧原蟲。C2-結(jié)構(gòu)域是一種將蛋白靶向細(xì)胞膜的蛋白結(jié)構(gòu)域。它是一種由8條P -鏈構(gòu)成的￠-夾心結(jié)構(gòu)，使2 — 3個(gè)鈣離子共定位在胞膜結(jié)合面上，鈣離子結(jié)合在由結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)環(huán)(loop)和最后一個(gè)環(huán)所構(gòu)成的腔內(nèi)。基于它們的氨基酸序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地鑒定含有C2-結(jié)構(gòu)域的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，其它的含有C2-結(jié)構(gòu)域的蛋白選自伯氏瘧原蟲的含有C2-結(jié)構(gòu)域的蛋白(Pb C2CP)、惡性瘧原蟲中的其直向同源物、以及與這些蛋白至少有80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、甚至更優(yōu)選至少96%、甚至更優(yōu)選至少97%、甚至更優(yōu)選至少98%、甚至更優(yōu)選至少99%的同一丨丨生的蛋白。本發(fā)明的瘧疾疫苗優(yōu)選亞單位疫苗。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述頂復(fù)蟲蛋白選自
伯氏瘧原蟲Ferlin (Pb FER)，
惡性瘧原蟲Ferlin (Pf FER)，
約氏瘧原蟲Ferlin (Py FER)，
剛地弓形蟲Fer I in (Tg FER)，
伯氏瘧原蟲Ferlin樣蛋白(Pb FLP)，
惡性瘧原蟲Ferlin樣蛋白(Pf FLP)，
約氏瘧原蟲Ferlin樣蛋白(Py FLP)，
剛地弓形蟲Ferlin樣蛋白(Tg FLP)，
伯氏瘧原蟲含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白(Pb C2CP)，以及
與上述任一種蛋白至少有80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、甚至更優(yōu)選至少96%、甚至更優(yōu)選至少97%、甚至更優(yōu)選至少98%、甚至更優(yōu)選至少99%的同一性的蛋白。Pb FER 指的是 PBA KA_131930(SEQ ID NO. 26)，
Pf FER 指的是 PF14_0530(SEQ ID NO. 27)，
Py FER 指的是 PY05745(SEQ ID NO. 28)，Tg FER 指的是 TGVEG_073920(SEQ ID NO. 29)，
Pb FLP 指的是 PBANKA_122440(SEQ ID NO. 30)，
Pf FLP 指的是 MAL8P1. 134(SEQ ID NO. 31)，
Py FLP 指的是 PY04695(SEQ ID NO. 32)，
Tg FLP 指的是 TGVEG_093560(SEQ ID NO. 33)，以及
Pb C2CP 指的是 PB402109. 00. 0(SEQ ID NO. 34)，
其中上面的登錄號(hào)為 PlasmoDB/GeneDB 的登錄號(hào)(www. plasmodb. org, version: 7. I,November 22, 2010; www.genedb.org，version: November, 2010)。本文使用的術(shù)語“同一性百分?jǐn)?shù)(%) ”指的是兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性。 同一性可通過比較兩個(gè)為比較目的而排列的序列的位置來確定。如果在被比較的序列中的相同位置被相同的氨基酸所占據(jù)，則這兩個(gè)分子被認(rèn)為在那個(gè)位置相同或同一。通常，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知曉在蛋白質(zhì)或肽的氨基酸序列中的某些氨基酸交換對(duì)該蛋白質(zhì)或肽的(二級(jí)或三級(jí))結(jié)構(gòu)、功能和活性沒有任何影響。與本文披露的氨基酸序列相比，具有這種“中性的”氨基酸交換的氨基酸序列落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。還包括允許或促進(jìn)所述肽(尤其是頂復(fù)蟲蛋白本身或其較大片段)在非頂復(fù)蟲生物(例如大腸桿菌^coli))中產(chǎn)生的原始氨基酸序列中的突變。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述頂復(fù)蟲蛋白選自Pf FER, Pf FLP、和與Pf FER或PfFLP有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、甚至更優(yōu)選至少96%、甚至更優(yōu)選至少97%、甚至更優(yōu)選至少98%、甚至更優(yōu)選至少99%的同一丨丨生的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原決定簇或表位是CD8+ T細(xì)胞表位、CD4+ T細(xì)胞表位或B細(xì)胞表位。優(yōu)選⑶8+ T細(xì)胞表位。優(yōu)選地，所述⑶8+ T細(xì)胞表位是惡性瘧原蟲特異性的⑶8+ T細(xì)胞表位，例如HLA-A 0201限制性⑶8+ T細(xì)胞表位，或者是伯氏瘧原蟲特異性⑶8+ T細(xì)胞表位，例如H2b限制性⑶8+ T細(xì)胞表位。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道如何鑒定/預(yù)測給定氨基酸序列的以上表位，例如通過表位預(yù)測程序，例如SYFPEITHI (http: //www.syfpeithi. de)。在一個(gè)實(shí)施例中,所述抗原決定簇或表位來自Ferlin、Ferlin樣蛋白家族成員或其它的含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白的結(jié)構(gòu)域，其中所述結(jié)構(gòu)域選自
C2結(jié)構(gòu)域，
ATP酶結(jié)構(gòu)域，
外切酶(exo)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原決定簇或表位的氨基酸序列具有至少8個(gè)氨基酸的長度。優(yōu)選地，所述抗原決定簇或表位的氨基酸序列具有8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)氨基酸的長度。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述頂復(fù)蟲蛋白是伯氏瘧原蟲Ferlin(Pb FER)，且所述抗原決定簇或表位的氨基酸序列選自
(P8L)PNPNFSYL[SEQ ID NO. I],
(V8L)VPIEYRPL[SEQ ID NO. 2]，和
(L8L)LNTCFLQL[SEQ ID NO. 3]。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述頂復(fù)蟲蛋白是惡性瘧原蟲Fer I in (Pf FER)，且所述抗原決定簇或表位的氨基酸序列選自(N9V)NLLDPLVVV[SEQ ID NO. 4]，
(Y9I)YLYVNIHKI[SEQ ID NO. 5]，
