一種用于治療前列腺癌的二萜類化合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從干燥的貓爪草中分離得到的一種二萜類化 合物，含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 貓爪草RanunculiTernatiRadix為毛茛科植物小毛茛Ranunculusternatus Thunb.的干燥塊根。本品呈紡錘形，多5~6個(gè)簇生，形似貓爪，長(zhǎng)3~10mm，直徑2~3mm，頂端 有黃褐色殘莖或莖痕。表面黃褐色或灰黃色，久存色澤變深，微有縱皺紋，并有點(diǎn)狀須根痕 和殘留須根。質(zhì)堅(jiān)實(shí)，斷面類白色或黃白色，空心或?qū)嵭模坌?。氣微，味微甘。貓爪草別名三 散草(浙江）、貓爪兒草(河南）、貓爪子(河南）、鴨腳板(安徽）、金花草(廣西）。貓爪草性溫， 味甘、辛，入肝、肺經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止咳祛痰等功效，臨床用于治療肺結(jié)核、淋 巴結(jié)結(jié)核、咽喉炎、瘧疾等癥。民間用貓爪草治療淋巴結(jié)核，不論結(jié)核大小或是否化膿均有 較好的療效。近年來(lái)因其有較好的抗腫瘤效果而成為研究熱點(diǎn)。
[0003]近年來(lái)針對(duì)貓爪草化學(xué)成分的研究較少，其主要含有黃酮類及苷類、生物堿、揮發(fā) 油、有機(jī)酸等化合物。
[0004]據(jù)報(bào)道，貓爪草煎劑治療淋巴結(jié)核180例，其有效率達(dá)100%，臨床治愈率73.9%; 其注射液對(duì)小鼠S180、S37癌株有抑制作用其煎劑對(duì)痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄 球菌、四聯(lián)球菌等均有顯著抑制作用。另有報(bào)道貓爪草能誘生腫瘤壞死因子(TNF)。腫瘤壞 死因子是一組具有抗腫瘤、抗病毒、參與多種免疫調(diào)節(jié)過程的球蛋白，由于它能特異性地殺 死腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常組織細(xì)胞無(wú)不良影響，從而起到腫瘤免疫和腫瘤治療的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種從干燥的貓爪草中分離得到的一種二萜類化合物，含其 的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0007]具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I):
[0009]所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將干燥的貓爪草粉碎，用70 ~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的 正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中乙酸 乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫8個(gè)柱體積， 收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用 正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、50:1、25 :1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得 至IJ5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為15:1、10:1和5:1 的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相 硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個(gè)柱體積洗脫液，洗 脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟(a)中，用75%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0011] 進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0012] -種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物（I)和藥學(xué)上可接受的載 體。
[0013] 所述的化合物(I)在制備治療前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0014]所述的藥物組合物在制備治療前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0016]該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì) 人和動(dòng)物無(wú)毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0017]所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無(wú)菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0019] 圖2為化合物⑴計(jì)算ECD和實(shí)驗(yàn)ECD圖；
[0020] 圖3為不同濃度化合物（I)作用72h后PC3和DU145存活率；
[0021 ]圖4為10.Omg/L化合物（I)作用不同時(shí)間后PC3和DU145存活率。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0023] 主要材料、試劑來(lái)源及儀器類型：
