一種簡易的微流控芯片及細(xì)胞分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種用于細(xì)胞學(xué)分析的簡易微流控芯片及細(xì)胞分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞是生命體結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)單元，細(xì)胞增殖、分化、迀移和代謝等行為與胚胎發(fā)育、血管新生、組織修復(fù)、免疫防御、以及腫瘤發(fā)生等重要生理病理過程都密切相關(guān)，因此，對(duì)細(xì)胞的研究是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)。
[0003]近年來，有報(bào)道將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞研究，給細(xì)胞研究提供了新的方法和平臺(tái)。微流控芯片為細(xì)胞研究提供新的技術(shù)平臺(tái)，其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)包括:與細(xì)胞相似的微流體通道尺寸；有效細(xì)胞微環(huán)境控制及細(xì)胞體內(nèi)微環(huán)境模擬；減低分析試劑消耗；具備高通量和高內(nèi)涵分析潛力；系統(tǒng)化集成等?；谏鲜鰞?yōu)勢(shì)，微流控芯片分析技術(shù)已在細(xì)胞生長和分化、細(xì)胞趨化、細(xì)胞迀移和細(xì)胞藥物篩選等領(lǐng)域展開。
[0004]然而，微流控芯片研究中涉及的相關(guān)技術(shù)對(duì)于無相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的普通生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室仍是挑戰(zhàn)。如現(xiàn)有微流控芯片大多是利用軟光刻法加工制作微流控芯片，其制作過程較為繁復(fù)且需要借助一些昂貴、高精度的儀器來完成。例如:其掩膜的制作需借助高精度膠片打印機(jī)來完成；利用SU-8負(fù)性光刻膠光刻制作陽模的過程相當(dāng)復(fù)雜、繁瑣；大多數(shù)的芯片必須借助等離子表面處理器鍵合來完成封裝；芯片灌膠必須借助精密儀器來完成等。而且此類芯片清洗困難，往往只能一次性使用，在一定程度上增加了實(shí)驗(yàn)成本。這些都使微流控芯片在大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用受到了很大范圍的限制。又如微流控芯片上成功的細(xì)胞培養(yǎng)是進(jìn)行細(xì)胞分析的基礎(chǔ)，其技術(shù)關(guān)鍵為細(xì)胞在空間受限的微通道內(nèi)培養(yǎng)時(shí)營養(yǎng)物質(zhì)提供。微通道內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)主要采用灌注式培養(yǎng)，即通過外圍流體灌注設(shè)備使細(xì)胞培養(yǎng)液持續(xù)在微通道內(nèi)流動(dòng)，從而為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)并將細(xì)胞代謝廢物移除。然而，培養(yǎng)液流動(dòng)產(chǎn)生流體剪切力將對(duì)細(xì)胞造成一定的損傷，同時(shí)微流控芯片與外圍液路的接口問題使細(xì)胞培養(yǎng)操作變得復(fù)雜。微通道內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)另一種方式是采用靜態(tài)培養(yǎng)，靜態(tài)培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)最常使用的方式，該方法雖不對(duì)細(xì)胞造成損傷，但將靜態(tài)培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用在空間受限的微通道內(nèi)，僅通過擴(kuò)散作用細(xì)胞常常不能獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)。
[0005]為此，基于上述微流控芯片加工、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞響應(yīng)分析的三大技術(shù)難點(diǎn)，本發(fā)明發(fā)展一種簡易且易于在普通生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室開展的微流控芯片及細(xì)胞分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明首先提供了一種簡易微流控芯片，該芯片相對(duì)于現(xiàn)有微流控芯片更易被普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用加工和進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞分析的操作。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0008]—種簡易微流控芯片，其特征在于，包括基底層和位于所述基底層上的細(xì)胞培養(yǎng)層，所述細(xì)胞培養(yǎng)層上設(shè)置有位于同一平面的儲(chǔ)液池，所述細(xì)胞培養(yǎng)層上還設(shè)置有微通道，至少兩個(gè)儲(chǔ)液池的底部由微通道連通。
[0009]進(jìn)一步，所述的一種簡易微流控芯片，所述微通道為直微通道。