(L9L)LLLEGNFYL[SEQ ID NO. 6]，
(K9L)KLIPVNYEL[SEQ ID NO. 7]，
(Y9L)YLYEKQQEL[SEQ ID NO. 8]，和
(191)ILIPSLPLI[SEQ ID NO. 9]。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述頂復(fù)蟲蛋白是伯氏瘧原蟲Ferlin樣蛋白(Pb FLP)，且所述抗原決定簇或表位的氨基酸序列選自(S8L)SRYFFRAL[SEQ ID NO. 10]，
(L8V)LNYVYSKV[SEQ ID NO. 11],
(I8M)IGYTYIDM[SEQ ID NO. 12]，和
(V8L*)VGTAYITL[SEQ ID NO. 13]。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述頂復(fù)蟲蛋白是惡性瘧原蟲Ferlin樣蛋白(Pf FLP)，且所述抗原決定簇或表位的氨基酸序列選自
(T9L*)TLNPLLPffL[SEQ ID NO. 14]，
(I9L)ILIKSEAEL[SEQ ID NO. 15]，
(N9V*)NILEPYVKV[SEQ ID NO. 16]，
(Y9L*)YLYGGRIFL[SEQ ID NO. 17]，
(LlOV)LLVAFELVPV [SEQ ID NO. 18]，
(LlOL)LLIGTAYITL[SEQ ID NO. 19]，
(DlOL)DLMPIELRSL[SEQ ID NO. 20]，和
(AlOL)ALIGKCSFGL[SEQ ID NO. 21]。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述頂復(fù)蟲蛋白是伯氏瘧原蟲含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白(PbC2CP)，且所述抗原決定簇或表位的氨基酸序列選自
(A9I)AYIAPHTII[SEQ ID NO. 22]，
(T9L)TIRSFYKRL[SEQ ID NO. 23]，
(S8V)SPYLFNIV[SEQ ID NO. 24]，和
(A8I)AIYRFNAI[SEQ ID NO. 25]。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原決定簇或表位的氨基酸序列選自SEQ ID NO. I至25，優(yōu)選選自 SEQ ID NO. 4 至 9 和 SEQ ID NO. 14 至 21。在一個(gè)實(shí)施方式中，按照本發(fā)明的肽進(jìn)一步含有至少兩種上面所限定的頂復(fù)蟲蛋白的抗原決定簇或表位。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽含有3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或更多這樣的抗原決定簇或表位。在一個(gè)實(shí)施方式中，按照本發(fā)明的肽還含有至少一種頂復(fù)蟲蛋白的抗原決定簇或表位，其中這些頂復(fù)蟲蛋白與下述的蛋白不同
Ferlin，
Ferlin樣蛋白家族成員，和 其它的含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白。
不同于上面所列蛋白的頂復(fù)蟲蛋白可以是已知的潛在亞單位疫苗的候選者，例如MSPU CSP (先導(dǎo)疫苗候選者RTS，S，GSK)，或者是一個(gè)或多個(gè)源自發(fā)明人SSH篩選的候選肽。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述肽含有一種或多種其他成分，例如一種或多種標(biāo)記物、一種或多種N末端和/或C-末端修飾或一種或多種其它藥物或試劑。技術(shù)人員能夠選擇合適的其它成分。本發(fā)明的目的還可通過編碼上面所限定的至少一種肽的核酸分子得以解決。所述目的進(jìn)一步可通過含有至少一個(gè)這樣的核酸分子的質(zhì)粒得以解決。 在一個(gè)實(shí)施方式中，提供所述核酸分子或質(zhì)粒以用作瘧疾疫苗。本發(fā)明的目的還可通過針對(duì)上面所限定的肽的抗體來解決。
本發(fā)明的目的進(jìn)一步通過一種組合物來解決，所述組合物含有
(i)至少一種上面所限定的肽，
(ii)任選的載體，
(iii)任選的佐劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物含有至少兩種肽(i)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物含有3種、4種、5種或更多種上面所限定的肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物還含有至少一種肽，該肽含有至少一種頂復(fù)蟲蛋白的抗原決定簇或表位，其中所述頂復(fù)蟲蛋白與下述的蛋白不同
Ferlin，
Ferlin樣蛋白家族成員，和 其它的含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白。因此，在所述組合物中，本發(fā)明的一種或多種肽可與來自已知的潛在亞單位疫苗候選者(例如MSPUCSP(先導(dǎo)疫苗候選者RTS，S，GSK))的其它肽(片段)相結(jié)合，最終與一個(gè)或多個(gè)源自發(fā)明人SSH篩選的候選肽相結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體(ii)與所述肽相融合。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體(ii)是病毒顆?；蚱洳糠帧⒉《据d體或病毒顆粒的包膜蛋白、或納米載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述病毒顆粒是乙肝病毒顆?；蚱洳糠?。在這樣的實(shí)施方式中，所述載體(i i)，例如乙肝病毒顆粒或其部分，適用于本發(fā)明的一種或多種肽的肝定位。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述納米載體是細(xì)胞祀向的納米載體，例如可由RodosBioTarget GmbH, Hannover (www. biotargeting, org)獲得的納米載體，例如TargoSphere 傳遞系統(tǒng)。這些納米載體可與所需的肽相結(jié)合，然后被特異性地導(dǎo)向抗原呈遞免疫細(xì)胞(如APC、DC、巨噬細(xì)胞等)。在一個(gè)實(shí)施方式中，通常所述佐劑(iii)觸發(fā)⑶8 T細(xì)胞應(yīng)答。優(yōu)選地，所述佐劑是商業(yè)可獲得的佐劑系統(tǒng)，例如IC31 (Intercell company, Vienna),因?yàn)樵撟魟┫到y(tǒng)觸發(fā)CD8 T細(xì)胞應(yīng)答而非抗體介導(dǎo)的免疫。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供上面限定的組合物以用作瘧疾疫苗。本發(fā)明的目的還可通過生產(chǎn)上面所限定的組合物的方法來解決，所述方法包括混合至少兩種上面所限定的肽的步驟。本發(fā)明的目的還可通過預(yù)防瘧疾的方法來解決，所述方法包括給需要的人施用上面所限定的肽、或者上面所限定的核酸分子或質(zhì)粒，或者上面所限定的組合物的步驟。附圖
