一株植物內(nèi)生細(xì)菌sh-1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株植物內(nèi)生細(xì)菌SH-1及其應(yīng)用，屬植物保護(hù)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的生產(chǎn)菌株變棲克雷伯菌（Klebsiella?variicola）SH-1，已于2013年8月8日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為：CCTCC?NO:M2013367。該植物內(nèi)生細(xì)菌SH-1作為制備用于防治由鏈格孢引起的煙草赤星病、甘藍(lán)黑斑病、番茄早疫病制劑的應(yīng)用。本發(fā)明具有對(duì)人、畜、農(nóng)作物安全和環(huán)境友好的特點(diǎn)，對(duì)煙草赤星病菌、甘藍(lán)黑斑病菌、番茄早疫病菌的生長(zhǎng)有顯著抑制效果，對(duì)由鏈格孢菌引起的煙草赤星病、甘藍(lán)黑斑病、番茄早疫病有顯著地防治效果。
【專利說(shuō)明】一株植物內(nèi)生細(xì)菌SH-1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一株植物內(nèi)生細(xì)菌SH-1及其應(yīng)用，屬植物保護(hù)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】:
[0002]鏈格孢，是半知菌的一個(gè)屬，是全球分布最廣，經(jīng)濟(jì)上重要的半知菌類真菌之一。95%以上的種類兼性寄生于植物上，引起多種植物病害，造成田間和產(chǎn)后巨大的經(jīng)濟(jì)損失是一些植物主要病害之一，如煙草赤星病，番茄早疫病，白菜黑斑病等都是由鏈格孢屬真菌引起。
[0003]煙草赤星病(Alternaria alternata (Fries) Keissler)是煙草上的一個(gè)重要真菌性病害，在各煙草區(qū)均有發(fā)生，該病具有潛育期短、流行速度快的特點(diǎn)，主要在大田生長(zhǎng)后期發(fā)生流行，是威脅各地?zé)熑~生產(chǎn)的一個(gè)主要病害之一。病菌以菌絲體在病殘?bào)w上越冬，翌年產(chǎn)生分生孢子，借氣流傳播進(jìn)行初侵染，種子和移栽苗也能成為田間初侵染源。受初侵染病部長(zhǎng)出分生孢子進(jìn)行再侵染。煙株有明顯的抗病階段，幼苗期較抗病，葉片在旺長(zhǎng)期至成熟期較感病。煙草赤星病發(fā)病適溫25— 30°C，雨日多、濕度大是病害流行的重要因素。種植密度大、田間通風(fēng)透光不良、采收不及時(shí)發(fā)病重，過(guò)多施用氮肥、追肥過(guò)晚、移栽遲也會(huì)發(fā)病較重。
[0004]甘藍(lán)黑斑病由半知菌亞門鏈格孢(Alternaria oleracea M.1brath)真菌所致。病菌分生孢子的萌發(fā)適溫為28 - 31°C，菌絲生長(zhǎng)適溫為25 - 27V。病菌主要以菌絲體及分生孢子在病殘?bào)w上、土壤中、采種株上以及種子表面越冬，成為田間發(fā)病的初侵染來(lái)源。分生孢子借風(fēng)雨傳播擴(kuò)大蔓延為害。土壤瘦瘠、耕作粗放、田園衛(wèi)生管理差，雜草叢生、尤其是在生長(zhǎng)中后期肥力不足，植株長(zhǎng)勢(shì)差，抗病性削弱，都能誘發(fā)病害的流行。
[0005]番茄早疫病又稱 為“輪紋病”，在番茄上普遍發(fā)生。早疫病是由茄鏈格孢菌(Alternaria solani)侵染所致,菌絲可在1_45°C的廣泛溫度范圍中生長(zhǎng),在26 — 28°C時(shí)，生長(zhǎng)最快。侵入寄主后，2 — 3天就能形成病斑。形成病斑后3 — 4天，在病斑上就能形成大量的分生孢子。由此而進(jìn)行多次重復(fù)再侵染。肥力差、管理粗放的地塊發(fā)病重。另外土質(zhì)粘重者比土質(zhì)砂性強(qiáng)的地塊發(fā)病重。
[0006]目前對(duì)有鏈格孢引起的病害防治方法使用化學(xué)藥劑，如紋枯利、多菌靈、多抗霉素、菌核凈及撲海因、百菌清等。長(zhǎng)期施用這類化學(xué)藥品，病原產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治效果差，甚至難以控制病原菌危害與發(fā)展。另外過(guò)多施用化學(xué)藥劑，造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，對(duì)人畜極不安全，甚至直接危害非靶標(biāo)微生物，直接影響生態(tài)環(huán)境。