一種促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)炎癥因子il-8的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)炎癥因子IL-8 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 炎癥因子是一類小分子多膚和糖蛋白，具有調(diào)節(jié)和介導(dǎo)免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的作 用，包括白介素類、干擾素類、腫瘤壞死因子類、生長(zhǎng)因子類W及趨化因子類。細(xì)胞受到刺激 后產(chǎn)生大量的炎癥因子，直接或間接影響淋己細(xì)胞或周圍細(xì)胞，在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì) 胞調(diào)亡中起重要作用。
[0003] 白細(xì)胞介素-8 (比-8)是趨化因子超家族中的一員，又稱趨化因子8,它與炎癥性 疾病密切相關(guān)。人的許多細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)刺激后均能產(chǎn)生IL-8,如血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角 質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。人的IL-8基因（基因全長(zhǎng)519化P，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組 成）是一種早期應(yīng)答基因，在細(xì)胞受到刺激后，IL-8基因表達(dá)量會(huì)迅速升高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)炎癥因子IL-8。
[0005] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了一種促進(jìn)離體的人角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)炎癥因 子IL-8的方法，可包括如下步驟曰2):用苯扎氯錠處理離體的人角質(zhì)形成細(xì)胞。
[0006] 所述步驟曰2)中，可用濃度為0. 9-1. 0μgAiL的苯扎氯錠處理所述離體的人角質(zhì) 形成細(xì)胞。
[0007] 所述步驟曰2)中，具體可用濃度為0. 973μgAiL的苯扎氯錠處理所述離體的人角 質(zhì)形成細(xì)胞。
[0008] 所述步驟a2)中，用苯扎氯錠處理離體的人角質(zhì)形成細(xì)胞的條件參數(shù)可為： 35-39°C、l. 5h-2.化。
[0009] 所述步驟a2)中，用苯扎氯錠處理離體的人角質(zhì)形成細(xì)胞的條件參數(shù)具體可為： 37Γ、化。
[0010] 所述方法還包括如下步驟：在進(jìn)行所述步驟a2)前，進(jìn)行步驟al);所述步驟al) 為：將離體的人角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞懸液接種至細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)。
[0011] 所述步驟a2)可為：完成所述步驟al)后，取所述細(xì)胞培養(yǎng)板，加入苯扎氯錠并培 養(yǎng)。
[0012] 所述步驟al)中，所述細(xì)胞懸液中人角質(zhì)形成細(xì)胞的濃度可為18000-20000個(gè)/ cm2。
[0013] 所述步驟al)中，所述細(xì)胞懸液中人角質(zhì)形成細(xì)胞的濃度具體可為19000個(gè)/cm2。
[0014] 所述步驟al)中，所述培養(yǎng)的條件可為：35-39°C、l化-2化。
[0015] 所述步驟al)中，所述培養(yǎng)的條件具體可為：37°C、24h。
[0016] 所述步驟al)中，所述細(xì)胞懸液的接種量可為100μL/孔。
[0017] 上述任一所述炎癥因子IL-8的基因序列可如序列表中序列1所示。
[0018] 所述苯扎氯錠的加入形式可為苯扎氯錠溶液。
[0019] 上述任一所述苯扎氯錠溶液可為用DMEM培養(yǎng)基溶解苯扎氯錠得到的溶液。
[0020] 上述任一所述細(xì)胞懸液的制備方法具體如下：用0. 25%膜蛋白酶消化離體的人 角質(zhì)形成細(xì)胞，然后用含10%胎牛血清（體積百分比）的DMEM培養(yǎng)基重懸。
[0021] 上述任一所述DMEM培養(yǎng)基的制備方法具體如下：將高糖DMEM固體培養(yǎng)基（Gibco 公司產(chǎn)品）13. 5g和NaHC〇33. 7g依次溶于水，抑調(diào)至7. 2-7. 4,然后定容至1L。
[0022] 上述任一所述人角質(zhì)形成細(xì)胞可為人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞。
[0023] 所述苯扎氯錠具體可為北京百靈威科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為#928512。
[0024] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的方法可W顯著促進(jìn)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中炎癥因子IL-8 的表達(dá)，從而可W用于篩選治療炎癥的藥物。本發(fā)明對(duì)于抗炎藥物的開發(fā)具有重大價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為Μ?Τ法測(cè)定不同濃度的苯扎氯錠溶液處理人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率。