圖I顯示了使用輻射減毒子孢子(RAS)或基因減毒寄生蟲(GAP)對(duì)抗瘧疾的兩種預(yù)防接種策略，它們都基于減毒的肝期(LS)發(fā)育。應(yīng)用RAS仍然是預(yù)防接種的“金標(biāo)準(zhǔn)”。圖2顯示了環(huán)子孢子表面蛋白(CSP)的一級(jí)結(jié)構(gòu)以及由免疫熒光染色所顯示的其細(xì)胞定位(瘧原蟲子孢子的表面染色)。還顯示了其單一主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類(H2Kd)限制性CD8+ T細(xì)胞表位(伯氏瘧原蟲的SYIPSAEKI和約氏瘧原蟲的SYVPSAEQI)的大致位置。圖3顯示了用于比較瘧疾WT、GAP和RAS寄生蟲在肝期發(fā)育20小時(shí)后的轉(zhuǎn)錄物的 改良抑制消減雜交(SSH)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。圖4顯示了通過抑制消減雜交(SSH)鑒定的與WT序列相比較，基因減毒(GAP特異性)或輻射減毒(RAS特異性)寄生蟲的200個(gè)分析序列中的某些肝期轉(zhuǎn)錄物的百分?jǐn)?shù)。序列分析使用 PlasmoDB (http: //plasmodb. org)和 GeneDB (www. genedb. org)主頁的 BLAST檢索來進(jìn)行。圖5A和B顯示了有標(biāo)注的頂復(fù)蟲Ferlin和Ferlin樣蛋白(FLP)以及伯氏痕原蟲含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白(Pb C2CP)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。顯示了惡性瘧原蟲Ferlin和伯氏瘧原蟲Ferlin和FLP的側(cè)向同源物(paralog)，以及剛地弓形蟲直向同源物(B)。伯氏瘧原蟲和惡性瘧原蟲Ferlin直向同源物具有約20%的氨基酸(AA)同一性。特征性的C2結(jié)構(gòu)域參與Ca2+傳感和其它所述Ferlin蛋白中的Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。除了這些結(jié)構(gòu)域外，SMART分析(http://smart.embl_heidelberg.de/)揭不了 Pb C2CP 內(nèi)的具有預(yù)測的外切酶(exo)和ATP酶活性的結(jié)構(gòu)域。還顯示了預(yù)測的N-末端的信號(hào)肽以及標(biāo)注的跨膜結(jié)構(gòu)域(atd)和預(yù)測的 C-末端的跨膜跨度(pts, predicted transmembrane span)。圖6顯示了以分離自20小時(shí)伯氏瘧原蟲肝期的總RNA為模板使用基因特異性寡核苷酸引物對(duì)進(jìn)行的定量實(shí)時(shí)RT-PCR，其中伯氏瘧原蟲來自野生型(WT)、輻射減毒的(RAS)或基因減毒的(GAP)寄生蟲。顯示了伯氏瘧原蟲C2CP的轉(zhuǎn)錄物水平。轉(zhuǎn)錄物的量以拷貝數(shù)(+/_ SD)來表示，與基因特異性質(zhì)粒所產(chǎn)生的外部標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較。圖7A顯示了由數(shù)個(gè)程序，包括表位預(yù)測程序SYFPEITHI (http: //www.syfpeithi. de)所預(yù)測的Pb C2CP的H_2b限制性CD8+ T細(xì)胞表位。一級(jí)結(jié)構(gòu)上方顯示的條帶指示預(yù)測的T細(xì)胞表位的大致定位。圖7B是初次免疫-兩次增強(qiáng)(prime-two-boost)免疫方案的示意圖。在第0天給C57B1/6小鼠靜脈注射伯氏瘧原蟲RAS或GAP。第一次增強(qiáng)通常在14天之后給予，第二次增強(qiáng)在此后14天給予。增強(qiáng)免疫的劑量通常低于初次免疫的劑量。在最后一次增強(qiáng)后7天，動(dòng)物或者用WT子孢子(spz)進(jìn)行攻擊(challenge)，或者器官經(jīng)解剖用于免疫學(xué)研究(在攻擊前收獲)。經(jīng)攻擊的小鼠在WT攻擊后7天處死(在攻擊后收獲)。圖8顯示了基于免疫動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)Pb C2CP脈沖處理的靶細(xì)胞的裂解的體內(nèi)細(xì)胞毒性測定。給未經(jīng)實(shí)驗(yàn)的脾細(xì)胞加載Pb C2CP衍生的表位池，并用2 u M CFSE(CFSEhigh)(5-(和-6)-羧基熒光素雙醋酸酯，琥珀酸亞胺酯，Invitoogen)標(biāo)記。對(duì)照細(xì)胞群用0.2u M CFSE (CFSElow)標(biāo)記。細(xì)胞群以相等的數(shù)量(1:1)混合，導(dǎo)致CFSE終濃度分別為I y M或0. I ii M。在細(xì)胞分離前18個(gè)小時(shí)將混合群的IxlO7細(xì)胞靜脈注射入經(jīng)免疫動(dòng)物或未經(jīng)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照動(dòng)物的尾靜脈內(nèi)。在脾和肝內(nèi)的CFSE標(biāo)記的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測。特異性的裂解以CFSEhigh細(xì)胞和CFSE1 細(xì)胞的比值來計(jì)算，并與在未經(jīng)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物中測得的比值相比較。顯示了每組3-5個(gè)小鼠的三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的裂解細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)。圖9顯示了在用GAP和RAS免疫小鼠(n=5)后肝內(nèi)的⑶8+⑶44highCD62LlQW細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)，表明肝內(nèi)的效應(yīng)子記憶T細(xì)胞群在經(jīng)GAP和RAS免疫后增長。將肝淋巴細(xì)胞與BMDC和Pb C2CP衍生肽T9L共同孵育過夜。使用抗⑶8a_PacBlue結(jié)合抗體(1:100，BD biosciences)、抗 CD44-FITC (1:100，BD biosciences)、抗 CD62L-PE(1:200，BD biosciences)以及抗 CD25_Alexa647 (1:50，BD biosciences)進(jìn)行表面染色。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)使用FACSCanto系統(tǒng)(BD biosciences)分析染色的細(xì)胞。得到的數(shù)據(jù)進(jìn)一步使用fIowjo分析軟件(http://www. flowjo. com)進(jìn)行分析。

