一種適用于后縱韌帶骨化診斷的血清miRNA標(biāo)志物及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種適用于后縱韌帶骨化癥早 期篩查及診斷的血清miRNAs標(biāo)志物及檢測(cè)應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 后縱韌帶骨化癥（ossification of the posterior longitudinal ligament， 0PLL)是常見(jiàn)的脊柱疾患之一，骨化物造成脊髓壓迫，引起患者四肢與軀干感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)及 括約肌功能障礙，最終導(dǎo)致四肢癱瘓和大小便失禁，是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病。OPLL 亞洲人群尤其多見(jiàn)，日本發(fā)病率為1.9~4.3% (Stapleton CJ, Pham MH, Attenello FJ, et al.Ossification of the posterior longitudinal ligament: genetics and pathophysiology[J]· Neurosurg Focus, 2011，30(3) :E6.)。由于骨化物質(zhì)地堅(jiān)硬，減壓 手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大，容易因脊髓損傷導(dǎo)致患者發(fā)生癱瘓等嚴(yán)重并發(fā)癥。在診斷方面，由于其早 期首發(fā)癥狀往往來(lái)源于脊髓神經(jīng)根受壓，與其他脊柱脊髓疾患易混淆造成漏診誤診；而 從治療角度考慮，由于骨化范圍廣，脊髓壓迫重，椎管的儲(chǔ)備間隙小，其手術(shù)治療是脊柱 外科的巨大挑占戈（Seichi A, Hoshino Y, Kimura A, et al. Neurological complications of cervical laminoplasty for patients with ossification of the posterior longitudinal ligament-a multi-institutional retrospective study. Spine(Phila Pa 1976). 2011，36(15) :E998-1003.)。因此，為后縱韌帶骨化的早期診斷尋找高敏感性或特異 性的早期篩查生物標(biāo)志物已成為一個(gè)急需解決的問(wèn)題。
[0003] 近年來(lái)，隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的進(jìn)一步開(kāi)展，大量的非編碼序列越來(lái)越受到關(guān)注， 其中microRNA(miRNA)的發(fā)現(xiàn)最引人注目。miRNA是一類(lèi)全長(zhǎng)僅有20-24bp的非編碼短 鏈核苷酸片段，進(jìn)化上具有高度的保守性，其在生長(zhǎng)發(fā)育、腫瘤發(fā)生、免疫應(yīng)答等方面具有 廣泛的作用。由于miRNA作用方式的是以靶位點(diǎn)序列特異性為基礎(chǔ)，一個(gè)miRNA可能作 用于多個(gè)mRNA，而一個(gè)mRNA又可能接受多個(gè)miRNA的調(diào)控，個(gè)別miRNA的缺失可能對(duì)生 物的發(fā)育及生存并沒(méi)有明顯的影響，但卻為某些疾病的發(fā)生埋下了伏筆（Flynt AS，Lai EC. Biological principles of microRNA-mediated regulation:shared themes amid diversity. Nat Rev Genet. 2008, 9(11) :831-842.)。而由于 miRNA作用方式的特殊性， 使其在許多慢性疾病中都起到了至關(guān)重要的作用（Ceribelli A, Nahid MA，Satoh M，et al. MicroRNAs in rheumatoid arthritis. FEBS Lett. 2011,585 (23): 3667-74·)，其有望成 為重大疾病發(fā)生、診斷和預(yù)后的重要候選標(biāo)志物。現(xiàn)已證明miRNA在外周血中性質(zhì)穩(wěn)定且 存在顯著的疾病特異性，但含量較低、檢測(cè)不易。因此開(kāi)發(fā)易于檢測(cè)、成本低廉、快速有效的 檢測(cè)試劑盒成品則能夠有效提高檢測(cè)效率并達(dá)到良好的可重復(fù)性。然而，目前還沒(méi)有應(yīng)用 血清miRNA標(biāo)志物對(duì)后縱韌帶骨化早期篩查的研究報(bào)道，若能篩選出后縱韌帶骨化異常表 達(dá)的血清miRNA作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的篩選試劑盒，必將對(duì)我國(guó)后縱韌帶骨化的 早期診斷具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的首要目的是針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，提出一種與后縱韌帶骨化相關(guān)的血清 miRNAs標(biāo)志物。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的第一方面，提供適用于后縱韌帶骨化癥早期篩查 及診斷的血清 miRNAs 標(biāo)志物：包括 miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129。