[0010]進(jìn)一步，所述的一種簡易微流控芯片，由微通道連通的儲(chǔ)液池大小相同。
[0011]進(jìn)一步，所述的一種簡易微流控芯片，所述微通道的寬度最低為30 μπι，深度為30 μ m-200 μ mD
[0012]進(jìn)一步，所述的一種簡易微流控芯片，所述基底層為玻璃，所述細(xì)胞培養(yǎng)層為PDMS材質(zhì)。聚二甲基娃氧燒(Polydimethylsiloxane，PDMS)是一種廣泛應(yīng)用于微流控等領(lǐng)域的聚合物材料。其是一種高分子有機(jī)硅化合物，具有無毒性、高透氣性、透光性良好、生物相容性佳、易與多種材質(zhì)室溫接合等特點(diǎn)。此外，其成本低，使用簡單，且有極佳的可塑性、熱穩(wěn)定性和化學(xué)惰性。由于以上顯著優(yōu)點(diǎn)，使其成為目前微流控芯片制作使用最多的聚合物材料，也常用于芯片封裝、微流道、微混合器、微栗浦、微閥門等元件制作等領(lǐng)域。
[0013]進(jìn)一步，所述的一種簡易微流控芯片，所述儲(chǔ)液池與基底層連通。
[0014]微流控芯片的快速加工是開展微流控芯片分析的基礎(chǔ)，因此，本發(fā)明還提供了一種快速加工微流控芯片的方法，該方法采用感光干膜代替了液態(tài)的光刻膠作為芯片陽模。
[0015]芯片陽模是微流控芯片加工的關(guān)鍵，傳統(tǒng)軟光刻工藝中主要采用液態(tài)SU-8光刻膠為基礎(chǔ)，在潔凈空間通過光刻技術(shù)加工而成。該技術(shù)主要缺點(diǎn)在于需要昂貴的儀器設(shè)備、及嚴(yán)格操作流程，在一定程度上限制了大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室對(duì)該技術(shù)的應(yīng)用。因此，本發(fā)明提供一種采用低成本的感光干膜替代液態(tài)光刻膠的制備方法，不但降低了微流控芯片加工成本和難度，同時(shí)不需要額外解決空間和大型設(shè)備，更易被普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用加工。
[0016]感光干膜作為一種光聚合物材料主要應(yīng)用于印刷板電路板工藝。相對(duì)于液體光刻膠，感光干膜具有諸多優(yōu)勢(shì)，如良好的適應(yīng)性，基材粘附性、平整性、感光材料均勻分布性、低曝光功耗及低成本。更為重要的是，感光干膜光刻不需要超潔凈空間和昂貴的光刻設(shè)備，作為液態(tài)光刻膠的替代物還可應(yīng)用在微流體通道加工、電鑄模具等。利用感光干膜制備微流控芯片可參考任何現(xiàn)有文獻(xiàn)。而在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，加工流程示意圖如圖4(A)所示，具體方法為:首先將三層感光干膜通過覆膜機(jī)依次層壓在玻璃板上使感光層厚度約為100 μ m，將微通道圖案通過愛普生噴墨打印機(jī)打印在透明膠片上制成光掩膜，紫外線透過光掩膜對(duì)感光干膜照射70s，1 %碳酸鈉顯影制成微通道陽模；將PDMS基質(zhì)和固化劑按重量10:1混合而成的預(yù)聚物澆鑄在微通道陽模上，抽真空除氣泡，60°C下固化3h。將固化后的PDMS基片從感光干膜陽模上剝離，利用平頭打孔器(直徑5mm)在微通道兩側(cè)打孔形成儲(chǔ)液池，氧等離子表面處理(30w，lmin)與載玻片進(jìn)行不可逆鍵合，形成玻璃-PDMS復(fù)合微流控芯片。
[0017]與傳統(tǒng)加工工藝比較而言，本發(fā)明采用一種低成本的感光干膜作為液態(tài)光刻膠的替代，不但降低了微流控芯片加工成本和難度，同時(shí)不需要額外解決空間和大型設(shè)備，更易被普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用加工。同時(shí)，在沒有配置專業(yè)設(shè)備的基礎(chǔ)上，利用該方法能夠加工的微通道寬度最低為50 μ m，深度范圍為30 μ m-200 μπι。同時(shí)，為簡化芯片結(jié)構(gòu)復(fù)雜度，避免引入外圍的灌流設(shè)備，本發(fā)明設(shè)計(jì)的微流控芯片由儲(chǔ)液池和微通道組成，儲(chǔ)液池內(nèi)的液體樣品在靜水壓作用下進(jìn)入微通道。
[0018]本發(fā)明的目的還在于提供一種利用上述設(shè)計(jì)的簡易微流控芯片進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及分析的方法，該方法是一種間歇性細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)分析方法，通過該方法，不但能夠?yàn)榧?xì)胞提供足夠營養(yǎng)物質(zhì)，避免損傷生長中的細(xì)胞，而且僅僅通過對(duì)儲(chǔ)液池的液體更換就能夠完成微流體操作和細(xì)胞培養(yǎng)，降低實(shí)驗(yàn)難度。
[0019]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0020]基于上述的一種簡易微流控芯片進(jìn)行間歇性細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)分析方法，包括如下進(jìn)行的步驟:
[0021](1)將簡易微流控芯片進(jìn)行消毒，然后采用人層粘連蛋白溶液對(duì)微通道進(jìn)行修飾；
[0022](2)將細(xì)胞懸液滴加至微通道的入口處，在毛細(xì)管作用力下細(xì)胞進(jìn)入微通道內(nèi)，然后在微通道一側(cè)的儲(chǔ)液池中注滿細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)液在重力作用下持續(xù)進(jìn)入微通道并流向另一側(cè)的儲(chǔ)液池中，每隔一定時(shí)間將微通道兩側(cè)