[0024]乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限 公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0025]實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0026] (a)干燥的貓爪草（10kg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提取(30LX3次），合并提取液， 濃縮至無(wú)醇味(6L)，依次用石油醚(6LX3次）、乙酸乙酯(6LX3次)和水飽和的正丁醇(6LX 3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(381g)和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫8 個(gè)柱體積，收集70 %洗脫液，減壓濃縮得70 %乙醇洗脫濃縮物（131g);(c)步驟(b)中70 %乙 醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1 (8個(gè)柱體積）、50:1 (8個(gè)柱體積）、25:1 (8個(gè)柱體積）、10:1(10個(gè)柱體積)和1:1(8個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組 分；（d)步驟(c)中組分4(27g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為15:1(8個(gè)柱體積）、 10:1(8個(gè)柱體積)和5:1(6個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d) 中組分2(18g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的甲醇水溶液 等度洗脫，收集8~12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)(230mg)。
[0027] 結(jié)構(gòu)確證：白色無(wú)定形粉末;冊(cè)43頂3顯示[1+似]+為111/2 513.1702，結(jié)合核磁特 征可得分子式為C25H3QO1Q，不飽和度為11。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)3h(ppm，DMS0_d6，600MHz):H-1 (5.19，s)，H-3(2.41，m)，H-3(2.16，m)，H-6(5.25，s)，H-8(2.82，m)，H-9(2.61，t，J=12.0)， H-ll(1.35，m)，H-ll(1.99，m)，H-15(5.93，s)，H-17(5.54，d，J=1.8)，H-17(5.32，d，J= 1.8)，H-18(1.01，s)，H-19(1.01，s)，H-20(l.ll，s)，l-0Ac(2.04，s)，6-0Ac(2.14，s)，12-OCH3(3 · 02，s)，5-0H( 2 · 89，br，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)(ppm，DMS〇-d6，125MHz): 81 · 7(CH， C)，48.1(CH，8-C)，36.5(CH，9-C)，43.8(C，10-C)，35.4(CH2，11-C)，116.6(C，12-C)，166.0 (C，13-C)，139.4(C，14-C)，115.1(CH，15-C)，169.3(C，16-C)，115.7(CH2，17-C)，30.2(CH3， 18-C)，24.3(CH3，19-C)，16.4(CH3,20-C)，168.8(C3-0Ac)，20.7(CH3，1-0Ac)，172.1(C，6-OAc)，21 · 7(CH3，6-0Ac)，49 · 6(CH3，12-OCH3);碳原子標(biāo)記參見圖 1。13CNMR譜和DEPT譜顯示 有25個(gè)碳信號(hào)，其中包括六個(gè)甲基(一個(gè)甲氧基），三個(gè)亞甲基(一個(gè)烯烴亞甲基），五個(gè)次甲 基(一個(gè)烯屬次甲基，兩個(gè)含氧次甲基），以及十一個(gè)季碳(兩個(gè)烯烴碳，五個(gè)羰基碳，兩個(gè)含 氧季碳hIR譜表明該化合物含有羥基和羰基(3510和1740CHT1)基團(tuán)，此外其在218nm處有最 大紫外吸收，表明該化合物含有α，β_不飽和丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。烯烴質(zhì)子信號(hào)δΗ5.93(H_15， s)和位于低場(chǎng)的碳信號(hào)3(：166.0((：-13)，115.1((：-15)和169.3((：-16)也證實(shí)了這一結(jié)構(gòu)的 存在。另外結(jié)合三個(gè)甲基信號(hào)6!11.01(出-18,8)，1.01(出-19,8)和1.11(出-20,8)，表明該化 合物是一個(gè)含有丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)單元的四環(huán)二萜類化合物。HMBC譜中，Η-1(δΗ5.19，?〇與-<^0〇13(3(：168.8);!1-6(3!15.25,8)與-(^0〇13(3(：172.1) ;12-0〇13(3!13.02,8)與(：-12(3 C116.6)的相關(guān)性表明C-1和C-6位連有乙酰氧基，C-12與甲氧基相連。在HSQC和HMBC譜中， 質(zhì)子信號(hào)狃5.54((1，1=1.8他)和5.32((1，1=1.8抱）與碳信號(hào)0(：115.7，(：-17)直接相連，以 及與C-14(SC139.4)和C-13(SC166.0)長(zhǎng)距離的相關(guān)性，表明C-14和C-17之間連有雙鍵。綜 合氫譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如 圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過E⑶試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。
[0028]實(shí)施例2:化合物（I)藥理作用試驗(yàn) [0029] 一、材料和儀器
[0030] 前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3(ArCC-CRL-1435)、前列腺癌細(xì)胞株DU145(ATCC-HTB-81)?；?合物⑴自制，HPLC歸一化純度大于98%，用二甲基亞礬(DMS0)配制成濃度為1.0g/L的儲(chǔ)存 液備用。CCK-8試劑盒為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。胎牛 血清(FBS)購(gòu)自Hyelone公司。青/鏈霉素為上海先鋒藥業(yè)產(chǎn)品。胰蛋白酶購(gòu)自華美生物工程 公司。二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自上海華舜生物工程公司。瓊脂(Agarose)、二硫蘇糖醇(DTT)、 苯甲基磺酞氟(PMSF)、四甲基乙二胺(TEMED)為Sigma公司產(chǎn)品。十二烷基磺酸鈉(SDs)、三 氯甲基烷基甲燒(1'1^8)1'1^8-!1(31、1'1'；[1：01^-100為?1'0