專利名稱：檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的核苷酸序列和試劑盒的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及基于TaqMan水解探針熒光RT-PCR檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的核苷酸序列和試劑盒，不僅適用于豬組織樣本中豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的準確檢測，還可適用于豬活體樣本(主要為拭子樣品)中豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的檢測，可用于動物豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的篩查、出入境檢疫等，屬于檢驗檢疫領域。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(porcine!^productive and respiratory syndrome,PRRS)是危害當今養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。豬繁殖與呼吸綜 合征的控制一直是養(yǎng)豬生產(chǎn)國家所面臨的艱巨任務，即使在養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的美國及西歐國家，也是一大難題。在我國，PRRS的危害也日益嚴重，自1995年傳入至今，我國幾乎所有的省市都時有PRRS的發(fā)生。歷年來的流行病學和血清學調(diào)查結(jié)果表明，在我國豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的感染率非常高。PRRSV還是豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)的一個主要原發(fā)性病原。在飼養(yǎng)管理水平低、衛(wèi)生條件差的豬場，常與PCV2、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌、豬偽狂犬病毒、豬附紅細胞體、鏈球菌等混合或繼發(fā)感染，這樣的豬群死亡率高，且多數(shù)豬場伴發(fā)母豬繁殖障礙。在PRRS暴發(fā)中或暴發(fā)后，不少豬場的種豬和成年豬繼發(fā)弓形體病，呈暴發(fā)性、地方性流行或散發(fā)性發(fā)生。2006年，我國爆發(fā)的“豬高熱綜合癥”給養(yǎng)殖業(yè)帶來災難性的打擊，現(xiàn)已經(jīng)查明主要病因是蘭耳病高變異毒株。PRRSV在造成嚴重經(jīng)濟損失的同時也給疾病防疫帶來巨大困難。PRRSV感染后引起的病理及組織學變化往往不易與其他傳染病區(qū)分，因此PRRS的確診必須依賴于實驗室手段。目前本病的檢測方法主要包括病毒分離鑒定，血清學檢測方法以及分子生物學檢測方法。其中病毒分離方法需要時間長，對病料要求高，因此不利于大量臨床樣品的快速診斷。檢測病毒的血清學方法有熒光抗體染色和免疫酶測定技術(shù)。這些檢測方法技術(shù)性較強，操作煩瑣，也不適用基層診斷和大規(guī)模的流行病學調(diào)查。隨著分子生物學的發(fā)展，PCR技術(shù)已被廣泛應用于臨床樣品的診斷，檢測的目標通常是針對PRRSV基因組的保守區(qū)0RF7，0RF6或ORFlb。PCR技術(shù)直接檢測臨床樣品中PRRSV的基因組RNA，省去了細胞培養(yǎng)和病毒分離的過程，所以比病毒分離省時，且敏感性要高于病毒分離，特異性也非常高。可用于PCR檢測的樣品包括血清、精液、肺組織以及胎兒。PCR方法可以在較短時間內(nèi)得到結(jié)果(24h 48h)。國內(nèi)外很多學者都建立了檢測PRRSV的RT-PCR方法或套式RT-PCR檢測方法。PCR方法在PRRS診斷以及群體監(jiān)測上可以發(fā)揮很大作用，比如用于后備種豬的篩選，持續(xù)性感染豬的診斷以及用于豬群的凈化工作。熒光定量PCR檢測技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新技術(shù)，與傳統(tǒng)診斷方法比較具有很多突出的優(yōu)點，引物與探針可以大量合成并長期保存，檢測速度快(僅需2 4h)，結(jié)果可靠，不易污染，避免散毒，而且敏感性要高于常規(guī)的PCR檢測方法，通過探針設計還能區(qū)分不同的毒株亞型，因而具有廣闊的應用前景。在本研究中，我們采用TaqMan熒光RT-PCR方法建立了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的檢測技術(shù)，對反應的各種條件進行了優(yōu)化，其中包括引物探針的篩選，Mg2+使用濃度的優(yōu)化，引物探針濃度的優(yōu)化。建立了靈敏、特異，能夠應用于臨床樣品的診斷和檢測的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一組特異性強、靈敏度高的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的核苷酸序列，包括引物序列和TaqMan水解探針序列。本發(fā)明的另一個目的是提供快速、準確、使用方便的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)檢測試劑盒。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案選擇美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒N基因和3’端非編碼區(qū)的特定序列作為靶區(qū)域，在多重序列比對的基礎上，進行引物和探針設計。引物長度為20個堿基左右，GC含量為50% -60%，引物內(nèi)無二級結(jié)構(gòu)和重復性，引物間和引物內(nèi)無互補序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5°C。探針的長度在25個堿基左右，采用TaqMan修飾，并標記熒光基團。一組檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的核苷酸序列，如下I) 5’ -GCATGATGGGCTGGCATTC-3’ (SEQ ID NO 1)2) 5，-CCCACACGGTCGCCCTAAT-3，(SEQ ID NO 2)3) 5’ -[FAM]-ATGTGTGGTGAATGGCACTGATTGACA-[TAMRA 或BHQl]-3’ (SEQ ID NO:
