專利名稱：人類b細(xì)胞抗原,及相關(guān)試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于調(diào)節(jié)人類免疫反應(yīng)的多種生物試劑。更優(yōu)選，它指有用的組合物和方法，例如，在B和T細(xì)胞相互作用中有用。
背景技術(shù)：
白血病，淋巴瘤，癌，和其它惡性病在，例如，Wilson等(編)Harrison醫(yī)學(xué)原理，McGraw-Hill，紐約，1599-1612頁)中描述。作為此類疾病的例子，惡性淋巴瘤是主要存在于淋巴樣組織中的新生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，(參見，例如，Nadler,L.M.Harrison)。百分之九十的非何杰金氏淋巴瘤，在美國每年發(fā)生約30000新病例，是B細(xì)胞淋巴瘤。少于25％的這些病例被治愈。另一例子是白血病，在美國每年發(fā)生約30000新病例。這樣就存在對B和T細(xì)胞淋巴瘤，白血病，癌和其它惡性疾病的更有效治療的需求。
正常的靜息B細(xì)胞(也稱為B淋巴細(xì)胞)的生長包括性質(zhì)不同的兩步。首先，靜息細(xì)胞被激活通過細(xì)胞周期的G0期至G1期。參見，例如，Alberts，等(編1989)細(xì)胞分子生物學(xué)Garland出版，NY；和Daenell，等(1990)分子細(xì)胞生物學(xué)Freeman,NY。第二步，激活的細(xì)胞被誘導(dǎo)開始增生。參見，例如，Paul，等編(1989)基礎(chǔ)免疫學(xué)第二版，RavenPress,NY；和第三版。已發(fā)現(xiàn)幾種因子誘導(dǎo)B細(xì)胞生長，包括白細(xì)胞介素-1(IL-1),IL-2,IL-4,IL-10，和IL-13。另外針對某些B細(xì)胞表面分子的抗體也被證實(shí)促進(jìn)B細(xì)胞增生。T細(xì)胞(也稱作T淋巴細(xì)胞)也可被某些因子誘導(dǎo)增生，包括植物血凝素，抗T細(xì)胞受體單抗，抗CD3單抗，和其它試劑。
若干研究提示CD40分子可作為生長因子受體和人類B細(xì)胞增生和發(fā)育的重要調(diào)節(jié)劑。B淋巴細(xì)胞可由B淋巴細(xì)胞表面上CD40分子與激活的輔助T細(xì)胞瞬時表達(dá)的配體的相互作用而被激活。
CD40是膜相關(guān)糖蛋白，在正常B淋巴細(xì)胞，惡性B細(xì)胞，交錯突細(xì)胞，濾泡樹突細(xì)胞，胸腺上皮細(xì)胞，和一些癌中被表達(dá)。人類CD40于1985年作為幾乎唯一表達(dá)于B淋巴細(xì)胞的一單抗決定簇被首次發(fā)現(xiàn)，因此是B細(xì)胞的有用的標(biāo)記物。人類CD40是一45-50Kd糖蛋白。
抗CD40抗體提供一由乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)，抗CD20抗體，或抗免疫球蛋白抗體誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖之強(qiáng)共刺激信號。將抗人類CD40抗體和IL-4加入活化的B細(xì)胞中，當(dāng)培養(yǎng)基進(jìn)一步補(bǔ)充以CD32轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞時，亦可產(chǎn)生許多效應(yīng)，包括短期復(fù)制，IgE合成的誘導(dǎo)，和長期增殖。
B7(CD80)和B70(CD86)是第二類強(qiáng)烈介導(dǎo)B細(xì)胞和T細(xì)胞相互作用的分子。這些分子，在B細(xì)胞上，與T細(xì)胞上它們的配體CD28和CTLA-4相作用。這些相互作用是主要的B細(xì)胞和T細(xì)胞活化的共刺激信號。
在過去的15年中，很明顯這兩類表面分子在T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化中具有重要的作用。大量的體外和體內(nèi)試驗(yàn)已論證了這兩類分子代表了重要的免疫抑制靶點(diǎn)。參見，如，Banchereau，等(1994)免疫學(xué)年度綜述12:881-922；Van Kooten，等(1996)高等免疫學(xué)61:1-77；Linsley和ledbetter(1993)免疫學(xué)年度綜述11:191-212)。
免疫抑制代表一類非常重要的用于抑制和治療自身免疫疾病和移植過程中的排斥反應(yīng)的免疫學(xué)介入。免疫抑制可通過a)抗增殖藥物(環(huán)磷酰胺，15-脫氧精胍菌素，等)；b)甾類糖皮質(zhì)激素；c)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的抑制劑(如環(huán)孢菌素)；d)免疫抑制細(xì)胞因子(如TGF-β,IL-10)；e)由抗原誘導(dǎo)的特異性耐受；及f)涉及T和B淋巴細(xì)胞活化的細(xì)胞表面分子，如CD40/CD40配體和具有CD28/CTLA-4的B7/B70的抑制來實(shí)現(xiàn)。
1995年，從鼠的脾細(xì)胞中克隆出另一個稱為RP105的分子。參見Miyake等(1995)“RP105，一種新的存在于B細(xì)胞活化過程中的B細(xì)胞表面分子，是富含亮氨酸重復(fù)蛋白家族的一個成員”免疫學(xué)雜志154:3333-3340?？筊P105的單克隆抗體誘導(dǎo)鼠B細(xì)胞的強(qiáng)烈增殖，并以與抗CD40抗體或CD40配體類似的方式保護(hù)鼠B細(xì)胞免于射線誘導(dǎo)的細(xì)胞編程性死亡。見Miyake，等(1994)“抗一105kDa分子的抗體使鼠B細(xì)胞增殖并保護(hù)其免于細(xì)胞編程性死亡X-關(guān)聯(lián)的免疫缺陷B細(xì)胞的無反應(yīng)性”試驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志180:1217-1224。
RP105及其假設(shè)配體可能是在T細(xì)胞和B細(xì)胞活化中起關(guān)鍵作用的第三類分子。然而迄今，還未得到人類序列，其結(jié)構(gòu)和活性還未測定。本發(fā)明提供了這些及很多其它有用的進(jìn)展。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種組合物，選自一種編碼人類BAS-1蛋白或其片段的分離的或重組的核酸；一基本純的BAS-1蛋白或其肽；一包含BAS-1蛋白序列的融合蛋白；及一抗重組或純化的靈長類BAS-1蛋白的抗體。
在分離或重組核酸的實(shí)施方案中，核酸可包括在SEQ ID NO1中定義的一個序列。
蛋白實(shí)施方案中，蛋白可為基本純的BAS-1蛋白或其肽；可選自來自靈長類動物包括人的一個蛋白或肽；包含至少SEQ ID NO2中所定義的一個多肽片段的一個蛋白或肽；與天然BAS-1蛋白顯示不同的翻譯后修飾模式的一個蛋白或肽；及缺乏BAS-1胞內(nèi)區(qū)的蛋白；亦可為包含一蛋白及一可藥用載體的組合物。
