一種制備具有抗氧化活性鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物活性多糖提取的技術領域，具體涉及一種制備具有抗氧化活性鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖的方法。
【背景技術】
[0002]—直以來，蘑菇被認為是食用和醫(yī)藥原料的重要來源之一，但自然界中仍然有大量的具有醫(yī)藥產(chǎn)品前景的蘑菇資源未被開發(fā)利用。據(jù)報道，蘑菇中含有大量具有生物活性的大分子，特別是具有抗癌和免疫刺激活性的多糖類物質(zhì)受到越來越多的關注。研究表明，擔子菌類蘑菇中的子實體、菌絲體和發(fā)酵液中均有生物活性多糖存在。因此，如何開發(fā)新的蘑菇資源并利用現(xiàn)代化技術制備各種生物活性多糖越來越受到科研人員的關注。
[0003]鱗傘屬是蘑菇球蓋茹科中的一個小家族，約包含150余種，含有豐富的維生素，氨基酸，微量元素，脂類和多糖，同時鱗傘菌中有多種抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂等作用的生物活性物質(zhì)。鼎湖鱗傘菌(Phol1ta dinghuensis Bi)于1985年在中國廣東省被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過鑒定屬于鱗傘屬中的新種，而且是中國特有的新種，但目前對鼎湖鱗傘菌中活性物質(zhì)的研究報道較少。
[0004]與培育真菌子實體相比，液體深層發(fā)酵法制備菌絲體具有占地少、生產(chǎn)周期短、單位產(chǎn)率高的優(yōu)點，且生產(chǎn)過程容易控制，目標產(chǎn)品質(zhì)量高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一種高效制備具有抗氧化活性鼎湖鱗傘胞內(nèi)、胞外多糖的方法，實現(xiàn)本發(fā)明的具體方案如下:
[0006](1)將鼎湖鱗傘菌種在馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上于隔水式恒溫培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)8-10天，直至菌絲長滿斜面。
[0007](2)從馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上挑取0.5cm2大小的母種塊，接種于種子培養(yǎng)基中，于28°C靜止培養(yǎng)12小時后，150rpm下振蕩培養(yǎng)10-15天。種子培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖20，蛋白質(zhì)胨3，酵母膏4，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂1 ;裝液量為100mL/250mL。
[0008](3)取步驟(2)中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為15% (V/V)，于28°C、120rpm的條件下培養(yǎng)10-15天，發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖45 ;酵母膏6，磷酸二氫鉀1.5，硫酸鎂0.5，馬鈴薯100，麥芽粉2.5 ;裝液量為200mL/500mL。
[0009](4)將發(fā)酵產(chǎn)物用濾紙進行減壓過濾，得到鼎湖鱗傘的菌絲體和發(fā)酵液；將菌絲體用去離子水沖洗三次，55°C烘干至恒重，粉碎，過60目篩，用去離子水以料液比1: 10，于90°C熱水浴中提取3小時，濾渣重復提取一次，合并提取液；將菌絲體提取液和發(fā)酵液分別經(jīng)4000rpm離心15min，取上清，真空濃縮至原體積的1/5，加入3倍體積的酒精，充分混勾，4°C下靜置過夜，4000rpm離心20min，收集粗多糖沉淀，依次用丙酮和無水乙醚各洗滌兩次，復溶后真空冷凍干燥，得鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外粗多糖。
[0010]液體發(fā)酵法制備鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外粗多糖產(chǎn)量分別為429mg/L和930mg/L。
[0011](5)粗多糖溶解液上樣于DEAE Sepharose Fast Flow (2.0 X 60cm)，并分別用去離子水、0.lmol/L NaCl和0.3mol/L NaCl進行洗脫收集，流速為2mL/min。采用硫酸-苯酸法檢測洗脫液中的多糖含量，合并相同組分，50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，去離子水透析2d，真空冷凍干燥，分別得胞內(nèi)、胞外多糖組分。
[0012](6)將步驟(5)所得胞內(nèi)、胞外多糖組分經(jīng)S印hadex G-100凝膠柱純化后得胞內(nèi)、胞外純化多糖組分，并配制成一系列濃度溶液，測定其對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力。
[0013]制備的鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除能力。