圖10顯示了測量來自RAS和GAP免疫的小鼠的效應(yīng)子T細(xì)胞的干擾素-Y (IFN-Y)應(yīng)答的基于細(xì)胞因子的ELISpot測定。來自免疫動(dòng)物的培養(yǎng)淋巴細(xì)胞使用 Iii M的Pb C2CP衍生肽T9L再次刺激過夜，或者不經(jīng)刺激而孵育。隨后細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至包被有5iig/ml IFN-y抗體的MultiScreen過濾板。檢測到的IFN-Y應(yīng)答以每百萬培養(yǎng)細(xì)胞的計(jì)數(shù)的點(diǎn)來表示。未經(jīng)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照動(dòng)物的計(jì)數(shù)被減去。顯示了五個(gè)動(dòng)物為一組的三次實(shí)驗(yàn)的平均計(jì)數(shù)。圖IlA顯示了通過表位預(yù)測程序 SYFPEITHI (http://www. syfpeithi. de)預(yù)測的Pf FER的HLA-A 0201限制性的⑶8+ T細(xì)胞表位。一級(jí)結(jié)構(gòu)上方顯示的條帶指示表示預(yù)測的T細(xì)胞表位的大致定位。圖IlB顯示了以分離自野生型(WT)或者輻射減毒(RAS)寄生蟲的惡性瘧原蟲肝期的總RNA為模板，使用基因特異性寡核苷酸引物對(duì)的定量實(shí)時(shí)RT-PCR。顯示了惡性瘧原蟲Ferlin (Pf FER)相對(duì)的轉(zhuǎn)錄物水平。圖12A顯示了 10天的培養(yǎng)ELISpot測定，用于檢測經(jīng)Pf Ferlin特異性表位再刺激后CD8+ T細(xì)胞的活化。每一個(gè)表位都單獨(dú)測試和以表位池測試，其概述于該圖中。用PfFerlin表位刺激來自暴露于瘧疾和未暴露于瘧疾(未經(jīng)實(shí)驗(yàn)的)的個(gè)體的血液中新鮮分離的PBMC。IFN-Y的分泌用ELISpot分析。Pf AMAl—已知的瘧疾血液期抗原，被用作陽性對(duì)照(圖12B)。圖13顯示了伯氏瘧原蟲Ferlin(FER)和Ferlin樣蛋白(FLP)的敲除(A)和互補(bǔ)(B)的策略。取代構(gòu)建體(A)含有側(cè)翼為TgDHFR/TS選擇標(biāo)記的伯氏瘧原蟲FER或FLP可讀框的5’和3’的非翻譯區(qū)。野生型(WT)基因組的基因座由線性化的KpnI/Xbal尋靶載體來定位。雙交換事件分別用選擇標(biāo)記取代內(nèi)源性FER或FLP的可讀框?；パa(bǔ)對(duì)照構(gòu)建體(PCONT) (B)含有伯氏瘧原蟲FER或FLP可讀框(fer/flp)的5’截?cái)嘈问揭约癟gDHFR/TS選擇標(biāo)記。經(jīng)XbaI線性化的質(zhì)粒分別靶向FER或FLP野生型基因組基因座，并且插入選擇標(biāo)記以及附加的截?cái)嘈蚮er或flp拷貝。伯氏痕原蟲Ferlin(FER)和Ferlin樣蛋白(FLP)敲除或互補(bǔ)的轉(zhuǎn)染子的基因分型PCR分別由C和D顯示。對(duì)0RF、測試物和附加體(epi, episomal)特異性寡核苷酸對(duì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR。作為模板，提供不同轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)染子(A flp/ A fer/flpC0NT/ferCONT)的gDNA以及伯氏瘧原蟲野生型gDNA(WT)或者作為PCR對(duì)照的各自的尋靶構(gòu)建體(V)。通過瓊脂糖凝膠電泳分離特異性的DNA片段。
圖14顯示了貫穿瘧疾生命周期的伯氏瘧原蟲Ferlin(A)和對(duì)照酶醛縮酶(B)的轉(zhuǎn)錄概況的RT-PCR分析(BS=血液期、GA=配子母細(xì)胞、Sg Spz=唾液腺子孢子、LS=肝期)?，F(xiàn)在通過參考下面的實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例用于說明而不是限制本發(fā)明。早期瘧原蟲肝期的比較分析鑒定出保護(hù)性免疫的潛在靶標(biāo)?；驕p毒寄生蟲(GAP)在肝期(LS)發(fā)育中停滯，因此并不是在LS發(fā)育中正常表達(dá)的所有基因都會(huì)得到表達(dá)。由野生型(WT)子孢子(而不是GAP)的LS所表達(dá)的任何基因可被認(rèn)為不是保護(hù)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)所必需的。因此，對(duì)由uis3(_) LS所表達(dá)的所有基因組成成分進(jìn)行分析，將允許縮小作為前紅細(xì)胞免疫的非常重要的靶標(biāo)的抗原的范圍。抑制消減雜交在減毒寄生蟲中產(chǎn)生一組被特異性地上調(diào)的轉(zhuǎn)錄物。本發(fā)明人使用抑制消減雜交(SSH)比較了 LS發(fā)育20小時(shí)后的WT、GAP和RAS寄生 蟲的轉(zhuǎn)錄物(圖3)。這種高度有效的方法允許鑒定兩種不同cDNA群中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物(Diatchenko，1996)。瘧原蟲寄生蟲的LS發(fā)育在培養(yǎng)的肝細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)。已有描述伯氏瘧原蟲子孢子進(jìn)入人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞并且在人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化(Hollingdale，1983)。因此，人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系Huh7被用作LS發(fā)育的合適的宿主。這種體內(nèi)培養(yǎng)允許提高寄生蟲相對(duì)宿主細(xì)胞的比值，并且因此可獲得足夠的RNA材料用于隨后的消減。對(duì)于GAP、RAS或WT的LS期的一個(gè)cDNA群,接種了 2 — 3個(gè)8孔腔式載玻片(8_well chamber slide),每孔接種25，000個(gè)Huh7細(xì)胞和25，000 一 35，000個(gè)子孢子，LS期在20小時(shí)后終止。選擇這一時(shí)間點(diǎn)是因?yàn)閡is3(_)寄生蟲在肝內(nèi)24小時(shí)后經(jīng)歷發(fā)育阻滯，因此這些在這一時(shí)期已經(jīng)表達(dá)的早期基因?qū)τ谇凹t細(xì)胞免疫必定是重要的。收集的細(xì)胞經(jīng)0.05 %的毛地黃皂苷處理，毛地黃皂苷選擇性地透過宿主細(xì)胞質(zhì)膜而不影響細(xì)胞內(nèi)的寄生蟲，因此減少了宿主細(xì)胞RNA的污染。寄生蟲特異性的RNA隨后使用RNAeasy Mini Kit (Qiagen)進(jìn)行分離。獲得的RNA在40 u I的體積中的濃度達(dá)到約150-250 ii g/ml，這意味著總RNA的最終量為6-10 ii g。使用實(shí)用的 SMART方法(Clontech; SMART PCR cDNA Synthesis Kit, Protocol No. PT3041-1)進(jìn)行的cDNA合成需要0. 05-1 u g總RNA，因此當(dāng)起始的材料有限時(shí)該技術(shù)尤其適用于這種方法。大約0. 5 ii g總RNA用于使用SMART技術(shù)進(jìn)行cDNA合成，隨后該cDNA用于消減。消減程序按照廠商手冊(Clontech; PCR-Select cDNA Subtraction Kit, Protocol No.PT1117-1)進(jìn)行。得到的cDNA片段直接克隆進(jìn)入pGEMT-easy T/A-克隆載體(Promega)并使用傳統(tǒng)方法進(jìn)行測序。