抗體實(shí)施方案包括BAS-1蛋白為靈長類蛋白的那些方案，所述靈長類蛋白包括人類蛋白的；抗體抗SEQ ID NO2所定義的肽序列；抗體具有至少約10μM的Kd；抗體為單克隆抗體；或抗體被標(biāo)記。進(jìn)一步的實(shí)施方案包括其中的抗體誘導(dǎo)B細(xì)胞強(qiáng)烈的增殖；及/或保護(hù)B細(xì)胞免于射線或甾類激素誘導(dǎo)的細(xì)胞編程性死亡。
本發(fā)明還包括一些試劑盒，如試劑盒包含如一編碼BAS-1蛋白或肽的一段核酸；一基本純的BAS-1蛋白或片段；特異結(jié)合BAS-1蛋白的一個抗體或受體。包含核酸的試劑盒可以包含SEQ ID NO1所定義的編碼序列。對于包括蛋白或其片段的試劑盒，多肽常選自來自靈長類包括人的蛋白或肽；包含至少SEQ ID NO2中所定義的一個多肽片段的一個蛋白或肽；與天然BAS-1蛋白顯示不同的翻譯后修飾模式的一個蛋白或肽。
另一試劑盒可以包括一抗體或受體，其中BAS-1蛋白為靈長類蛋白，包括人類蛋白；抗體抗SEQ ID NO2所定義的肽序列；抗體具有至少約10μM的Kd；抗體為單克隆抗體；或抗體被標(biāo)記。
本發(fā)明還提供了篩選BAS-1結(jié)合配偶體的樣品的方法，包括生產(chǎn)純化的或重組的BAS-1蛋白，及在樣品中篩選能特異與BAS-1蛋白的結(jié)合配偶體結(jié)合的樣品的步驟。在某些實(shí)施方案中，樣品包括來自T細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞包括濾泡樹突狀細(xì)胞，或基質(zhì)細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，和上皮細(xì)胞的蛋白。在另外的實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體為一抗體，樣品為雜交瘤上清。
本發(fā)明的其它方面包括調(diào)控細(xì)胞生理或發(fā)育的一種方法，包括將細(xì)胞與BAS-1蛋白的激動劑或拮抗劑接觸。通常，生理學(xué)選自免疫抑制；細(xì)胞毒性殺傷的激活；細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控；或淋巴瘤生長。拮抗劑通常為抗靈長類BAS-1蛋白的抗體。方法可包括這些與信號傳導(dǎo)介質(zhì)通過抗原受體的結(jié)合，CD40:CD40配體途徑，或CD28/CTLA-4:B7/B70途徑，如抗CD3，抗CD40，抗CD40配體，抗CD28，抗CTLA-4；抗B7，抗B70，或適當(dāng)表面信號分子的可溶性部分。
發(fā)明詳述Ⅰ．概論本發(fā)明提供了顯示活化抗原性質(zhì)的一種人類蛋白的氨基酸序列和DNA序列。該蛋白被命名為B細(xì)胞活化和存活抗原-1(BAS-1)。本文描述的靈長類序列是在一鼠基因被首先描述后獲得的。見Miyake等(1995)免疫學(xué)雜志154:3333-3340。其它靈長類動物中類似的蛋白序列亦應(yīng)存在。以下描述旨在示例所述人類BAS-1天然等位基因，但同樣適用于如來自其它個體的等位基因和/或多態(tài)變體，亦適于拼接變體，如天然形式。
這些基因?qū)⑹狗蛛x編碼與此相關(guān)的其它靈長類蛋白的基因成為可能，進(jìn)一步擴(kuò)展了本發(fā)明所述具體實(shí)施方案之外的種系。方法在下面概括給出。
人類B細(xì)胞活化和存活抗原1(BAS-1)，因其生物活性而得名。其鼠同源物的單克隆抗體，RP105，誘導(dǎo)鼠B細(xì)胞的強(qiáng)烈增殖，并以類似于抗CD40抗體或CD40配體的方式保護(hù)鼠B細(xì)胞免于射線誘導(dǎo)的細(xì)胞編程性死亡。
人類的BAS-1cDNA用基于來自鼠RP105序列的核酸序列分離。相應(yīng)編碼蛋白的分析表明人BAS-1為包括富含亮氨酸部分的蛋白家族中的一員。該家族的其它成員包括CD14-LPS受體，F(xiàn)SH/LH/TSH受體，親神經(jīng)受體。這些受體顯示參與信號傳導(dǎo)。
人類的BAS-1cDNA用鼠RP105的不同區(qū)域的序列推斷得來。鼠和人類BAS-1開放閱讀區(qū)的同源性比較顯示了約67％的DNA序列和約73％的氨基酸序列與鼠RP105完全一致。
人類的BAS-1可能還具有免疫系統(tǒng)之外的功能，如在其它細(xì)胞類型中的發(fā)育調(diào)控，見，如，Gilbert(1991)發(fā)育生物學(xué)(3版)，SinauerAssociates,Sunderland,MA；Browder等(1991)，發(fā)育生物學(xué)(3版)，Saunders,Phildelphia,PA.；Russo等(1992)發(fā)育分子基因途徑，Spinger-Verlag，紐約，N.Y.；及Wilkins(1993)動物發(fā)育的基因分析(2版)Wiley-Liss，紐約，N.Y.人類BAS-1配體的確認(rèn)將有助于回答這些觀察中提出的一些問題。
Ⅱ．純化的人類BAS-1SEQ ID NO1揭示了cDNA的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。氨基酸序列在SEQ ID NO2中亦列出。信號序列顯示由蛋氨酸(1)至纈氨酸(20)；氨基側(cè)翼區(qū)域由半胱氨酸(28)至亮氨酸(58)，包括精氨酸上兩個潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)(殘基34,53)；富含亮氨酸部分的串聯(lián)重復(fù)序列從蘇氨酸(55)到酪氨酸(592)，包括精氨酸上9個潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)(殘基70,78,201,234,244,394,402,451，及573)；羧基側(cè)翼區(qū)域由亮氨酸(574)到半胱氨酸(625)；跨膜區(qū)從丙氨酸(629)至纈氨酸(650)；胞內(nèi)區(qū)從賴氨酸(651)到苯丙氨酸(661)，包括酪氨酸上兩個潛在的磷酸化位點(diǎn)(652和658)。
下表顯示了SEQ ID NO2中列出的人類BAS-1蛋白的富含亮氨酸重復(fù)單元的排列。