[0026] 圖2為炎癥因子IL-8在苯扎氯錠溶液不同處理時(shí)間下的表達(dá)量。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0028] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0029] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030] 下述實(shí)施例中的定量實(shí)驗(yàn)，如無(wú)特殊說(shuō)明均設(shè)置Ξ次重復(fù)，結(jié)果取平均值。
[0031] 苯扎氯錠為北京百靈威科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為#928512。
[0032] 人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞為北京富隆康泰生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；胎牛血清為 Hyclone公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為甜30084. 03 ;0. 25%膜蛋白酶為Hyclone公司產(chǎn)品，產(chǎn)品 目錄號(hào)為甜30042. 01 ;DMS0為sigma公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為D2650。
[0033]DMEM培養(yǎng)基：將高糖DMEM固體培養(yǎng)基（Gibco公司產(chǎn)品）13. 5g和Na肥化3. 7g依 次溶于水，抑為7. 2-7. 4,定容至1L。使用0. 22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，于4°C保存。
[0034]MTT溶解液：將MTT(sigma公司產(chǎn)品）5g溶于上述DMEM培養(yǎng)基，定容至1L。使用 0. 22μm微孔濾胺過(guò)濾除困，于4C保存。
[0035]PBS緩沖液：購(gòu)買自hyclone公司，貨號(hào)甜30256. 01B。
[0036] 實(shí)施例1、確定人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的最佳接種細(xì)胞密度和苯扎氯錠處理濃度
[0037] 設(shè)置試驗(yàn)組，進(jìn)行Ξ次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)試驗(yàn)的步驟均如下：
[003引1、用0.25%膜蛋白酶消化人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，然后用含10%胎牛血清（體積百 分比）的DMEM培養(yǎng)基重懸并稀釋，獲得細(xì)胞密度為15600個(gè)/cm2的細(xì)胞懸浮液1、細(xì)胞密 度為19000個(gè)/cm2(實(shí)際應(yīng)用中18000-20000個(gè)/cm2均可）的細(xì)胞懸浮液2、細(xì)胞密度為 22000個(gè)/cm2的細(xì)胞懸浮液3和細(xì)胞密度為25000個(gè)/cm2的細(xì)胞懸浮液4。
[0039] 2、用DMEM培養(yǎng)基溶解苯扎氯錠，獲得苯扎氯錠溶液。
[0040] 3、取96孔培養(yǎng)板，每孔接種100μL步驟1獲得的細(xì)胞懸浮液（細(xì)胞懸浮液1、細(xì) 胞懸浮液2、細(xì)胞懸浮液3或細(xì)胞懸浮液4)，在37°C(實(shí)際應(yīng)用中37 + 2°C均可）、5%C〇2 環(huán)境中培養(yǎng)2地（實(shí)際應(yīng)用中1化-2化均可）。
[0041] 4、完成步驟3后，取所述96孔板，加入步驟2制備的苯扎氯錠溶液，得到處理體 系，處理體系中的苯扎氯錠的濃度為0. 05μg/mL、0. 15μg/mL、0. 46μg/mL、1. 37μg/mL、 4. 11μg/mL、12. 35μg/mL、37. 03μg/mL、111. 1μg/mL、333. 3μg/mL或 1000μg/mL(每個(gè) 苯扎氯錠濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔），5 % 0)2、37°C培養(yǎng)44h(實(shí)際應(yīng)用中4化-4化均可），然后加 入20μLMTT溶解液，繼續(xù)5%C02、37°C培養(yǎng)地。
[0042] 5、完成步驟4后，取所述96孔板，吸棄孔內(nèi)的液體，用PBS緩沖液清洗2次，然后 每孔加入150μLDMS0,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm處的吸光值。
[0043] 設(shè)置空白對(duì)照組：用等體積含10%胎牛血清（體積百分比）的DMEM培養(yǎng)液代替 細(xì)胞懸浮液，其它操作同試驗(yàn)組。每個(gè)苯扎氯錠濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。
[0044] 設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組：用等體積DMEM培養(yǎng)基代替苯扎氯錠溶液，其它操作同試驗(yàn)組。 每種細(xì)胞懸浮液設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。
[0045]W苯扎氯錠在處理體系中的濃度為橫坐標(biāo)，人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率為縱坐 標(biāo)，比較不同濃度的苯扎氯錠處理后人表皮角