使用PlasmoDB 數(shù)據(jù)庫(http://plasmodb. org)經(jīng) BLAST 搜索來自 SSH 篩選的序列。大多數(shù)顯著的上調(diào)基因在這兩個(gè)減毒寄生蟲系中是共同的(圖4)。由SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart, embl-heidelberg. de/)鑒定的 Ferlins、Ferlin 樣蛋白和含有 C2 結(jié)構(gòu)域的蛋白在這些最為顯著的基因里。頂復(fù)蟲Ferlins、Ferlin 樣蛋白和 Pb C2CP(PB402109. 00. 0)的一級(jí)結(jié)構(gòu)如圖 5A和B所示。有伯氏瘧原蟲Ferlin樣蛋白(PbANKA_l22440)和一個(gè)Pb Ferlin側(cè)向同源物(PBANKA_131930)。在惡性瘧原蟲基因組內(nèi)，有一個(gè)Ferlin (PF14_0530)和一個(gè)Ferlin樣蛋白(MAL8P1. 134)有注釋。數(shù)個(gè)Ferlin在約氏瘧原蟲基因組中有注釋(未顯示)。還在頂復(fù)蟲寄生蟲一剛地弓形蟲內(nèi)發(fā)現(xiàn)Ferlin和Ferlin樣蛋白(圖5B)。Ferlin和Fer I in樣蛋白是具有不同數(shù)量的特征性C2結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。這些結(jié)構(gòu)域通常參與Ca2+依賴性脂質(zhì)加工事件。Ferlin家族成員共享調(diào)節(jié)細(xì)胞型特異性膜融合事的保守機(jī)制(Me Neil等的綜述，2005)。在瘧原蟲中，該蛋白家族的功能仍未明確。除了一個(gè)特征性C2結(jié)構(gòu)域外，伯氏瘧原蟲的含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白(C2CP)還含有一個(gè)具有預(yù)測的外切酶活性的結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)預(yù)測的ATP酶結(jié)構(gòu)域。此外，所有的Ferlin和Ferlin樣蛋白都含有跨膜結(jié)構(gòu)域，并且在Pf Ferlin和Pb C2CP中發(fā)現(xiàn)了 N-末端信號(hào)肽。伯氏瘧原蟲C2CP (實(shí)施例I)
伯氏瘧原蟲含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白(C2CP)在GAP和RAS肝期的上調(diào)通過定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)使用基因特異性引物來確認(rèn)和定量。作為模板，提供在肝期(LS)發(fā)育20小時(shí)后由肝期分離的伯氏瘧原蟲GAP、RAS和WT RNA，然后將其轉(zhuǎn)錄成cDNA。圖6顯示了在GAP、RAS 和 WT LS 的 Pb C2CP 的 mRNA 的拷貝數(shù)。當(dāng)在數(shù)個(gè)預(yù)測程序(包括表位預(yù)測程序SYFPEITHI (http://www. syfpeithi.de))的幫助下檢測出四個(gè)預(yù)測的H-2b限制性CD8+ T細(xì)胞表位時(shí)，Pb C2CP作為抗原參與 者的可能性變得清晰了(圖7A)。預(yù)測的Pb C2CP的CD8+ T細(xì)胞表位A9I、T9L、S8V和A8I的氨基酸序列如表I所示。
I序列mvdi I
AYIAPHTIIA9I]41-|49
TIRSF Y KRLT9L417-42S
SPYLFNIVSiV611-671 I
_____ _ __表I :預(yù)測的Pb C2CP的CD8+ T細(xì)胞表位。為了進(jìn)行免疫學(xué)研究，按照初次免疫-兩次增強(qiáng)方案(圖7B)用GAP (uis3(-))和RAS免疫小鼠。進(jìn)行了體內(nèi)細(xì)胞毒性測定，以便了解經(jīng)GAP和RAS免疫的動(dòng)物識(shí)別并殺死表面攜帶有Pb C2CP衍生表位的細(xì)胞的能力。將四種預(yù)測的⑶8+ T細(xì)胞表位A9I、T9L、S8V和A8I的池加載在CFSE-標(biāo)記的脾細(xì)胞上，連同對(duì)照細(xì)胞群一起注入免疫小鼠內(nèi)，該對(duì)照細(xì)胞群不攜帶表位并且經(jīng)較低濃度的CFSE標(biāo)記。18小時(shí)后處死小鼠并且分離肝淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞。這些細(xì)胞中的一些直接經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，其中可在BD FACSCalibur (激發(fā)488nm,發(fā)射517nm)的FLl通道內(nèi)觀察到CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞。通過下面的數(shù)學(xué)公式計(jì)算被特異性裂解的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
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+{未技實(shí)驗(yàn)對(duì)照CFSE h, ,VCFSEl,,tt +均比位i在隨后的WT攻擊后7天經(jīng)RAS和GAP免疫小鼠的脾和肝內(nèi)被特異性裂解的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)如圖8所示。在經(jīng)免疫的小鼠的脾內(nèi)沒有檢測到特異性的細(xì)胞毒性裂解。然而，在經(jīng)RAS和GAP免疫小鼠的肝內(nèi)分別有11. 8%和19. 6%的Pb C2CP特異性細(xì)胞被裂解。這顯著高于未經(jīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)照動(dòng)物中的所述裂解，在未經(jīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)照動(dòng)物中平均少于0. 001%的熒光標(biāo)記的Pb C2CP特異性細(xì)胞被裂解。在WT攻擊小鼠中也有10. 5%的Pb C2CP特異性細(xì)胞被殺死。但是與已經(jīng)發(fā)展到血液期感染的經(jīng)免疫小鼠形成對(duì)比的是，這些小鼠之前已經(jīng)觀察到伯氏瘧原蟲野生型(WT)的肝期。這些結(jié)果證明Pb C2CP特異性細(xì)胞在經(jīng)免疫或暴露的動(dòng)物體內(nèi)被真正地識(shí)別和殺死。可以檢測到針對(duì)Pb C2CP衍生表位的免疫機(jī)制。為了更詳細(xì)地解釋RAS和GAP免疫動(dòng)物中的Pb C2CP特異性免疫應(yīng)答，用單獨(dú)的肽T9L在下面試驗(yàn)中進(jìn)行再刺激。選擇T9L是因?yàn)樗鼘?duì)H2b具有最高的預(yù)測結(jié)合親和力。對(duì)來自GAP和RAS免疫小鼠的再刺激淋巴細(xì)胞的表面活化標(biāo)記的染色表明，與未經(jīng)實(shí)驗(yàn)小鼠相比，效應(yīng)子記憶T細(xì)胞群(Tem; CD8+CD44highCD62Llw)明顯增強(qiáng)(圖9)。