表1CI I共有區(qū) LXXLXLXXNXLXXLXXXXXXXLXX1: 55-78 TEFLEFSFNFLPTIHNRTFSRLMN2:79-102 LTFLDLTRCOINWIPEDTFQSHHQ3: 103-126 LSTLVLTGNPLIFMAETSLNGPKS4: 127-150 LKHLFLIQTGISNLEFIPVHNLEN5: 151-174 LESLYLGSNHISSIKFPKDFPARN6: 175-198 LKVLDFONNAIHYISREDMRSLEQ7: 199-223 AINLSLNFNGNN-VKGIELGAFDSTV8: 224-246 FQSLNFGGTPNL-SVIFNGLQNST9: 247-275 TQSLWLGTFEDIDDEDISSAMLKGLCEMS10: 276-299 VESLNLQEHRFSDISSTTFQCFTQ11: 300-322 LQELDLTATHLKGLPSGMKG-LNL12: 323-346 LKKLVLSVNHFDQLCQISAANFPS13: 347-371 LTHLYIRGN-VKKLHLGVGC-LEKLGN14: 372-397 LQTLDLSHNDIEASDCCSLQ-LKNLSH15: 398-421 LQTLNLSHNEPLGLQSQAFKECPQ16: 422-446 LELLDLAFTRLHINAPQSPFQNLHF17: 447-470 LQVLNLTYCFLDTSNQHLLAGLPV18: 471-497 LRHLNLKGNHFQDGTITKTNLLQTVGS19: 498-521 LEVLILSSCGLLSIDQQAFHSLGK20: 522-544 MSHVDLSHNSLTCDSIDSLSHLK21: 545-568 GIYLNLAANSINIISPRLLPILSQ22: 569-592 QSTINLSKNPLDCTCSNIHF-LTWY
本文所用術(shù)語“人類BAS-1”指，當(dāng)用于蛋白定義時，具有SEQ ID NO2所顯示氨基酸序列的蛋白。本發(fā)明還包括含其片段，如突變體及多態(tài)變體，和顯示相同生物學(xué)功能或與人類BAS-1特異結(jié)合組分相互作用的人源性多肽的蛋白。這些結(jié)合組分通常以高親和性結(jié)合人類BAS-1，如至少約100nM，通常好于大約30nM，優(yōu)選好于大約10nM，更優(yōu)選好于大約3nM。在除人外的其它物種如靈長類，發(fā)現(xiàn)同源蛋白。
本文所用術(shù)語“多肽”包括一個片段或部分，包括一段氨基酸殘基，至少約8個氨基酸，通常至少10個氨基酸，更常見12個氨基酸，更常見至少14個氨基酸，更常見至少16個氨基酸，典型的至少約18個氨基酸，更典型的至少約20個氨基酸，常常至少約22個氨基酸，更常常至少約24個氨基酸，優(yōu)選至少約26個氨基酸，更優(yōu)選至少約28個氨基酸，在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少約30個或更多氨基酸，如33,37,41,45,49,53,57，等。
術(shù)語”配體”或”結(jié)合組分”指那些能特異性與BAS-1結(jié)合的分子，如，以抗體-抗原型方式。其它相互作用包括，如，配體-受體型，或與BAS-1相關(guān)的化合物，例如通過蛋白-蛋白相互作用，共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合。該分子可為一聚合物或化學(xué)試劑。除相互作用具有特異的親和性外，關(guān)于在配體-受體相互作用中BAS-1是配體還是受體沒有指定。功能性類似物可能是結(jié)構(gòu)修飾的配體，或完全無關(guān)的一個分子，它具有與適當(dāng)?shù)呐潴w結(jié)合決定區(qū)相互作用的分子形狀。配體可為激動劑或拮抗劑，見如，Goodman，等(編)(1990)Goodman和Gilman治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)(8版)，Pergamon出版社。
多肽或其片段的溶解度取決于環(huán)境及多肽。許多參數(shù)影響多肽的溶解度，包括溫度，電解質(zhì)環(huán)境，多肽的大小及分子特征，以用溶劑的性質(zhì)。通常，多肽所用溫度為約4℃至約65℃的范圍。常用溫度大于約18℃，更常見大于約22℃。用于診斷目的時，常用溫度為約室溫或更熱，但低于試驗(yàn)中組分的變性溫度。用于治療目的時，溫度常為體溫，對人通常為大約37℃，盡管在一定條件下原位或體外溫度可能會升高或降低。
電解質(zhì)通常接近原位生理?xiàng)l件，但也可能修改至更有利的更高或更低的離子強(qiáng)度。實(shí)際離子強(qiáng)度可被調(diào)整至與生理或分析條件下所用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液一致。
多肽的大小和結(jié)構(gòu)通常應(yīng)該處于基本穩(wěn)定狀態(tài)，通常不處于變性狀態(tài)。多肽可在四級結(jié)構(gòu)上與其它多肽相關(guān)聯(lián)，如，來調(diào)節(jié)溶解性，或以類似天然磷脂雙分子層相互作用方式與磷脂或去污劑相關(guān)聯(lián)。特別地，人們深信，天然蛋白常通過PI鍵與脂質(zhì)相連。
溶劑通常為生物學(xué)可相容的緩沖液，用于保持生物活性的類型，并且通常接近于生理溶劑。溶劑通常具有中性pH值，一般在約5和10之間，優(yōu)選約7.5。有些情況下，加入去垢劑，通常為溫和的，非變性的，如CHS(膽甾醇單琥珀酸酯)或CHAPS(3-([3-膽胺丙基]二甲氨基)-1-丙基硫酸酯)，或以足夠低的去垢劑濃度而不至影響蛋白的三級結(jié)構(gòu)。
溶解性通過以Svedberg單位測定的沉降反映，即測定在特定條件下分子的沉降速度。典型的沉降速度測定在分析用超速離心機(jī)中進(jìn)行，但目前常在標(biāo)準(zhǔn)超速離心機(jī)中進(jìn)行。參見，F(xiàn)reifelder(1982)物理生物化學(xué)(2版)，W.H.Freeman；和Cantor及Schimmel(1980)生物物理化學(xué)1-3部分，W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco.粗略測定時，含推定的可溶多肽的樣品在標(biāo)準(zhǔn)全尺寸的超速離心機(jī)上以大約50Krpm的速度旋轉(zhuǎn)約10分鐘，可溶性分子保留在上清中。可溶性的微?；蚨嚯耐ǔ５陀诩s30S，更常見低于約15S，通常低于約10S，更常見低于約6S，在一特定的實(shí)施方案中，優(yōu)選低于約4S，更優(yōu)選低于約3S。
Ⅲ．物理變種本發(fā)明還包括具有基本上與人類BAS-1的氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白或肽。包括，如，1倍，2倍，和3倍保守的取代。優(yōu)選取代遠(yuǎn)離保守的半胱氨酸，通常在遠(yuǎn)離螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)的區(qū)域。這樣的變種對于產(chǎn)生特異抗體有用，并且常有許多或全部共同的生物學(xué)性質(zhì)。
