胸膜肺炎放線桿菌血清4型pcr檢測用引物及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及胸膜肺炎放線桿菌血清4型檢測用引物及其檢測試劑盒，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬傳染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎 放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一種豬傳染性呼吸道疾病，給 世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病于1957年由Pattison等首次報道，此后逐漸擴 散，目前已遍布世界各地。我國于1987年首次報道本病的臨床病例，近年來發(fā)病率日益增 尚。
[0003] 根據(jù)莢膜多糖和菌體脂多糖的不同，APP至少可以分成15個血清型（1 一 15)，血 清5型又分為S5a和S5b 2個亞型。不同國家流行的血清型不同。在我國，流行的APP血 清型較多，已分離到1、2、3、4、5、7、8、9和10型。各血清型之間毒力不同，相互之間交叉保 護(hù)性也很低。對血清型的準(zhǔn)確鑒定，可更針對性地預(yù)防和控制豬傳染性胸膜肺炎。
[0004] 目前對APP的分型的常用方法有凝集試驗和PCR方法。凝集試驗需要各個血清型 的特異抗血清，且有的血清型之間有交叉反應(yīng)，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些都限制了這個方法 在一般實驗室的應(yīng)用。而PCR方法因具有更高的可操作性、敏感性和特異性，應(yīng)用更廣泛。
[0005] 目前已經(jīng)有針對APP血清1、2、3、5、7、8、10型的PCR檢測方法的報道，但國內(nèi)外尚 無檢測APP血清4型的PCR方法。建立能夠快速而特異的檢測APP血清4型的PCR檢測方 法勢在必行。
[0006] 因此，基于以上的研究和當(dāng)前的需求，申請人根據(jù)胸膜肺炎放線桿菌血清4型莢 膜多糖合成基因，設(shè)計并合成了 1對檢測胸膜肺炎放線桿菌血清4型的引物，采用PCR方法 擴增APP CPS4C基因，通過擴增片段的數(shù)量和分子量大小，來判定是否含有胸膜肺炎放線桿 菌血清4型，從而特異、敏感、省時、省力、低成本地檢測胸膜肺炎放線桿菌血清4型。該技 術(shù)不僅可從細(xì)菌培養(yǎng)物，也能直接從病料中檢測胸膜肺炎放線桿菌血清4型，可用于分子 流行病學(xué)調(diào)查、疫病診斷及疫苗菌株的篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)問題
[0008] 本發(fā)明的目的在于提供胸膜肺炎放線桿菌血清4型檢測用引物及其試劑盒。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] 胸膜肺炎放線桿菌血清4型PCR檢測用引物，包括
[0011] APP-CPS4CF(SEQ ID NO. 1) :5, -GCTAGAAATGGCAAATGAAA-3,；
[0012] APP-CPS4CR(SEQ ID NO. 2) :5' -CTGGACGAGTAATAAATGAA-3' ；
[0013] 該引物能從胸膜肺炎放線桿菌血清4型菌株提取的基因組DNA中擴增出653bp DNA片段。該引物能在制備胸膜肺炎放線桿菌血清4型PCR檢測試劑盒中得到應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測胸膜肺炎放線桿菌血清4型的試劑盒，該試劑盒含 有上述引物 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2。
[0015] 具體的，該試劑盒包括：
[0016] (I)PCR 反應(yīng)液：
[0017] 2\PCR Mix i2.5liL ?〇μΜ SEQ ID ΝΟ.? 1,0μL_. ΙΟμΜ SEQ ID ΝΟ.2 Ι.ΟμL 無菌超純水 8.5μΙ_.