未經(jīng)實(shí)驗(yàn)小鼠肝中的平均Tem細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)為42. 4 %,RAS免疫動(dòng)物中顯著增加到71. 5 %，在GAP免疫動(dòng)物中顯著增加到65. I % (p < 0. 0001和p=0. 058，非配對(duì)t檢驗(yàn))。此外Tem細(xì)胞群還表達(dá)了表面標(biāo)記⑶25 (未顯示)。這進(jìn)一步表明了在經(jīng)RAS和GAP免疫的動(dòng)物中存在著針對(duì)Pb C2CP的特異性效應(yīng)子機(jī)制。ELISpot (酶聯(lián)免疫吸附劑斑點(diǎn))是一種高度敏感的測定，允許在單細(xì)胞水平上檢測細(xì)胞因子，應(yīng)用ELISpot以測量RAS和GAP免疫小鼠的肝和脾內(nèi)的低IFN-Y應(yīng)答。用Pb C2CP衍生肽T9L過夜再刺激來自免疫小鼠的純化肝淋巴細(xì)胞或總脾細(xì)胞。在將經(jīng)再刺 激的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至包被IFN- y的MultiScreen過濾板之前，用新鮮的培養(yǎng)基替換該培養(yǎng)基以稀釋培養(yǎng)上清液中分泌的IFN-Y和減少背景的干擾。在將經(jīng)刺激的細(xì)胞在過濾板上孵育24小時(shí)后，使用生物素化抗IFN-Y第二抗體檢測斑點(diǎn)。在膜上出現(xiàn)的每一個(gè)斑點(diǎn)都代表單個(gè)反應(yīng)細(xì)胞。斑點(diǎn)在解剖顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。作為來自免疫動(dòng)物的經(jīng)刺激細(xì)胞的對(duì)照是在無刺激情況下孵育的細(xì)胞和分離自未經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的細(xì)胞。陽性對(duì)照(用抗CD3抗體激活的未經(jīng)實(shí)驗(yàn)的淋巴細(xì)胞)一起進(jìn)行測試，以證實(shí)該測定是有效的。在經(jīng)GAP和RAS免疫后經(jīng)再刺激的脾細(xì)胞的IFN- y應(yīng)答非常低(圖10)。遺憾的是，抗CD3陽性對(duì)照也出乎意料地低，每百萬個(gè)總脾細(xì)胞中僅有平均168個(gè)斑點(diǎn)。然而，當(dāng)經(jīng)Pb C2CP-衍生肽T9L再刺激后，在經(jīng)GAP免疫的C57B1/6小鼠的脾中IFN- y應(yīng)答顯著提高(p = 0. 0346 ;非配對(duì)t檢驗(yàn))。純化的肝淋巴細(xì)胞的IFN- y應(yīng)答總體高于脾細(xì)胞的IFN-Y應(yīng)答，提示寄生蟲感染發(fā)生時(shí)更多的活化T細(xì)胞在肝內(nèi)。如果用Pb C2CP-衍生肽T9L特異性地再刺激來自GAP免疫動(dòng)物的肝淋巴細(xì)胞，則每百萬個(gè)細(xì)胞中檢測到622個(gè)反應(yīng)細(xì)胞，而來自經(jīng)RAS免疫的動(dòng)物,每百萬個(gè)細(xì)胞中甚至檢測到了 825個(gè)反應(yīng)淋巴細(xì)胞。作為對(duì)照，用抗CD3抗體非特異性地刺激未經(jīng)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞，導(dǎo)致每一百萬個(gè)肝淋巴細(xì)胞中平均681個(gè)反應(yīng)細(xì)胞。遺憾的是，未經(jīng)刺激的背景也相當(dāng)高，所以經(jīng)再刺激后的顯著增長僅在來自RAS免疫小鼠的肝中可檢測到(p =0. 0446 ;非配對(duì)t檢驗(yàn))。這些結(jié)果表明來自經(jīng)GAP和RAS免疫的C57B1/6小鼠的T細(xì)胞可真正地被至少一個(gè)Pb C2CP-衍生的表位所特異性地再刺激。惡件瘧原蟲Ferlin(實(shí)施例2)
在RAS肝期的惡性瘧原蟲Ferlin (Pf FER)的上調(diào)經(jīng)定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)使用基因特異性引物來證實(shí)和定量。圖IlB顯示了惡性瘧原蟲Ferlin (Pf FER)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄物水平。通過數(shù)個(gè)預(yù)測程序(包括表位預(yù)測程序SYFPEITHI (http://www. syfpeithi.de))的幫助，檢測到了六種預(yù)測的HLA-A 0201-限制性⑶8+ T細(xì)胞表位(圖11A)。為了調(diào)查在暴露于瘧疾的個(gè)體中Pf Ferlin-特異性T細(xì)胞是否存在，與BrittaUrban博士在肯尼亞醫(yī)學(xué)研究所-Wellcome Trust研究計(jì)劃(KEMRI)合作，在半免疫的肯尼亞成年人中測試了對(duì) Pf Ferlin 肽(NLLDPLVVV、YLYVNIHKI、LLLEGNFYL、KLIPVNYEL、YLYEKQQEL、ILIPSLPLI)的T細(xì)胞應(yīng)答。所有的成年人都居住在肯尼亞海岸蒙巴薩(Mombasa)以北約60公里的Junju地區(qū)(Junju District)。該地區(qū)有兩個(gè)高傳染季節(jié),但是整年都有低水平的傳染發(fā)生(每年感染性的叮咬23-53次)(Mwangi等，2005)。為了檢測活化的外周血單核細(xì)胞(PBMC)的抗原特異性IFN-Y產(chǎn)生，在暴露于瘧疾的成年人以及未暴露于瘧疾的個(gè)體進(jìn)行了為期10天的培養(yǎng)的ELISpot分析。令人感興趣的是，可檢測到活化的Ferlin特異性T細(xì)胞(圖12)。而且，當(dāng)研究12個(gè)暴露于瘧疾的成年人和5個(gè)未暴露于瘧疾的個(gè)體中活化外周血單核細(xì)胞(PBMC)的抗原特異性IFN-Y產(chǎn)生時(shí)，在12個(gè)暴露于瘧疾的成年人中的4個(gè)中檢測到針對(duì)至少一種肽的Pf Ferlin特異性T細(xì)胞，在12個(gè)暴露于瘧疾的成年人中的3個(gè)中檢測到針對(duì)多于一種肽的Pf Ferlin特異性T細(xì)胞(表2)。

Ferlin矛口 Ferlin樣蛋白的功倉定