氨基酸序列的同一性通過優(yōu)化殘基配對測定。當(dāng)將保守取代作為配對物時有所變化。保守取代通常包括以下組內(nèi)的取代甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；及苯丙氨酸，酪氨酸。在各個代表性蛋白序列中還以類似的氨基酸序列來包含天然的等位基因變種。典型的同源蛋白或肽具有85-100％(若可引入分歧)至90-100％的同一性(若包括保守取代)，而測定人類BAS-1的氨基酸序列同一性是至少約85％，通常至少約87％，常常至少約89％，典型的至少約91％，常至少約93％，更常見至少約95％，優(yōu)選至少約97％，更優(yōu)選至少約98％，在一特別優(yōu)選實(shí)施方案中至少約99％或更多。還可參見，Needleham，等(1970)分子生物學(xué)雜志48:443-453；Sankoff等(1983)Time Wrps,String Edits，及大分子序列比較的理論和實(shí)踐第一章Addison-Wesley,Reading,MA；及IntelliGenetics軟件包，Mountain View,CA；及Wisconsin遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，Madison,WI。
分離的人類BAS-1DNA可被核苷酸取代，核苷酸缺失，核苷酸插入，核苷酸延伸的顛倒來修飾。這些修飾可導(dǎo)致編碼有用抗原，其衍生物，或具有相似或相反活性的蛋白的新DNA序列。這些修飾序列可用來產(chǎn)生突變抗原或增強(qiáng)表達(dá)。增強(qiáng)的表達(dá)可涉及基因擴(kuò)增，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，翻譯增強(qiáng)，和其它機(jī)制。這樣的BAS-1突變衍生物包括各個蛋白或其片段預(yù)定的或位點(diǎn)特異突變?！巴蛔傿AS-1”包括一多肽，其另外具有和上述人類BAS-1相同的重要特點(diǎn)，卻通過缺失，取代，或插入的方法具有與天然發(fā)現(xiàn)的BAS-1不同的氨基酸序列。特別地，“位點(diǎn)特異突變BAS-1”定義為與SEQID NO2定義的抗原同源，且具有這些抗原的各種生物學(xué)功能。類似的概念用于不同的BAS-1蛋白，特別是在其它靈長類中發(fā)現(xiàn)的。如前指出，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)描述一般是指包括另外的BAS-1蛋白，而不僅僅局限于具有討論的人類的實(shí)施方案。
盡管位點(diǎn)特異突變點(diǎn)是預(yù)先確定的，突變并不需是位點(diǎn)特異的。人類BAS-1突變可通過氨基酸插入或缺失來實(shí)現(xiàn)?？梢园l(fā)生取代，缺失，插入，或任何組合以得到最終構(gòu)建物。插入包括氨基或羧基端融合。隨機(jī)突變可引入靶密碼子，然后對表達(dá)突變物篩選預(yù)期活性。在具有已知序列的DNA預(yù)定位點(diǎn)進(jìn)行取代突變的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如，通過M13引物突變。參見Sambrook，等(1989)和Ausubel，等(1987和附錄)。
DNA的突變一般不應(yīng)使編碼序列置于讀碼框架之外且優(yōu)選不產(chǎn)生可雜交產(chǎn)生二級mRNA結(jié)構(gòu)如環(huán)或發(fā)夾互補(bǔ)區(qū)。
本發(fā)明還提供重組蛋白，例如，利用這些蛋白片段的異源重組蛋白。異源融合蛋白是自然中不以相同方式正常融合的蛋白或片段的融合物。這樣，免疫球蛋白和BAS-1多肽的融合產(chǎn)物是一連續(xù)的蛋白分子，具有以典型肽鍵連接的序列，一般作為單一的翻譯產(chǎn)物并具有每一種源肽產(chǎn)生的性質(zhì)。相似的概念用于異源核酸序列。
另外，還可通過結(jié)合其它蛋白的相似功能區(qū)來產(chǎn)生新構(gòu)建物。例如，配體結(jié)合或其它片段可在不同的新融合多肽或片段間交換。參見，如，Cunningham，等(1989)科學(xué)243:1330-1336；和O’Down，等(1988)生物化學(xué)雜志263:15985-15992。這樣，顯示新的特異性結(jié)合的新的嵌合多肽將來自配體結(jié)合特異性和其它功能區(qū)的功能連接。
由Beaucage和Carruthers(1981)四面體通訊22:1859-1862描述的亞磷酰胺法，可產(chǎn)生合適的合成DNA片段。通常通過合成互補(bǔ)鏈并在合適條件下使鏈退火或通過利用帶有合適引物序列的DNA聚合酶加入互補(bǔ)鏈得到雙鏈片段。
Ⅳ．功能變種阻斷對BAS-1抗原的生理反應(yīng)可通過抑制配體和BAS-1的結(jié)合得到，可能通過競爭抑制。由此，本發(fā)明的體外測定經(jīng)常使用分離的蛋白，表達(dá)重組BAS-1細(xì)胞的膜，含有這些抗原的配體結(jié)合片段的可溶性片段，或連于固相底物的片段。這些測定也允許診斷性測定結(jié)合片段突變和修飾或配體突變和修飾，例如配體類似物。
本發(fā)明也解釋了候選藥物的篩選方法的應(yīng)用，例如，其中抗原或抗原片段的中和抗體與受試化合物競爭結(jié)合蛋白。用這種方式，抗體可用于檢測任何具有一或多個抗原結(jié)合位點(diǎn)的多肽的存在，并可用于占據(jù)蛋白另外被配體占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)。
另外，針對含有高親和力結(jié)合位點(diǎn)的BAS-1和BAS-1可溶性片段的中和抗體，可用于抑制組織中的配體功能，例如，組織的非正常生理。
BAS-1抗原的“衍生物”包括氨基酸序列突變，糖化變異體，和共價(jià)或聚集連于其它化學(xué)部分。共價(jià)衍生物可通過BAS-1氨基酸側(cè)鏈或N-或C-末端中發(fā)現(xiàn)的功能基團(tuán)連接，用本領(lǐng)域熟知的方法制備。這些衍生物包括，不限定，羧基未端的脂肪酯或酰胺，或含羧基側(cè)鏈的殘基，含羥基殘基的O-?；苌?，和氨基末端氨基酸或含氨基殘基的N-酰基衍生物，例如，.賴氨酸，精氨酸.?；鶊F(tuán)從包括C3到C18正常烷基的烷基部分，以形成烷?；减；N類的組中選取。
特別的，糖化改變包括，例如在多肽的合成或加工，或進(jìn)一步加工過程中改變糖化的方式。特別優(yōu)選完成此步的方法是將多肽暴露于源自正常產(chǎn)生這些加工的細(xì)胞的糖基化酶，如人類糖基化酶。去糖基化酶也如此考慮。具有其它最小修飾的，包括磷酰基化氨基酸殘基例如磷酪氨酸，磷絲氨酸，或磷蘇氨酸相同一級氨基酸序列的版本也可接受。
衍生物的一主要組是BAS-1抗原或其片段和其它蛋白或多肽的共價(jià)接合物，這些衍生物可在重組培養(yǎng)中合成，例如N-或C-末端融合或應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的試劑通過反應(yīng)性側(cè)鏈基團(tuán)交聯(lián)蛋白。優(yōu)選的交聯(lián)試劑配體衍生化位點(diǎn)為游離氨基，糖部分，和半胱氨酸殘基。