而生物防治對(duì)煙草及蔬菜安全生產(chǎn)及可持續(xù)性發(fā)展具有極大的應(yīng)用前景，是有前途的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007]本發(fā)明的在于提供一株植物內(nèi)生細(xì)菌SH-1及其應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的生產(chǎn)菌株變棲克雷伯菌SH-1 (Klebsiella variicola SH-1),已于2013年8月8日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為:CCTCC N0:M2013367o保藏單位地址:武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0009]本發(fā)明的植物內(nèi)生細(xì)菌SH-1作為制備用于防治由鏈格孢引起的煙草赤星病、甘藍(lán)黑斑病、番茄早疫病制劑的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的植物內(nèi)生細(xì)菌SH-1，用常規(guī)方法分離自鐵皮石斛莖桿，經(jīng)形態(tài)、生理生化特征鑒定及16S rDNA序列分析，確定SH-1克雷伯氏菌屬變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:具有對(duì)人、畜、農(nóng)作物安全和環(huán)境友好的特點(diǎn)；對(duì)煙草赤星病菌、甘藍(lán)黑斑病菌、番茄早疫病菌的生長(zhǎng)有顯著抑制效果；對(duì)由鏈格孢菌引起的煙草赤星病、甘藍(lán)黑斑病、番茄早疫病有顯著地防治效果。
【具體實(shí)施方式】:
[0012]一、菌株的獲得
[0013]本發(fā)明菌株的獲得方法為常規(guī)方法，具體如下:
[0014]新鮮鐵皮石斛莖桿采自德宏，滅菌水洗凈晾干后切成小段(Icm)，用70%乙醇表面消毒5min，然后滅菌水漂洗3次，采用無(wú)菌操作技術(shù)縱向剖開(kāi)莖桿，將剖開(kāi)的莖桿置于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)7天，取培養(yǎng)所得的菌液lmL，加到盛有9mL無(wú)菌水的試管中，30°C搖床振蕩培養(yǎng)20min,制成樣品懸浮液。取ImL懸浮液加入盛有9mL無(wú)菌水的試管中進(jìn)行10倍系列稀釋，選擇10_5 -1O-7的稀釋液分別取0.1mL,在PDA平板上采用稀釋涂布法分離純化，30°C培養(yǎng)12-24h，挑取菌落形態(tài)不同的單菌落于PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)并保存?zhèn)溆谩?br> [0015]篩選:將病原接種在PDA培養(yǎng)基平板中心，用已分離純化出的細(xì)菌做成菌懸液，取IOOuL菌懸液置于中心四周 ，28°C培養(yǎng)觀察對(duì)峙培養(yǎng)抑菌情況。將抑制效果明顯的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)、生理生化鑒定和16S rDNA分析。
[0016]形態(tài)鑒定:LB固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)細(xì)菌，觀察菌落形態(tài)、菌體形態(tài)。
[0017]生理生化鑒定:參照常用細(xì)菌鑒定手冊(cè)，采用吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)等對(duì)分離出的細(xì)菌進(jìn)行生理生化檢測(cè)。
[0018]16S rDNA序列測(cè)定:采用CTAB/NaCl法提取SH-1基因組DNA。用于擴(kuò)增的引物為 16S rDNA 擴(kuò)增通用引物，27F:5 ' -AGAGTTTTATCNTGGCTCAG-3 '和 1492R:5 ' -GGYTACCTTGTTACGACTT-3 '。擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物有上海生工測(cè)序，測(cè)得的序列與Genbank中已有的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)。
[0019]表1.SH-1菌株鑒定的形態(tài)及生理生化特征
[0020]
【權(quán)利要求】
1.一株植物內(nèi)生細(xì)菌SH-1，特征在于生產(chǎn)菌株變棲克雷伯菌SH-1 (Klebsiellavariicola SH_1 )，已于2013年8月8日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為:CCTCCN0:M2013367o
2.權(quán)利要求1所述的一株植物內(nèi)生細(xì)菌SH-1的應(yīng)用，其特征在于該植物內(nèi)生細(xì)菌SH-1作為制備用于防治由鏈格孢引起的煙草赤星病、甘藍(lán)黑斑病、番茄早疫病制 劑的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/22GK103484399SQ201310383464
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月29日
【發(fā)明者】李祖紅, 曾嶸, 文國(guó)松, 趙明富, 林選知, 張瑞勤 申請(qǐng)人:云南省煙草公司曲靖市公司, 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)