[0018] 混勻后置-20 °C保存。
[0019] ⑵陰性對照：無菌超純水，置_20°C保存。
[0020] (3)陽性對照：胸膜肺炎放線桿菌血清4型參考菌株M62基因組DNA，置-20°C保 存。
[0021] 試劑盒用于檢測胸膜肺炎放線桿菌血清4型的方法包括：
[0022] (1)樣品處理
[0023] 待檢細(xì)菌樣品處理：取ImL待檢細(xì)菌培養(yǎng)液于I. 5mLEP管中，12000rpm，離 心5min，棄上清，沉淀用IOOyL裂解緩沖液重懸，其中裂解緩沖液為：0.0005 %吐 溫-20, 0· 50g/L 蛋白酶 K 和 0· lmol/L Tris，ρΗ8· 5 ;
[0024] 或者肺組織樣品處理：取Ig疑似感染豬肺臟組織，加入1ml PBS制成懸液； 2000rpm，離心2min，取500 μ L上清液于I. 5mLEP管中，12000rpm,離心5min，棄上清，沉淀 用IOOuL上述裂解緩沖液重懸；
[0025] (2)基因組DNA的提取：將上述用100 μ L裂解緩沖液重懸的液體置57°C水浴Ih 后，100°C作用5min，再12000rpm離心10min，上清即為基因組DNA，-20°C凍存?zhèn)溆茫?br>[0026] (3)PCR 擴增：在 25 yL 反應(yīng)體系中加入 2XPCR MIX 12. 5 yL，SEQ ID NO. 1 I. 0 μ L，SEQ ID NO. 2 I. 0 μ L，DNA 2· 0 μ L，無菌超純水 8· 5 μ L ;
[0027] ?0?反應(yīng)條件：951€51^11預(yù)變性后，941€3〇8,54.8 1€3〇8,721€458,30個循環(huán)后， 72°C延伸 IOmin ;
[0028] (4)判定胸膜肺炎放線桿菌血清4型的方法：
[0029] 被檢樣品電泳出現(xiàn)一條與陽性對照大小相同的擴增片段653bp，則判定為胸膜肺 炎放線桿菌血清4型陽性；
[0030] 被檢樣品電泳不出現(xiàn)擴增片段653bp，則判定為胸膜肺炎放線桿菌血清4型陰性。
[0031] 有益效果
[0032] 本發(fā)明根據(jù)GenBank上公布的胸膜肺炎放線桿菌4型參考菌株M62的全基因組序 列中找到與血清分型相關(guān)的7個莢膜多糖生物合成相關(guān)基因和10個菌體脂多糖0抗原生 物合成基因簇基因，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行大量序列比對，找到了 1個與其它基因型菌株序列 完全不相同的基因，即APP CPS4C基因。
[0033] 以APP CPS4C基因序列為靶標(biāo)，在其保守區(qū)設(shè)計引物，經(jīng)過大量篩選設(shè)計了本發(fā)明 的引物，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2,通過多次優(yōu)化PCR反應(yīng) 條件，建立了胸膜肺炎放線桿菌血清4型PCR檢測方法。該對引物從胸膜肺炎放線桿菌血 清4型細(xì)菌培養(yǎng)液和感染胸膜肺炎放線桿菌血清4型的病料提取的基因組DNA中都可擴增 出653bp DNA片段。
[0034] 本發(fā)明的檢測引物和試劑盒具有特異性高的特征，檢測其他15種APP參考菌株、 對豬致病的主要細(xì)菌（副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、豬肺疫巴氏桿菌、豬丹毒桿菌、豬葡萄球 菌、豬沙門氏菌、豬大腸桿菌、豬肺炎支原體）和病毒（豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病 毒、豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒、豬流感病毒）以及健康豬肺組織的基因組DNA或cDNA都 為陰性。
[0035] 本發(fā)明的檢測引物和試劑盒具有靈敏度高的特征，對APP血清4型的檢測靈敏度 可達(dá)到 100CFU/mL。
[0036] 本發(fā)明的檢測引物和試劑盒為APP分子流行病學(xué)調(diào)查、疫病診斷及疫苗菌株的篩 選提供有效的工具。
【附圖說明】
[0037] 圖1是50°C~65°C梯度PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中M :DL2000 DNA Marker ;退火溫度 I. 50°C ；2. 50. 7°C ；3. 51. 5°C ；4. 53〇C ；5. 54. 8°C ；6. 56. 6°C ；7. 58. 4°C ；8. 60. 2°C ； 9. 62〇C ；10. 63. 5°C；11. 64. 2°C ；12. 65〇C
[0038] 圖2是退火溫度為51. 5 °C PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中M :DL2000 DNA Marker ; 1. SI ；2. S2 ；3. S3 ；4. S4 ；5. S5a ；6. S5b ；7. S6 ；8. S7 ；9. S8 ；10. S9 ；11. SlO ；12. Sll ；13. S12 ； 14. S13 ；15. S14 ；16. S15 ；17. dH20