[0014]2、根據(jù)專利要求1所述的一種制備具有抗氧化活性鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖的方法，其特征在于:采用液體深層發(fā)酵法培養(yǎng)鼎湖鱗傘菌，同時提取胞內(nèi)、胞外多糖，產(chǎn)量分別為 429mg/L 和 930mg/L。
【附圖說明】
[0015]圖1鼎湖鱗傘菌絲體多糖的DEAE凝膠柱梯度洗脫曲線
[0016]圖2鼎湖鱗傘菌胞外多糖的DEAE凝膠柱梯度洗脫曲線
[0017]圖3鼎湖鱗傘菌胞外多糖對DPPH自由基的清除活性
[0018]圖4鼎湖鱗傘菌胞外多糖對羥基自由基的清除活性
[0019]圖5鼎湖鱗傘菌胞外多糖對超氧陰離子自由基的清除活性
【具體實施方式】
[0020]下面通過實施例，對本發(fā)明作進一步描述。
[0021]實施例1:
[0022](1)將鼎湖鱗傘菌種在馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上于隔水式恒溫培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)8-10天，直至菌絲長滿斜面。
[0023](2)從馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上挑取0.5cm2大小的母種塊，接種于種子培養(yǎng)基中，于28°C靜止培養(yǎng)12小時后，150rpm下振蕩培養(yǎng)10-15天。種子培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖20，蛋白質(zhì)胨3，酵母膏4，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂1 ;裝液量為100mL/250mL。
[0024](3)取步驟(2)中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為15% (V/V)，于28°C、120rpm的條件下培養(yǎng)10-15天，發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖45 ;酵母膏6，磷酸二氫鉀1.5，硫酸鎂0.5，馬鈴薯100，麥芽粉2.5 ;裝液量為200mL/500mL。
[0025](4)將發(fā)酵產(chǎn)物用濾紙進行減壓過濾，得到鼎湖鱗傘的菌絲體和發(fā)酵液；將菌絲體用去離子水沖洗三次，55°C烘干至恒重，粉碎，過60目篩，用去離子水以料液比1: 10，于90°C熱水浴中提取3小時，濾渣重復提取一次，合并提取液；將菌絲體提取液和發(fā)酵液分別經(jīng)4000rpm離心15min，取上清，真空濃縮至原體積的1/5，加入3倍體積的酒精，充分混勾，4°C下靜置過夜，4000rpm離心20min，收集粗多糖沉淀，依次用丙酮和無水乙醚各洗滌兩次，復溶后真空冷凍干燥，得鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外粗多糖。
[0026]液體發(fā)酵法制備鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外粗多糖產(chǎn)量分別為429mg/L和930mg/L。
[0027]實施例2:
[0028]鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖的分離純化及體外抗氧化活性分析
[0029](1)粗多糖溶解液上樣于DEAE Sepharose Fast Flow (2.0 X 60cm)，并分別用去離子水、0.lmol/L NaCl和0.3mol/L NaCl進行洗脫收集，流速為2mL/min。采用硫酸-苯酸法檢測洗脫液中的多糖含量，合并相同組分，50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，去離子水透析2d，真空冷凍干燥，分別得胞內(nèi)、胞外多糖組分。
[0030](2)將步驟(5)所得胞內(nèi)、胞外多糖組分經(jīng)S印hadex G-100凝膠柱純化后得胞內(nèi)、胞外純化多糖組分，并配制成一系列濃度溶液，測定其對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力。
[0031]制備的鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除能力。
[0032]鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖產(chǎn)量按下面公式計算:
[0033]多糖產(chǎn)量(mg/L)=[粗多糖質(zhì)量(mg)/發(fā)酵液體積(L)]
[0034]DPPH 清除率(％ ) = [A0- (ArA2) ]/A0X100%
[0035]其中A。為對照實驗(水代替樣品溶液)的吸光值；
[0036]Ai為樣品實驗的吸光值；
[0037]^為樣品干擾實驗(無水乙醇代替DPPH溶液)的吸光值。
[0038]羥基清除率(%) = [ (A2_Ai) / (Ao-Ai) ] X 100%
[0039]其中:
[0040]A。-正常管(50 μ L 鄰二氮菲 +75 μ L PBS+50 μ L FeS04+100 μ L H20)的吸光值；[0041 ] A「陰性對照管(50 μ L鄰二氮菲 +75 μ L PBS+50 μ L FeS04+50 μ L H20+50 μ L H202)的吸光值；
[0042]A2-樣品管(50 μ L鄰二氮菲 +75 μ L PBS+50 μ L FeS04+50 μ L 多糖 +50 μ L H202)的吸光值。