也提供了BAS-1抗原和其它同源或異源蛋白的融合多肽。同源多肽由不同的表面標(biāo)記融合，產(chǎn)生，例如，具有一個或更多標(biāo)記蛋白配體特異性的雜化多肽。類似的，異源融合可構(gòu)建具有衍生蛋白的特性或活性結(jié)合。典型的例子為融合報(bào)告多肽，例如，熒光素酶，有抗原的片段或區(qū)域，例如，配體結(jié)合片段，這樣目的配體的存在和定位可以容易地測定。參見，例如，Dull，等美國專利4,859,609此處引為參考文獻(xiàn)。其它基因融合配偶體包括細(xì)菌β-半乳糖苷酶，trpE，蛋白A,β-乳糖酶，α淀粉酶，乙醇脫氫酶，和酵母α結(jié)合因子。參見，例如，Godowski，等(1988)科學(xué)241:812-816。
由Beaucage和Carruthers(1981)四面體通訊22:1859-1862描述的亞磷酰胺法，可產(chǎn)生合適的合成DNA片段。經(jīng)常通過合成互補(bǔ)鏈并在合適條件下退火或通過利用帶有合適引物序列的DNA聚合酶加入互補(bǔ)鏈得到雙鏈片段。
這樣的多肽也可以具有已被磷酸化，磺?；?，生物素化，或加入或去掉其它部分，特別是與磷酸基團(tuán)形狀類似的分子而化學(xué)修飾的氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，修飾可作為有用的標(biāo)記試劑，或作為純化靶點(diǎn)，例如，親和配體。
融合蛋白一般可通過重組核酸方法或合成多肽方法制備。核酸制備和表達(dá)的技術(shù)在，例如，Sambrook，等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(第二版)，1-3卷，冷泉港實(shí)驗(yàn)室中一般性描述。合成多肽的技術(shù)在，例如，Merrifield(1963)美國化學(xué)會雜志85:2149-2156；Merrifield(1986)科學(xué)232:341-347；和Atherton等(1989)固相多肽合成操作方法，IRL出版社，Oxford中描述。
本發(fā)明也涉及了BAS-1抗原的衍生物而不只是氨基酸序列或糖化的變種的應(yīng)用。這些衍生物可涉及化學(xué)部分的共價(jià)或聚集聯(lián)系。這些衍生物一般分為三類(1)鹽，(2)側(cè)鏈和末端殘基的共價(jià)修飾，和(3)吸附復(fù)合物，例如，和細(xì)胞膜吸附。此類共價(jià)或聚合衍生物可用作免疫原，作為免疫測定試劑，或純化方法例如配體或其它結(jié)合配體的親和純化中的試劑。例如，BAS-1抗原可通過本領(lǐng)域熟知的方法，共價(jià)結(jié)合固定于固相載體如溴化氰活化的葡聚糖，或吸附至聚烯烴表面，有或沒有戊二醛交聯(lián)，用于檢測或純化抗BAS-1抗體或其配體。BAS-1抗原也可用可檢測基團(tuán)標(biāo)記，例如用氯胺T法放射性碘標(biāo)記，共價(jià)結(jié)合于稀土螯合物，或綴合與另一熒光部分用于診斷測定。
本發(fā)明的增溶BAS-1抗原可用作產(chǎn)生抗原或其片段特異抗體或抗血清的免疫原。純化抗原可用來篩選用不同形式含有該蛋白的不純制劑免疫而制備的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段。特別是，“抗體”一詞也包括天然抗體的抗原結(jié)合片段。純化的BAS-1可用作檢測應(yīng)答于提高水平的BAS-1或含抗原的細(xì)胞片段的存在而產(chǎn)生的抗體的試劑，兩者都對非正?；蛱禺惖纳砘蚣膊顟B(tài)有診斷意義。另外，BAS-1片段也可作為產(chǎn)生本發(fā)明抗體的免疫原，如下描述。例如，本發(fā)明涉及針對SEQ ID NO1的氨基酸序列，或由SEQ ID NO1所示核苷酸編碼的氨基酸序列或其片段的抗體。特別的，本發(fā)明涉及對被預(yù)測位于脂雙層以外的特異片段具有結(jié)合親和性或針對被預(yù)測位于脂雙層以外的特異片段的抗體。另外，不同的構(gòu)建物可通過融合膜相關(guān)片段和該分子的細(xì)胞外暴露部分而產(chǎn)生。
本發(fā)明涉及另外的緊密相關(guān)的變種的分離。很可能存在于不同個體的等位變種具有，例如，與本文描述的實(shí)施方案超過90-97％的同一性。
本發(fā)明也提供了分離一組在結(jié)構(gòu)，表達(dá)和功能上有明顯和相似的相關(guān)抗原的方法。通過抗原獨(dú)特的物種對應(yīng)物的分離和定性，將大大促進(jìn)抗原的許多生理功能的闡明。特別的，本發(fā)明提供了用于分辨其它不同物種中另外的同源遺傳物的有用的探針。
分離的基因可轉(zhuǎn)染無BAS-1表達(dá)的細(xì)胞，例如，缺乏相應(yīng)的抗原且具有陰性背景活性的物種或細(xì)胞。轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)可分離具有定義的或單一的物種變種的抗原純細(xì)胞株。此過程可允許更敏感的檢測和區(qū)分任何配體的生理效果。亞細(xì)胞片段，例如，細(xì)胞質(zhì)或膜片段，可被分離應(yīng)用。
分析影響配體提供的各種不同功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)元件，利用標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)是可能的，特別是在相關(guān)類的成員比較中。參見，例如，類似物掃描突變技術(shù)，Cunningham等描述，(1989)科學(xué)243:1339-1336；和O’Dowd等所用方法(1988)生物化學(xué)雜志263:15985-15992；和Lechleiter等(1990)EMBO J.9:4381-4390。
特別的，配體結(jié)合片段可在物種變種間取代以測定哪一個結(jié)構(gòu)特征是對配體結(jié)合親和性和特異性都重要的。一列不同的BAS-1變種用于篩選具有與不同變種相互作用結(jié)合特性的配體。
細(xì)胞內(nèi)功能可能涉及正?？蛇M(jìn)入細(xì)胞溶膠的抗原片段。然而，抗原內(nèi)化可能發(fā)生于某種情況，且細(xì)胞內(nèi)元件和指定的細(xì)胞外片段的相互作用可能發(fā)生。BAS-1和細(xì)胞內(nèi)其它元件相互作用的特殊片段可提供突變或直接生化方法分辨，例如交聯(lián)或親和的方法。通過結(jié)晶或其它物理方法分析結(jié)構(gòu)也是可行的。信號傳導(dǎo)機(jī)制的進(jìn)一步研究將包括用親和方法可分離的相關(guān)組分的研究。
將進(jìn)行BAS-1抗原的表達(dá)和控制的進(jìn)一步研究。與抗原相關(guān)的控制元件具有差別發(fā)育，組織特性，或其它表達(dá)方式。上游或下游基因區(qū)，例如，控制元件，是令人感興趣的。
BAS-1抗原的結(jié)構(gòu)研究將導(dǎo)致設(shè)計(jì)新配體，特別是具有激動或拮抗特性的類似物。這可結(jié)合以前描述的篩選方法分離具有期望特性譜的配體。
在其它細(xì)胞類型中的表達(dá)往往導(dǎo)致特定抗原的糖化區(qū)別。不同變種顯示基于結(jié)構(gòu)區(qū)別而非氨基酸序列區(qū)別的不同功能。不同修飾可能導(dǎo)致不同功能，影響的闡明目前是可能的。
