用于培養(yǎng)鐵皮石斛漆斑病菌的含有特異糖源的培養(yǎng)基的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領域，特別的，屬于采用培養(yǎng)方法來培養(yǎng)鐵皮石斛漆斑病菌的 培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002] 鐵皮石斛(DendrobiumSw.)又名黑節(jié)草、云南鐵皮，是蘭科(Orchidaceae)多年生 附生草本植物，是一種珍貴的中藥材。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，具有滋陰清熱、生津 益胃、潤肺止咳、明目強身、鎮(zhèn)痛消炎的功效。同時現(xiàn)代研究表明，石斛藥材除具有本草記載 的等功效外，還具有抗腫瘤、抗輻射、抗血小板凝集及增強機體免疫力等功效。近年來石斛 藥材的需求量不斷增加，而栽培技術的不斷創(chuàng)新使得人工種植石斛的面積不斷增大，然而 隨著集中種植面積的增加，出現(xiàn)的問題也不斷增多，石斛種植出現(xiàn)多種不同的病害，例如鐵 皮石斛漆斑病。葉片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小點，后擴展為1~2mm大小的圓形 或橢圓形病斑，中間凹陷、灰白色，病健交界處似圍繞一條淡褐色至黑褐色的邊界線。葉鞘 和花梗染病后常引起休眠枝干的早衰老或頂部枯死。這不僅影響石斛的品質，也影響石斛 的產(chǎn)量，具統(tǒng)計漆斑病導致產(chǎn)量損失5%_10%。防止漆斑病的發(fā)生和擴增有助于提高石斛 生產(chǎn)的產(chǎn)量和品質，確保石斛產(chǎn)業(yè)健康有序的發(fā)展。為了研究如何防治鐵皮石斛的漆斑病， 就需要首先培養(yǎng)漆斑病來進行一些方面的研究，例如研究該病菌的生物學特性，藥效試驗 等篩選出合適的藥物進行防治。但是，這種病菌難以培養(yǎng)，而且產(chǎn)量低，為此，需要提供如何 高效率的培養(yǎng)漆斑病病菌進行相關方面的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決以上問題，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)鐵皮石斛漆斑病菌的方法，該方法包括： 提供荷葉煎汁培養(yǎng)基，其中該荷葉煎汁培養(yǎng)基的組成為:荷葉200g，蔗糖20g，瓊脂20g，添加 水至 1000ml。
[0004] 優(yōu)選的，荷葉煎汁培養(yǎng)基經(jīng)過如下過程進行制備:在煎鍋中放入1000mL蒸餾水和 200g荷葉，煮沸5min，過濾去除莖葉，加入20g鹿糖，定容至1000mL。
[0005] 優(yōu)選的，培養(yǎng)的PH值為7或8.