[0006] 本發(fā)明所述的 miRNA-563, Accession number :MIMAT0003227,具體序列如下：
[0007] agguugacauacguuuccc(SEQ ID NO:I)〇
[0008] 本發(fā)明所述的 miRNA_196b，Accession number :MIMAT0001080,具體序列如下：
[0009] uagguaguuuccuguuguuggg(SEQ ID NO:2)。
[0010] 本發(fā)明所述的 miRNA-10a，Accession number :MIMAT0000253,具體序列如下：
[0011] uacccuguagauccgaauuugug(SEQ ID NO:3)〇
[0012] 本發(fā)明所述的 miRNA-129, Accession number :MIMAT0000242,具體序列如下：
[0013] cuuuuugcggucugggcuugc(SEQ ID NO:4)。
[0014] miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129 在血清中的表達(dá)水平與后縱韌帶 骨化程度成正相關(guān)。因此，通過(guò)檢測(cè)血清中miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129 的表達(dá)水平，可以評(píng)估待檢人群中后縱韌帶骨化的風(fēng)險(xiǎn)及程度。
[0015] 本發(fā)明的第二方面，提供上述血清miRNA標(biāo)志物在制備后縱韌帶骨化的診斷試劑 或試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述的診斷試劑或試劑盒為血清學(xué)檢測(cè)試劑或檢測(cè)試劑盒。
[0016] 所述的診斷試劑或試劑盒檢測(cè)生物樣品中miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、 miRNA-129中的一種或兩種以上的miRNA的表達(dá)量。所述的生物樣品選自：獲自對(duì)象的新 鮮組織或細(xì)胞、福爾馬林固定或石蠟包埋組織或細(xì)胞、血液或體液。優(yōu)選的，所述的生物樣 品為血清。
[0017] 所述的診斷試劑或試劑盒包括：對(duì)miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、 miRNA-129中的一種或兩種以上具有檢測(cè)特異性的探針、基因芯片，或PCR引物。
[0018] 優(yōu)選的，所述的診斷試劑或試劑盒為采用Real-time RT-PCR(qPCR)方法檢測(cè) miRNA表達(dá)量的試劑或試劑盒。
[0019] 優(yōu)選的，所述的對(duì) miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129 具有檢測(cè)特異 性的 PCR 引物的核苷酸序列分別如 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8 所示。
[0020] 本發(fā)明的第三方面，提供一種診斷后縱韌帶骨化的試劑盒，所述的試劑盒中包括 用于檢測(cè)miRNA表達(dá)量的試劑，所述的miRNA選自miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、 miRNA-129中的一種或兩種以上。
[0021] 優(yōu)選的，所述的用于檢測(cè)miRNA表達(dá)量的試劑為采用Real-time RT-PCR方法檢測(cè) miRNA表達(dá)量的試劑。
[0022] 優(yōu)選的，所述的試劑盒中包括：對(duì) miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129 具有檢測(cè)特異性的PCR引物的核苷酸序列，分別如SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 所示。
[0023] 本發(fā)明的第四方面，提供檢測(cè) miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129 表 達(dá)水平的試劑在制備后縱韌帶骨化診斷或篩查用試劑盒中的用途。
[0024] 本發(fā)明的第五方面，提供如 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8 所示的引物在制備后縱韌帶骨化診斷或篩查用試劑盒中的用途。
[0025] 本發(fā)明的試劑盒通過(guò)檢測(cè) miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129 的 表達(dá)水平，可以篩查待檢測(cè)人群患后縱韌帶骨化的風(fēng)險(xiǎn)：若miRNA-563、miRNA-196b、 miRNA-10a、miRNA-129中任一 miRNA的表達(dá)水平高于正常值范圍（上述miRNA的正常值范 圍依次為6649± 1554,1800±901，63717± 17258,1075±651拷貝數(shù)每500微升外周靜脈血 血清），則患后縱韌帶骨化的風(fēng)險(xiǎn)較高；若miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129 中任一 miRNA的表達(dá)水平低于正常值范圍（上述miRNA的正常值范圍依次為1800±901， 6649± 1554,63717± 17258,1075±651拷貝數(shù)每500微升外周靜脈血血清），則患后縱韌帶