由此，本發(fā)明提供重要的發(fā)展的抗原和從它們發(fā)展來的試劑。盡管以前的描述主要集中在人類BAS-1，本發(fā)明技術(shù)熟練人員將立即認(rèn)識到本發(fā)明包括其它BAS-1抗原，例如，靈長類和其它哺乳動物物種變種。
Ⅴ．抗體抗體可從BAS-1抗原和其片段不同等位變種，以天然存在形式或重組方式獲得。另外，抗BAS-1抗體可以活性形式或失活形式獲得。也涉及抗獨(dú)特型抗體。
抗體，包括結(jié)合片段和單鏈模型，針對預(yù)先決定的BAS-1片段可通過用片段和免疫原蛋白的接合物免疫動物獲得。單克隆抗體從分泌期望抗體的細(xì)胞制備。這些抗體可篩選結(jié)合于正?；蛉毕軧AS-1，或篩選激活或拮抗配體活性。這些單克隆抗體通常以至少好于大約1mM的KD結(jié)合，更通常好于約300μM，典型地好于約10μM，更典型的好于約30μM，優(yōu)選好于約10μM，更優(yōu)選好于約3μM，如，1μM,300nM,100nM,30nM,10nM,3nM,1nM,300pM,100pM,30pM等。
本發(fā)明的抗體，包括抗原結(jié)合片段，具有顯著的診斷或治療價(jià)值。它們可以是強(qiáng)拮抗劑，與BAS-1結(jié)合并抑制配體的結(jié)合或抑制配體產(chǎn)生生物學(xué)應(yīng)答的能力。它們亦可用作非中和抗體，并且可以與毒素或放射性核素偶連，從而使當(dāng)抗體與抗原結(jié)合時，細(xì)胞被自身殺死。進(jìn)一步地，這些抗體可直接或通過一連接臂間接地綴合于藥物或其它治療試劑。
本發(fā)明的抗體還可用于診斷應(yīng)用中。作為捕獲或非中和抗體，它們能結(jié)合于BAS-1而不抑制配體結(jié)合。作為中和性抗體，它們可用于競爭結(jié)合試驗(yàn)。它們還可用于檢測或定量BAS-1或其配體。
BAS-1片段可連接于其它材料，特別是多肽，如融合或共價(jià)結(jié)合多肽以用作免疫原。BAS-1和其片段可融合或共價(jià)連接于各種免疫原，如匙孔血藍(lán)蛋白，牛血清白蛋白，破傷風(fēng)毒素，等。見微生物學(xué)，HoeberMedical Division,Harper and Row,1969；Landsteiner(1962)血清學(xué)反應(yīng)的特異性，Dover Publications，紐約，和williams，等(1967)免疫學(xué)和免疫化學(xué)方法，第一卷，Academic Press，紐約，描述了制備多克隆抗血清的方法。典型方法涉及用抗原對動物超免疫法。重復(fù)免疫后立即收集動物的血并分離γ球蛋白?；颍占?xì)胞以產(chǎn)生雜交瘤。
某些情況下，期望從不同的哺乳動物宿主中制備單克隆抗體，例如小鼠，嚙齒類，靈長類，人類，等。制備這些單克隆抗體的技術(shù)的描述可在以下找到，例如，Stites，等(eds)基礎(chǔ)和臨床免疫(第四版)，LangeMedical Publication,Los Altos,CA，和其中所引用文獻(xiàn)；Harlow和Lane(1988)抗體實(shí)驗(yàn)室手冊，CSH出版；Goding(1986)單克隆抗體原理和實(shí)踐(第二版)Academic Press，紐約；特別是Kohler和Milstein(1975)自然256:495-497，討論了一種產(chǎn)生單克隆抗體的方法。簡要地總結(jié)，此方法涉及用免疫原注射動物。然后處死動物并取脾細(xì)胞，和骨髓瘤細(xì)胞融合。產(chǎn)生雜交細(xì)胞或雜交瘤能在體外復(fù)制。然后篩選雜交瘤以分離單克隆，每一株分泌對免疫原的單一一種抗體。以此方法，獲得的單個抗體是應(yīng)答識別免疫原物質(zhì)的特異位點(diǎn)，而產(chǎn)生的免疫動物的無限增殖化的和克隆的單一B細(xì)胞的產(chǎn)物。
其它適合的技術(shù)涉及體外將淋巴細(xì)胞暴露與抗原多肽或可選擇地選擇噬菌體或類似載體中的抗體庫。見，Huse，等，(1989)“λ噬菌體中產(chǎn)生的巨大免疫球蛋白所有組成成分的重組庫”科學(xué)246:1275-1281和Ward，等(1989)自然341:544-546。本發(fā)明的多肽和抗體修飾或未修飾均可應(yīng)用，包括嵌合或人源化抗體。經(jīng)常的，多肽和抗體通過連接，共價(jià)或非共價(jià)，以產(chǎn)生有可檢測信號的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。大量的標(biāo)記和綴合技術(shù)已在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中廣泛報(bào)道。合適的標(biāo)記包括，放射性同位素，酶，底物，協(xié)同因子，抑制劑，熒光素部分，化學(xué)發(fā)光部分，磁性顆粒，諸如此類。提供這些標(biāo)記的使用的專利包括美國專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。重組免疫球蛋白也可產(chǎn)生，見Cabilly，美國專利4,816,567。
本發(fā)明的抗體還可用于親和層析分離蛋白?？贵w連接于固相載體，例如，顆粒如瓊脂糖，葡聚糖，或此類，制備柱子，其中細(xì)胞裂解液可過柱，洗柱，接著以升高濃度的溫和變性液過柱，由此純化的BAS-1蛋白會被釋放。
抗體還可用于對表達(dá)文庫篩選特定的表達(dá)產(chǎn)物。通常用于此法的抗體用使通過抗體結(jié)合而易于檢測抗原的存在的部分標(biāo)記。
針對BAS-1抗原的抗體也可用于產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。這可用于檢測或診斷和各個抗原表達(dá)相關(guān)的不同的免疫球蛋白條件。
Ⅵ．核酸人類BAS-1探針，或其片段，可用于從其它物種中識別或分離編碼同源蛋白的核酸，或同一或其它物種中的其它相關(guān)蛋白。
本發(fā)明涉及用分離的DNA或片段編碼生物活性相關(guān)BAS-1多肽的應(yīng)用。另外，本發(fā)明涉及編碼生物活性蛋白或多肽的分離或重組的DNA，其能在適合條件下與這里所描述的DNA序列雜交。所述生物活性蛋白或多肽可以是完整的BAS-1，或片段，具有SEQ ID NO1所示的核酸編碼的氨基酸序列。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及分離或重組的DNA，或其片段的應(yīng)用，其編碼與BAS-1同源的蛋白或用編碼人類BAS-1的cDNA作為探針分離得到。分離的DNA具有獨(dú)立的5’和3’側(cè)翼調(diào)控序列，例如，啟動子，增強(qiáng)子，聚腺苷酸附加信號，和其它。
“分離”的核酸是一種核酸，例如，一種QNA,DNA或混合的聚合物，其基本上從出發(fā)物種的天然伴隨一天然序列的其它成分的核糖體，聚合酶，和側(cè)翼基團(tuán)組序列中分離。本發(fā)明涉及從天然發(fā)生環(huán)境中分離的核酸序列，并包括重組或克隆DNA分離物和化學(xué)合成類似物或異源系統(tǒng)合成的生物類似物。基本上純的分子包括分子的分離形式。