為了功能性地鑒定伯氏瘧原蟲Ferlin(FER)和Ferlin樣蛋白(FLP)，進(jìn)行了目標(biāo)基因的缺失，因?yàn)榈玫降娜笔П憩F(xiàn)型可提示該蛋白的潛在功能。瘧原蟲目標(biāo)基因的缺失在血液期寄生蟲中進(jìn)行。因此在血液期發(fā)育中必需的基因不能作為目標(biāo)。然而，尋靶構(gòu)建體的整合失敗也可歸因于基因組基因座同源重組的可達(dá)性較差。因此，產(chǎn)生了針對(duì)Pb FER和PbFLP的敲除構(gòu)建體和互補(bǔ)構(gòu)建體，它們在相同試驗(yàn)中分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。圖13A和B顯示了不同的遺傳學(xué)策略。對(duì)于敲除尋靶構(gòu)建體，對(duì)來自各自基因的5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)的兩個(gè)片段使用特異性的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增。預(yù)期的片段尺寸經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到確認(rèn)。Pb FER片段是分別為676bp和773bp的5’和3’的UTR片段，Pb FLP片段的長度分別為678bp和612bp(未顯示)。該兩個(gè)相應(yīng)的片段被克隆到所述的尋革巴載體b3D內(nèi)，其側(cè)翼為7gDHFR/TS選擇標(biāo)記,得到了構(gòu)建體p A fer和p A fip。對(duì)于對(duì)照互補(bǔ)構(gòu)建體，包括終止子的C-末端片段以兩個(gè)部分?jǐn)U增，以插入在轉(zhuǎn)染前線性化所必需的獨(dú)特限制性位點(diǎn)。尺寸為952bp和744bp的Pb FER互補(bǔ)物以及尺寸為497bp和481bp的Pb FLP互補(bǔ)物分別再次經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到確認(rèn)(未顯示)。將兩個(gè)相應(yīng)的片段依次克隆入克隆載體b3D+內(nèi)，得到互補(bǔ)構(gòu)建體pferCONT和pflpCONT。按照描述的AMAXA轉(zhuǎn)染方案，用經(jīng)KpnI/Xbal消化的A fer和A flp構(gòu)建體，以及經(jīng)XbaI線性化的構(gòu)建體f erCONT和f IpCONT轉(zhuǎn)染伯氏瘧原蟲的ANKA GFPcon株系(Franke-Fayard, 2004)。經(jīng)轉(zhuǎn)染的裂殖子直接靜脈注射(i. v.)到NMRI小鼠體內(nèi)。轉(zhuǎn)染后第一天經(jīng)吉姆薩染色的血涂片檢查寄生蟲血癥。起始寄生蟲血癥在三個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)中都相當(dāng)?shù)?，?. 1%至0. 3%。從第一天起乙胺嘧啶經(jīng)飲用水送服給藥以選擇被轉(zhuǎn)染的寄生蟲。第二天寄生蟲血癥降低到吉姆薩染色血涂片無法檢測的水平。在連續(xù)藥物選擇下抗性寄生蟲在第7至9天首次出現(xiàn)于血中。對(duì)于A flp,經(jīng)敲除構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的抗性寄生蟲平均需9天才在薄的血涂片中出現(xiàn)，對(duì)于Afer則需8. 5天。經(jīng)互補(bǔ)構(gòu)建體pferCO NT和pflpCONT轉(zhuǎn)染的寄生蟲血癥要稍微快一些，各自小鼠的血液期陽性在轉(zhuǎn)染后平均7. 5天出現(xiàn)。一旦血液中的寄生蟲水平增長到0. 5%至1%，則處死小鼠。感染的血液存儲(chǔ)為低溫貯備液，并且將分離的寄生蟲作為基因組DNA (gDNA)的親本群保持。大約50 - 100 U I的感染血液經(jīng)腹膜內(nèi)(i.P.)轉(zhuǎn)移至未經(jīng)實(shí)驗(yàn)的NMRI小鼠中，在藥物壓力下再次監(jiān)測寄生蟲血癥。再次從感染的血液中收集即將出現(xiàn)的寄生蟲并以轉(zhuǎn)移群保存。通過特異性PCR核查了轉(zhuǎn)染子的尋靶構(gòu)建體整合(圖13C和D)。特異性的寡核苷酸對(duì)ORF I和ORF II擴(kuò)增了 Pb FER或Pb FLP可讀框的不同部分。對(duì)于敲除基因型分型PCR，由ORF I寡核苷酸擴(kuò)增的Pb FLP的DNA片段預(yù)期為978bp，Pb FER的DNA片段預(yù)期為1696bp。當(dāng)使用WT gDNA或A flp/ A fer gDNA作為PCR模板時(shí)，可在瓊脂糖凝膠上觀察到各自的條帶(圖13C)。正如所預(yù)期的，當(dāng)尋靶敲除構(gòu)建體被用作模板時(shí)，沒有ORF I特異性的DNA片段被擴(kuò)增。附加體特異性寡核苷酸對(duì)epi I和epi II擴(kuò)增載體特異性片段。因此，當(dāng)使用各自的尋靶構(gòu)建體p △ flp和p △ fer作為模板以及使用抗性轉(zhuǎn)染子A flp和p A fer (其攜帶所述質(zhì)粒)的gDNA時(shí),epi I特異性DNA條帶(對(duì)于Pb FLP和Pb FER預(yù)期的尺寸分別為1165bp和1326bp)可在瓊脂糖凝膠上檢測到。測試寡核苷酸對(duì)一測試I和測試II，證實(shí)了尋靶構(gòu)建體整合入寄生蟲基因組，并且因此僅可由陽性轉(zhuǎn)染子的gDNA來擴(kuò)增。預(yù)期的尺寸為1301bp和1557bp的測試I特異性的DNA片段不能由轉(zhuǎn)化子gDNA擴(kuò)增，提示沒有尋靶構(gòu)建體p A flp和p A fer的整合，因此各自基因Pb FLP和Pb FER無缺失。對(duì)照互補(bǔ)基因分型PCR則不同(圖13D)。當(dāng)使用野生型gDNA或轉(zhuǎn)染子fIpCONT和ferCONT的gDNA作為模板時(shí),尺寸為978bp或1068bp的ORF II特異性DNA片段可在瓊脂糖凝膠上看見，并且不能由所述CONT互補(bǔ)構(gòu)建體擴(kuò)增。僅對(duì)于轉(zhuǎn)染子的gDNA和載體對(duì)照，Epi II特異性DNA條帶可在瓊脂糖凝膠上檢測到，尺寸分別為1478bp和2196bp。對(duì)于pflpCONT的尺寸為2879bp以及對(duì)于pferCONT的4304bp的測試II特異性DNA片段證明了對(duì)照互補(bǔ)構(gòu)建體pflpCONT和pferCONT成功整合。由此可以證明兩個(gè)基因組基因座的可達(dá)性。從三個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中獲得了相同的基因型分型結(jié)果。這些結(jié)果表明伯氏瘧原蟲Ferlin和Ferlin樣蛋白是血液期發(fā)育所必需的，這些結(jié)果也通過對(duì)貫穿瘧疾生活周期中的伯氏瘧原蟲Ferlin的轉(zhuǎn)錄概況的RT-PCR分析得到證實(shí)(圖14)。在上述說明書、權(quán)利要求書和/或附圖中所披露的這些特征(獨(dú)立地和任意組合)對(duì)于以不同的方式來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明可能是很重要的。
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權(quán)利要求
1.一種用作瘧疾疫苗的肽，所述肽含有至少一種頂復(fù)蟲蛋白的抗原決定簇或表位，所述頂復(fù)蟲蛋白選自Ferlin, Ferlin樣蛋白家族的成員，以及 其它的含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白。
2.如權(quán)利要求I所述的肽，其中所述頂復(fù)蟲蛋白選自 伯氏瘧原蟲Ferlin (Pb FER)， 惡性瘧原蟲Ferlin (Pf FER)， 約氏瘧原蟲Ferlin (Py FER)， 剛地弓形蟲Ferlin (Tg FER)， 伯氏瘧原蟲Ferlin樣蛋白(Pb FLP)， 惡性瘧原蟲Ferlin樣蛋白(Pf FLP)， 約氏瘧原蟲Ferlin樣蛋白(Py FLP)， 剛地弓形蟲Ferlin樣蛋白(Tg FLP)， 伯氏瘧原蟲含C2結(jié)構(gòu)域的蛋白(Pb C2CP)，以及 與任意上述蛋白具有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%的同一丨I"生的多肽。