[0006]優(yōu)選的，培養(yǎng)的溫度為25-30攝氏度。
[0007] 優(yōu)選的，所述的鐵皮石斛漆斑病菌為露濕漆斑菌(MyrotheciumroridumTodeex Fr·) 〇
[0008] 另一方面，本發(fā)明提供荷葉煎汁培養(yǎng)基在制作培養(yǎng)鐵皮石斛漆斑病菌培養(yǎng)基中的 用途，其中所述的荷葉煎汁培養(yǎng)基由下列組分組成:荷葉200g，蔗糖20g，瓊脂20g。
[0009] 優(yōu)選的，優(yōu)選的，荷葉200g經(jīng)過如下過程進行制備:在煎鍋中放入1OOOrnL蒸餾水和 200g荷葉，煮沸5min，過濾去除莖葉，加入20g鹿糖，定容至1000mL。
[0010]優(yōu)選的，培養(yǎng)的PH值為7或8。
[0011]優(yōu)選的，培養(yǎng)的溫度為25-30攝氏度。
[0012] 優(yōu)選的，所述的鐵皮石斛漆斑病菌為露濕漆斑菌(MyrotheciumroridumTodeex Fr·) 〇
[0013] 另一方面，本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)鐵皮石斛漆斑病菌的含有特異糖源的培養(yǎng) 基，該培養(yǎng)的組成如下：氮源化合物3g，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂(MgS04 · 7H20)0.5g，氯化鉀 〇.5g，硫酸亞鐵O.Olg，糖源物質30g，瓊脂20g，添加水至1000mL，其中所述的糖源物質為鹿 糖、葡萄糖、半乳糖或菊糖。
[0014] 優(yōu)選的，糖源物質為菊糖。
[0015] 優(yōu)選的，所述的氮源化合物為L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸或硝酸 鉀。
[0016]優(yōu)選的，所述的氮源化合物為L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-色氨酸。
[0017] -種培養(yǎng)基在用于制備培養(yǎng)鐵皮石斛漆斑病菌培養(yǎng)基中的用途，其中，所述的培 養(yǎng)基的組成如下：氮源化合物3g，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂(MgS04 · 7H20)0.5g，氯化鉀0.5g， 硫酸亞鐵0. 〇lg，糖源物質30g，瓊脂20g，其中所述的糖源物質為麥芽糖、蔗糖、菊糖。
[0018] 優(yōu)選的，糖源物質為菊糖。
[0019] 優(yōu)選的，所述的氮源化合物為，L-脯氨酸。
[0020] 優(yōu)選的，所述的鐵皮石斛漆斑病菌為露濕漆斑菌(MyrotheciumroridumTodeex Fr·) 〇
[0021 ]有效效果
[0022] 通過本發(fā)明的特異培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，可以獲得優(yōu)質、大量的漆斑病菌，為研究漆 斑病菌提供了有益的材料。
[0023] 具體實施例子
[0024] 1材料與方法
[0025] 1.1鐵皮石斛漆斑病病樣采集及病原菌的分離
[0026]田間鐵皮石斛漆斑病病樣采集于浙江省樂清縣雁蕩山鎮(zhèn)的樂清鐵楓堂鐵皮石斛 基地、樂清同豐鐵皮石斛基地、樂清靈巖鐵皮石斛基地;采樣后將標樣放入保鮮袋帶回實驗 室置于5°C冰箱，待用。切取鐵皮石斛漆斑病鏡檢并用PSA培養(yǎng)基分別于進行常規(guī)組織分離 和劃線分離。
[0027] 1.2致病性測定
[0028]分別采用分離自鐵皮石斛漆斑病病樣分離物的菌絲和分生孢子液(稀釋成1X106 個/mL)，對石斛進行嫩枝活體傷口和無傷接種，在25°C的XT5401-CD275TJH智能生物人工氣 候箱內(nèi)，RH98%以上，12小時光照12小時黑暗接種后培養(yǎng)，以健康的枝條為對照，重復3次， 每天定時觀察記錄發(fā)病情況，分析致病性。
[0029] 1.3病原菌的培養(yǎng)性狀
[0030]病原菌接種于PSA上于25°C培養(yǎng)7d，記錄菌落形態(tài)，顏色;測量100個分生孢子的大 小，重復3次，記錄平均值。
[0031] 1.3.1不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛漆斑病病原菌菌絲生長及分生孢子產(chǎn)生的影響。