分離的核酸一般是分子的同源組分，但，在某些實(shí)施方案中含有少量異源。異源性一般在聚合物末端或?qū)︻A(yù)期生物功能和活性不關(guān)鍵的部分。
“重組”核酸通過其產(chǎn)生方法或其結(jié)構(gòu)而定義。根據(jù)其產(chǎn)生的方法，例如，通過一種方法制備的一種產(chǎn)物，該過程利用重組核酸技術(shù)，例如，涉及人工干預(yù)核酸序列?；蛘?，可以是一核酸序列，通過含有天然并不相連的兩個片段的融合，但是指排除天然產(chǎn)物，例如，天然發(fā)生的突變，的序列產(chǎn)生。由此，例如，包括用任何非天然發(fā)生的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的來制備產(chǎn)物，如用含有利用任何合成寡核苷酸方法得來序列的核酸。經(jīng)常這樣做，用其它編碼同一或保守氨基酸的豐余密碼子取代某一密碼子，同時一般引入或去除，例如，限制性或序列識別位點(diǎn)?；蛘?，將預(yù)期功能的核酸序列連起來以產(chǎn)生具有普通天然形式中沒有的結(jié)合功能的單一遺傳物。限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)經(jīng)常是這樣的人工操作的靶點(diǎn)，但其它位點(diǎn)特異靶點(diǎn)，例如啟動子，DNA復(fù)制位點(diǎn)，調(diào)控序列，控制序列，或其它有用特點(diǎn)可設(shè)計(jì)摻入。類似的概念推廣至重組，例如，融合，多肽。特別包括合成核酸，通過遺傳密碼的豐余性編碼這些抗原的類似多肽或片段，和不同物種變種來源的融合序列。
核酸中的“片段”是至少17個核苷酸的連續(xù)部分，一般至少20個核苷酸，更一般至少約23個核苷酸，通常至少約26個核苷酸，更通常至少約29個核苷酸，經(jīng)常至少約32個核苷酸，更經(jīng)常至少約35個核苷酸，典型至少約38個核苷酸，更典型至少約41個核苷酸，普遍至少約44個核苷酸，更普遍至少約47個核苷酸，優(yōu)選至少約50個核苷酸，更優(yōu)選至少約53個核苷酸，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中將至少約56個或更多的核苷酸，例如60,75,100,150,200,250,300，等。
編碼BAS-1蛋白的DNA特別可用于識別編碼相關(guān)或同源抗原的基因，mRNA,cDNA種類，同樣用于鑒別編碼不同物種的同源蛋白的DNA。不同的BAS-1蛋白序列類似并在此涉及。然而，即使與BAS-1有更遠(yuǎn)的進(jìn)化關(guān)系的蛋白也可用這些序列穩(wěn)定分離，若其具有足夠的相似性。最感興趣的是原始BAS-1蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步包括具有與此前的分離DNA序列一致或高度同源的DNA序列的重組DNA分子和片段。特別是，序列經(jīng)常操作連于控制轉(zhuǎn)錄，翻譯，DNA復(fù)制的DNA片段?；蛘?，衍生自基因組序列的重組克隆，例如，含有內(nèi)含子的重組克隆，可用于轉(zhuǎn)基因研究，包括，例如轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或器官，和基因治療。見，例如，Doodnow(1992)“轉(zhuǎn)基因動物”Roitt(編)免疫學(xué)全書Academic Press,San Diego,1502-1504頁；Travis(1992)科學(xué)256:1392-1394；Kuhn，等(1991)科學(xué)254:707-710；Capecchi(1989)科學(xué)244:1288Robertson(1987)(編)畸肽瘤和胚胎干細(xì)胞操作指南IRLPress,Oxford；和Rosenberg(1992)臨床腫瘤雜志10:180-199。
比較同源核酸序列，表現(xiàn)出顯著的序列相似性。核酸同源性的標(biāo)準(zhǔn)一般或通過本領(lǐng)域常用的序列比較或者以基因雜交條件為基礎(chǔ)來測定同源性。以下更詳細(xì)描述了雜交條件。
核酸序列比較的基本同一性指比較該片段，或其互補(bǔ)鏈，當(dāng)插入或缺失適當(dāng)?shù)暮塑账岫顑?yōu)匹配時，至少約50％核苷酸，一般至少約56％核苷酸，更一般至少約59％核苷酸，通常至少約62％核苷酸，更通常至少約65％核苷酸，經(jīng)常至少約68％核苷酸，更經(jīng)常至少約71％核苷酸，典型至少約74％核苷酸，更典型至少約77％核苷酸，普遍至少約80％核苷酸，更普遍至少約85％核苷酸，優(yōu)選至少約90％核苷酸，更優(yōu)選至少約95％至98％或更多核苷酸，在特別實(shí)施方案中高達(dá)99％或更多的核苷酸，是一致的。或者，當(dāng)片段在選擇的雜交條件下與一條鏈，或其互補(bǔ)鏈，典型用SEQ IDNO1衍生的序列雜交時存在基本的同一性。典型的，當(dāng)存在至少約14個核苷酸的鏈上至少約55％同源性時，優(yōu)選至少約65％，更優(yōu)選至少約75％，最優(yōu)選至少約90％，選擇性雜交可以發(fā)生。見，Kanehisa(1984)核酸研究12:203-213。同源性比較的長度，如述，可以是更長的鏈，在某實(shí)施方案中是至少約17核苷酸的鏈，一般至少約20個核苷酸，更一般至少約24個核苷酸，典型至少約28個核苷酸，更典型至少約40個核苷酸，優(yōu)選至少約50個核苷酸，更優(yōu)選至少約75-100或更多個核苷酸，例如125,150,200,250,300，等。
嚴(yán)格的條件，考慮到雜交過程中的一致，是鹽，溫度，有機(jī)溶劑，和其它雜交反應(yīng)中通?？刂频某?shù)的嚴(yán)格條件結(jié)合。嚴(yán)格的溫度條件通常包括超過約30℃的溫度，更通常超過約37℃的溫度，一般超過約45℃，更一般超過約55℃，優(yōu)選超過約65℃的溫度，更優(yōu)選超過約70℃的溫度。嚴(yán)格的鹽條件一般少于約500mM，通常少于約350mM，更通常少于約200mM，典型少于約150mM，優(yōu)選少于約100mM，更優(yōu)選少于約50mM。然而這些常數(shù)的結(jié)合比任何單獨(dú)常數(shù)的測定重要的多。參見，例如Wetmur和Davidson(1968)分子生物學(xué)雜志31:349-370。
來自其它人類個體的BAS-1可通過雜交或PCR被克隆和分離?；蛘?，在表達(dá)克隆過程中制備具有較少等位基因特異性的抗體是有用的。等位變種可用，例如過量PCR和序列分析結(jié)合，例如，用特定引物，測定，以提供人群中等位變種的信息。
Ⅶ．制備BAS-1；模擬編碼BAS-1抗原或片段的DNA可通過化學(xué)合成，篩選來自多種細(xì)胞株或組織標(biāo)本的cDNA文庫，或基因組文庫得到。