[0039] 圖3是退火溫度為53°C PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中M :DL2000 DNA Marker ;I. SI ; 2. S2 ；3. S3 ；4. S4 ；5. S5a ；6. S5b -J. S6 ；8. S7 ；9. S8 ；10. S9 ；11. SlO ；12. Sll ；13. S12 ； 14. S13 ；15. S14 ；16. S15 ；17. dH20
[0040] 圖4是退火溫度為54. 8 °C PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中M :DL2000 DNA Marker ; I. SI ；2. S2 ；3. S3 ；4. S4 ；5. S5a ；6. S5b ；7. S6 ；8. S7 ；9. S8 ；10. S9 ；11. SlO ；12. Sll ；13. S12 ； 14. S13 ；15. S14 ；16. S15 ；17. dH20
[0041] 圖5是特異性試驗結(jié)果，其中M :DL2000DNA Marker ;1. APP S4 ;2.副豬嗜血桿菌； 3. 豬鏈球菌；4.豬肺疫巴氏桿菌；5.豬丹毒桿菌；6.豬葡萄球菌；7.豬沙門氏菌；8.豬大 腸桿菌；9.豬肺炎支原體；10.豬瘟病毒；11.豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒；12.豬圓環(huán)病 毒；13.豬偽狂犬病毒；14.豬流感病毒；15.健康豬肺組織
[0042] 圖 6 是敏感性試驗結(jié)果，其中 M :DL2000 DNA Marker ;L IO6CFlVmL ;2· IO5CFlVmL ; 3. IO4CFlVmL ;4· IO3CFlVmL ;5· IO2CFlVmL ;6· IO1CFlVmL ;7· 10°CFU/mL
【具體實施方式】
[0043] 下面實施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0044] 實施例1
[0045] 1、目的基因的選擇
[0046] 根據(jù)GenBank上公布的胸膜肺炎放線桿菌4型參考菌株M62的全基因組序列（NZ_ AD0F01000000)，從2271179bp、2, 197個gene中找到與血清分型相關(guān)的莢膜多糖生物合成 相關(guān)基因（共7個，包括CPS4C、CPS4B、CPS4A、cpxD、cpxC、cpxB、cpxA)和菌體脂多糖O抗 原生物合成基因簇基因（共 10 個，包括 erpA、wzz、rmlB、rmlA、rmlD、rmlC、wzx、wzy、wbap、 rpsU)，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行大量序列比對，找到了 1個與其它基因型菌株序列完全不相同 的基因，即CPS4C基因，此基因全長1044bp。
[0047] 2、引物的設(shè)計和合成
[0048] 根據(jù)胸膜肺炎放線桿菌血清4型CPS4C基因的核苷酸序列，采用Primer 5. 0軟件 設(shè)計引物，經(jīng)過大量篩選得到如下序列的引物序列：
[0049] CPS4C基因正向引物（APP-CPS4CF)的序列為SEQ ID NO. 1，CPS4C基因反向引物 (APP-CPS4CR)的序列為SEQ ID NO. 2,具體序列的組成如下：
[0050] SEQ ID NO. 1 :5' -GCTAGAAATGGCAAATGAAA-3'
[0051] SEQ ID NO. 2 :5' -CTGGACGAGTAATAAATGAA-3'
[0052] 根據(jù)上述核苷酸序列信息合成CPS4C基因正向引物（APP-CPS4CF)和反向引物 (APP-CPS4CR)。將上述引物各配置成濃度為10 μ M的溶液，備用。
[0053] 3、PCR反應(yīng)條件的確定
[0054] PCR 反應(yīng)體系為 25 μ L :2 XPCR Mix 12. 5 μ L，10 μ M SEQ ID NO. I I. 0 μ L，10 μ M SEQ ID NO. 2 L 0 μ L，DNA 模板 2· 0 μ L，滅菌超純水 8· 5 μ L。
[0055] 在PCR儀上進(jìn)行梯度PCR，以確定最佳退火溫度。
[0056] 梯度PCR的反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min ;94°C變性30S，12個反應(yīng)管分別以50°C、 50. 7Γ、51· 5Γ、53Γ、54· 8Γ、56· 6Γ、58· 4Γ、60· 2Γ、62Γ、63· 5Γ、64· 2Γ、65Γ為退火 溫度，退火時間30S，72