[0043]超氧陰離子自由基清除率) = [A0-(A1-A2)]/A0X100%
[0044]其中:
[0045]A。-對照實驗(水代替樣品溶液)的吸光值；
[0046]A1-樣品實驗的吸光值；
[0047]A2-樣品干擾實驗(0.1M pH 7.4酸鹽緩沖液代替NBT溶液)的吸光值。
【主權項】
1.一種液體發(fā)酵制備鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖的方法，其特征在于包括以下操作步驟: (1)將鼎湖鱗傘菌種在馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上于隔水式恒溫培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)8-10天，直至菌絲長滿斜面。 (2)從馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上挑取0.5cm2大小的母種塊，接種于種子培養(yǎng)基中，于28°C靜止培養(yǎng)12小時后，150rpm下振蕩培養(yǎng)10-15天。種子培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖20，蛋白質(zhì)胨3，酵母膏4，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂1 ;裝液量為100mL/250mL。 (3)取步驟(2)中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為15%(V/V)，于28°C、120rpm的條件下培養(yǎng)10-15天，發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖45 ;酵母膏6，磷酸二氫鉀1.5，硫酸鎂0.5，馬鈴薯100，麥芽粉2.5 ;裝液量為200mL/500mL。 (4)將發(fā)酵產(chǎn)物用濾紙進行減壓過濾，得到鼎湖鱗傘菌的菌絲體和發(fā)酵液；將菌絲體用去離子水沖洗三次，55°C烘干至恒重，粉碎，過60目篩，用去離子水以料液比1: 10，于90°C熱水浴中提取3小時，濾渣重復提取一次，合并提取液；將菌絲體提取液和發(fā)酵液分別經(jīng)4000rpm離心15min，取上清，真空濃縮至原體積的1/5，加入3倍體積的酒精，充分混勾，4°C下靜置過夜，4000rpm離心20min，收集粗多糖沉淀，依次用丙酮和無水乙醚各洗滌兩次，復溶后真空冷凍干燥，得鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外粗多糖。 液體發(fā)酵法制備鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外粗多糖產(chǎn)量分別為429mg/L和930mg/L。 (5)粗多糖溶解液上樣于DEAESepharose Fast Flow(2.0X60cm)，并分別用去離子水、0.lmol/L NaCl和0.3mol/L NaCl進行洗脫收集，流速為2mL/min。采用硫酸-苯酸法檢測洗脫液中的多糖含量，合并相同組分，50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，去離子水透析2d，真空冷凍干燥，分別得胞內(nèi)、胞外多糖組分。 (6)將步驟(5)所得胞內(nèi)、胞外多糖組分經(jīng)SephadexG-100凝膠柱純化后得胞內(nèi)、胞外純化多糖組分，并配制成一系列濃度溶液，測定其對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力。 制備的鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除能力。2.根據(jù)專利要求1所述的一種制備具有抗氧化活性鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖的方法，其特征在于:采用液體深層發(fā)酵法培養(yǎng)鼎湖鱗傘菌，同時提取胞內(nèi)、胞外多糖，產(chǎn)量分別為 429mg/L 和 930mg/L。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種制備具有抗氧化活性鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖的方法。該方法包括采用液體深層發(fā)酵法培養(yǎng)鼎湖鱗傘菌，菌絲體用去離子水沖洗三次，經(jīng)干燥、粉碎、熱水浸提、乙醇沉淀、復溶、冷凍干燥得菌絲體多糖；發(fā)酵液經(jīng)濾膜分離、減壓濃縮、乙醇沉淀、復溶、冷凍干燥得胞外多糖。體外清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的實驗表明鼎湖鱗傘菌胞外多糖具有一定的體外抗氧化活性。本發(fā)明綜合利用鼎湖鱗傘菌胞內(nèi)、胞外多糖，具有利用率高、工藝溫和、成本低等優(yōu)點，為開發(fā)利用藥用真菌資源開辟了新的途徑。
【IPC分類】C12R1/645, C12P19/04
【公開號】CN105368895
【申請?zhí)枴緾N201510656990
【發(fā)明人】曾曉雄, 邱麗淳, 吳凡
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年10月10日