3.如權(quán)利要求I或2中所述的肽，其中所述抗原決定簇或表位是CD8+T細(xì)胞表位、CD4+T細(xì)胞表位或B細(xì)胞表位，優(yōu)選CD8+ T細(xì)胞表位。
4.如任意前述權(quán)利要求所述的肽，其中所述抗原決定簇或表位的氨基酸序列具有至少8個(gè)氨基酸的長度。
5.如任意前述權(quán)利要求所述的肽，其中所述頂復(fù)蟲蛋白是伯氏痕原蟲Ferlin(PbFER)，且所述抗原決定簇或表位的氨基酸序列選自 (P8L)PNPNFSYL[SEQ ID NO. I], (V8L)V P I E Y R P L[SEQ ID NO. 2],以及 (L8L)LNTCFLQL[SEQ ID NO. 3]。
6.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述頂復(fù)蟲蛋白是惡性瘧原蟲Ferlin(PfFER)，且所述抗原決定簇或表位的氨基酸序列選自 (N9V)NLLDPLVVV[SEQ ID NO. 4], (Y9I)Y L Y V N I H K I[SEQ ID NO. 5], (L9L)LLLEGNFYL[SEQ ID NO. 6], (K9L)KLIPVNYEL[SEQ ID NO. 7], (Y9L)YLYEKQQEL[SEQ ID NO. 8]，以及 (191)I L I P S L P L I[SEQ ID NO. 9]。
7.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述頂復(fù)蟲蛋白是伯氏瘧原蟲Ferlin樣蛋白(Pb FLP)，且所述抗原決定簇或表位的氨基酸序列選自 (S8L)SRYFFRAL[SEQ ID NO. 10], (L8V)LNYVYSKV[SEQ ID NO. 11], (I8M)I G Y T Y I D M[SEQ ID NO. 12]，以及(V8L*)V G T A Y I T L[SEQ ID NO. 13]。
8.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述頂復(fù)蟲蛋白是惡性瘧原蟲Ferlin樣蛋白(Pf FLP)，且所述抗原決定簇或表位的氨基酸序列選自 (T9L*)TLNPLLPffL[SEQ ID NO. 14], (I9L)I L I K S E A E L[SEQ ID NO. 15], (N9V*)NILEPYVKV[SEQ ID NO. 16], (Y9L*)YLYGGRIFL[SEQ ID NO. 17], (LlOV)LLVAFELVPV [SEQ ID NO. 18], (LlOL)LLIGTAYITL[SEQ ID NO. 19], (DlOL)DLMPIELRSL[SEQ ID NO. 20],以及 (AlOL)ALIGKCSFGL[SEQ ID NO. 21]。
9.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的肽，其中所述頂復(fù)蟲蛋白是伯氏瘧原蟲含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白(Pb C2CP)，且所述抗原決定簇或表位的氨基酸序列選自 (A9I)A Y I A P H T I I[SEQ ID NO. 22], (T9L)TIRSFYKRL[SEQ ID NO. 23], (S8V)S P Y L F N I V[SEQ ID NO. 24],以及 (A8I)A I Y R F N A I[SEQ ID NO. 25]。
10.如任意前述權(quán)利要求所述的肽，所述肽含有至少兩種頂復(fù)蟲蛋白的抗原決定簇或表位，所述頂復(fù)蟲蛋白選自Ferlin, Ferlin樣蛋白家族的成員，以及 其它的含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白。
11.如任意前述權(quán)利要求所述的肽，所述肽還含有至少一種頂復(fù)蟲蛋白的抗原決定簇或表位，其中所述頂復(fù)蟲蛋白與下述蛋白不同F(xiàn)erlin, Ferlin樣蛋白家族的成員，以及 其它的含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白。
12.如任意前述權(quán)利要求所述的肽，所述肽含有一種或多種其他成分，例如一種或多種標(biāo)記物、一種或多種N末端和/或C-末端修飾、一種或多種其它藥物或一種或多種試劑。
13.用作瘧疾疫苗的編碼至少一種如任意前述權(quán)利要求的肽的核酸分子、或含有至少一種這樣的核酸分子的質(zhì)粒。
14.針對(duì)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述肽的抗體。
15.—種組合物，其含有 (i)至少一種如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的肽， (ii)任選的載體， (iii)任選的佐劑。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其含有至少兩種如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的肽。
17.如權(quán)利要求15或16所述的組合物，其還含有至少一種含有至少一種頂復(fù)蟲蛋白的抗原決定簇或表位的肽，其中所述頂復(fù)蟲蛋白與以下的蛋白不同F(xiàn)erlin, Ferlin樣蛋白家族的成員，以及 其它的含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白。
18.如權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述載體(ii)是病毒顆?；蚱洳糠?、病毒載體或病毒顆粒的包膜蛋白、納米載體。
19.如權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述病毒顆粒是乙肝病毒顆?；蚱洳糠?。
20.如權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述納米載體是細(xì)胞靶向的納米載體。
21.如權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述佐劑(iii)通常觸發(fā)⑶8T細(xì)胞應(yīng)答，例如IC31。
22.如權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)所述的組合物，其用作瘧疾疫苗。
23.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求16-22中任一項(xiàng)所述組合物的方法，其包括混合至少兩種如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及用作疫苗的肽，所述肽含有至少一種頂復(fù)蟲Ferlin、Ferlin樣蛋白和/或另外的含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白的抗原決定簇或表位。本發(fā)明還涉及含有所述肽的組合物以及該組合物作為瘧疾疫苗的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/44GK102781958SQ201080063115
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月5日
發(fā)明者A-K.米勒, E.莫拉特 申請(qǐng)人:海德堡呂布萊希特-卡爾斯大學(xué)