[0032]病原菌于25°C用下表中的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每處理重復6次，5d后測量菌落直徑，菌絲 干重、分生孢子器的產(chǎn)生情況、及其菌落色澤等。
[0033]表1:不同培養(yǎng)基的配方
[0034]
[0035] *煎汁培養(yǎng)基的準備過程：在煎鍋中放入lOOOmL蒸餾水和200g相應的物品，煮沸 5min，過濾留濾液，加入20g鹿糖，定容至lOOOmL。
[0036] 1.3.2,針對最優(yōu)選的培養(yǎng)基(荷葉煎汁），我們確定不同pH值對鐵皮石斛漆斑病菌 菌絲生長及分生孢子的影響將直徑4.Omm的菌絲塊移于pH值4-12的不同pH值的草莓煎汁培 養(yǎng)基上(pH值采用pHS-9V酸度計測量配制），置于25°C培養(yǎng)，每處理重復6次，6d后測量菌落 干重，計算分生孢子數(shù)量。
[0037] 1.3.3不同溫度對鐵皮石斛漆斑病菌菌絲生長及分生孢子的影響將直徑4.0mm的 菌絲塊移于荷葉煎汁培養(yǎng)基平板上，置于5°C，10°C，15°C，20°C，25°C，30°C，35°C不同溫度 下培養(yǎng)，每處理重復6次，6d后測量菌落直徑和分生孢子數(shù)量。
[0038] 1.3.4不同糖源對鐵皮石斛漆斑病菌菌絲生長及分生孢子的影響。
[0039]經(jīng)過我們的大量研究，發(fā)現(xiàn)，當以荷葉煎汁培養(yǎng)基來研究最佳糖源和氮源對該病 菌培養(yǎng)的影響的時候，發(fā)現(xiàn)不同的糖源對培養(yǎng)的性狀(菌落干重和產(chǎn)孢情況)并沒有實質的 差異，也就是說不同的糖源或氮源似乎起到同樣的作用，沒有實質的改善和影響，同樣，在 其他類似的培養(yǎng)基上，例如樹皮煎汁培養(yǎng)基，甘蔗煎汁培養(yǎng)基，草莓煎汁培養(yǎng)基，燕麥培養(yǎng) 基(0MA培養(yǎng)基)獲得與荷葉煎汁培養(yǎng)基類似的結果(具體數(shù)據(jù)略）。
[0040]相反，查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，再分別用甘露糖、葡萄糖、蔗糖、可溶淀粉、半乳 糖、海藻糖、甘露醇、木糖、DEAE纖維素、乙醇、核糖、果糖、山梨糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、乳 糖、麥芽糖、纖維素鈉、纖維乙糖等20種不同糖源等量置換蔗糖(含量與蔗糖一樣），于25°C 下培養(yǎng)，每處理重復6次，6d后測量菌落直徑，觀察菌落干重和產(chǎn)孢情況，獲得了不同的結 果，具體見結果分析。
[0041] 1.3.5不同氮源對鐵皮石斛漆斑病菌菌絲生長及分生孢子的影響。
[0042]以查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別用谷氨酸、谷氨酰氨、天門冬酰氨、天門冬氨酸、 甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、酪氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸、 L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-蛋氨酸、L-纈氨酸、L-色氨酸、L-丙氨酸、酪 蛋白水解物、尿素、硫酸銨、硝酸鉀、亞硝酸鈉等26種氮源等量置換硝酸鉀或硝酸鈉(質量與 硝酸鉀一樣），置于25°C培養(yǎng)，每處理重復6次，6d后測量菌落直徑，觀察菌落干重和產(chǎn)孢情 況。
[0043] 2.0結果與分析
[0044] 2.1鐵皮石斛漆斑病的癥狀
[0045]病原菌主要侵染危害葉片，以及衰老的葉鞘和花梗，衰老或休眠的莖干。葉片染病 后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小點，后小點漸漸擴大，直至1~2mm大小。病斑圓形或橢圓 形，中間凹陷、灰白色，病健交界處似圍繞一條淡褐色至黑褐色的邊界線。嚴重時，較老的葉 片上出現(xiàn)許多大小不一的病斑，一般新葉不染病。當葉鞘和花梗衰老變得灰白時易染病，染 病后在其上長出黑色小點，即病原菌的分生孢子器。衰老而灰白的葉鞘和花梗染病后常引 起衰老或休眠莖干的頂部枯死，其上有時也長出黑色小點，即病原菌的分