3)其中序列I)和2)分別為檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的正義引物和反義引物，序列3)為檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的TaqMan修飾的熒光探針，探針的5’端標記報告熒光基團FAM (6-carboxy-熒光素)，3’端標記淬滅基團TAMRA或BHQl。我們采用TaqMan熒光RT-PCR檢測技術(shù)建立了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)檢測方法，對反應的各種條件進行了優(yōu)化，其中包括引物探針的篩選，Mg2+使用濃度的優(yōu)化，引物探針濃度的優(yōu)化，得到以下試劑盒。由于使用RT-PCR固體酶顆粒體系與使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV+Taq酶體系都能檢測出豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)，所以兩種體系均可以應用于檢測。使用RT-PCR固體酶顆粒體系成本較高但操作簡單，使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV+Taq酶體系操作較復雜但成本比較低?？梢愿鶕?jù)需要，選擇檢測試劑盒的組成。本發(fā)明提供一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)檢測試劑盒A，由以下組分組成I)裂解液購自INVITR0GEN公司；2) RT-PCR反應液，表I為反應液配方；表I反應液配方
權(quán)利要求
1.一組檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 3所示，其中序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2分別為檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的正義引物和反義引物，序列SEQ ID N03為檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的熒光探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的核苷酸序列，其特征在于所述探針序列SEQ ID NO 3的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團 TAMRA 或 BHQI。
3.—種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的試劑盒，其特征在于，由以下組分組成 1)裂解液； 2)RT-PCR反應液，包括PCR緩沖液、RT緩沖液、MgCL2、dNTP、正義引物、反義引物和熒光探針； 3)反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV； 4)Taq DNA聚合酶； 5)DEPC 7jC ； 6)陰性對照豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)陰性豬組織樣品； 7)陽性對照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對應的DNA序列為序列表SEQIDNo. 4所示的核苷酸序列； 其中，正義引物為序列表SEQ ID No. I所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，其5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團TAMRA或BHQl。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR反應液中各成分使用終濃度為O. 5XPCR緩沖液、O. 5XRT緩沖液、3. OmM MgCL2、0. 2mM dNTP、0. 2 μ M正義引物、O. 2 μ M反義引物和O. I μΜ熒光探針。
5.一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的試劑盒，其特征在于，由以下組分組成 1)裂解液； 2)RT-PCR反應液，包括=MgCL2、正義引物、反義引物和熒光探針； 3)RT-PCR酶顆粒； 4)Taq DNA聚合酶； 5)DEPC 7jC ； 6)陰性對照豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)陰性豬組織樣品； 7)陽性對照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對應的DNA序列為序列表SEQIDNo. 4所示的核苷酸序列； 其中，正義引物為序列表SEQ ID No. I所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，其5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團TAMRA或BHQl。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR反應液中各成分使用終濃度為3. O mM MgCl2、0. 2 μ M正義引物、O. 2 μ M反義引物和O. I μ M熒光探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的核苷酸序列和試劑盒，該檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1至SEQIDNO3所示，其中序列SEQIDNO1和SEQIDNO2分別為檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的正義引物和反義引物，序列SEQIDNO3為檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的熒光探針。本發(fā)明進一步公開了含有上述引物的檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美洲型)的試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒具有快速、靈敏、特異、穩(wěn)定、重復性好的特點。
文檔編號C12Q1/70GK102719565SQ201210213870
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月25日
發(fā)明者張向東, 李?；? 杜小迪, 楊丙田, 葛思娟 申請人:北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司