此DNA可在多種宿主細(xì)胞中表達(dá)以合成全長抗原或片段，其反過來可用于產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體；用于結(jié)合研究；用于構(gòu)建和表達(dá)修飾分子；用于結(jié)構(gòu)/功能研究。每一抗原或其片段可在用合適表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中表達(dá)。這些分子可以是基本上純化的，不含蛋白或細(xì)胞內(nèi)容物，例如，重組宿主來源的，且當(dāng)結(jié)合可藥用載體和/或稀釋劑時特殊用于藥物組合物?？乖?，或其部分，可作為與其它蛋白融合表達(dá)。
表達(dá)載體是典型的含有目的抗原或其片段的自身復(fù)制DNA或RNA構(gòu)建物。通?？刹僮鞯剡B于合適的適當(dāng)宿主細(xì)胞中識別的合適的遺傳控制元件。這些控制元件可影響合適宿主中的表達(dá)。影響表達(dá)所需的特異類型控制元件依賴于所用可能發(fā)生的宿主細(xì)胞。通常，遺傳控制元件可包括原核啟動子系統(tǒng)或真核啟動子表達(dá)控制系統(tǒng)，且典型包括轉(zhuǎn)錄啟動子，控制轉(zhuǎn)錄起始的任選的操縱子，提高mRNA表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，編碼合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列，終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。表達(dá)載體通常也含有一個復(fù)制起始點(diǎn)使載體能不依賴于宿主細(xì)胞而復(fù)制。
本發(fā)明的載體含有編碼人類BAS-1抗原，或其片段的編碼生物活性多肽的DNA。DNA可在病毒啟動子控制下并可編碼選擇標(biāo)記。本發(fā)明進(jìn)一步涉及能在原核或真核宿主中表達(dá)編碼人類BAS-1抗原的真核cDNA的表達(dá)載體的應(yīng)用，其中載體相容于宿主且編碼抗原的真核cDNA插入載體以便含有載體的宿主生長表達(dá)所述cDNA。通常，表達(dá)載體設(shè)計(jì)為可在其宿主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制或擴(kuò)增以大大增加每一細(xì)胞中的目的基因的拷貝總數(shù)。并不是總需要表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制，例如，用不含宿主細(xì)胞可識別復(fù)制起始點(diǎn)的載體影響抗原或其片段在不同宿主中瞬時表達(dá)是可能的。用引起人類BAS-1基因或其片段通過重組整合入宿主DNA的載體也是可能的。
載體，如此處所用，包括質(zhì)粒，病毒，細(xì)菌噬菌體，可整合DNA片段，和其它能將DNA片段整合入宿主基因組中的載體。表達(dá)載體是含有遺傳控制元件影響操作相連基因的表達(dá)的特殊載體。質(zhì)粒是最普遍載體應(yīng)用形式但具有相同功能其它所有其它載體形式，是，或正被，本領(lǐng)域所熟知，適合此處應(yīng)用。參見，例如，Pouwels，等(1985和附錄)克隆載體實(shí)驗(yàn)室手冊，Elsevier，紐約，和Rodriquez，等(1988)(編)載體分子克隆載體和其應(yīng)用縱覽，buttersworth,Boston,MA。
轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是那些以重組DNA技術(shù)構(gòu)建的人類BAS-1載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞通常表達(dá)抗原或其片段，但對于克隆，擴(kuò)增，和操縱其DNA的目的，不需表達(dá)此蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，這樣允許蛋白在培養(yǎng)基中積累。蛋白可從培養(yǎng)物或培養(yǎng)基中回收。
為本發(fā)明的目的，彼此功能相關(guān)的DNA序列可操作地連接起來。例如，前序列或分泌引導(dǎo)物的DNA被可操作地連于多肽，若它被以前蛋白表達(dá)或參與指導(dǎo)多肽到細(xì)胞膜或多肽分泌。若控制多肽的轉(zhuǎn)錄，啟動子被可操作地連接于編碼序列；若定位允許翻譯，核糖體結(jié)合位點(diǎn)被可操作地連于編碼序列。通常合適的操作連接指連續(xù)并符合讀碼框架，然而，某些遺傳元件，如阻遏基因并不是連續(xù)連接，但仍結(jié)合操縱子序列，隨之控制表達(dá)。
合適的宿主細(xì)胞包括原核生物，低等真核和高等真核生物。原核生物包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性微生物，例如，大腸桿菌和枯草桿菌。低等真核生物包括酵母，例如，啤酒糖酵母(S.cerevisiae)和畢赤氏酵母屬(pichia)，和網(wǎng)狀原蟲(Dictyostelium)屬的物種。高等真核生物包括從動物細(xì)胞建立的組織培養(yǎng)細(xì)胞株，包括非哺乳動物來源，例如昆蟲細(xì)胞，鳥，和哺乳動物來源例如，人類，靈長類和嚙齒類。
原核宿主載體系統(tǒng)包括許多不同物種的各種載體。如此處所用，大腸桿菌和其載體被普遍應(yīng)用，包括其它原核生物中所用相應(yīng)載體。用于擴(kuò)增DNA的代表性載體是pBR322或其許多衍生物?？捎糜诒磉_(dá)人類BAS-1抗原或其片段的載體包括，但不限于，這些含有l(wèi)ac啟動子(pUC系列)的啟動子；trp啟動子(pBR322-trp)；Ipp啟動子(pIN系列)；λ-pP或pR啟動子(pOTS)；或雜交啟動子，如ptac(pDR540)。參見Brosius，等(1988)“用λ-,trp-,lac-,Ipp衍生啟動子的表達(dá)載體”，Rodriguez和Denhardt(編著)載體分子克隆載體和其應(yīng)用縱覽，Butersworth,Boston，第10章，205-236頁。
低等真核生物，例如，酵母和網(wǎng)狀原蟲，可用含人類BAS-1抗原序列載體轉(zhuǎn)化。為本發(fā)明的目的，最普遍的低等真核生物宿主是面包酵母，啤酒糖酵母。盡管也可用若干其它株或種，而它們一般被用作低等真核生物代表。典型的酵母載體包括復(fù)制起始點(diǎn)(除整合型)，選擇基因，啟動子，編碼目的蛋白或其片段的DNA，翻譯終止序列，聚腺苷酸和轉(zhuǎn)錄終止序列。酵母合適的表達(dá)載體包括如3-磷酸甘油酸激酶和各種其它糖解酶基因啟動子的基本啟動子，或如乙醇脫氫酶2啟動子或金屬巰蛋白啟動子的可誘導(dǎo)啟動子。合適的載體包括以下類型的衍生物自身復(fù)制低拷貝數(shù)(如YRp系列)，自身復(fù)制高拷貝數(shù)(如YEp系列)；整合型(如YIp系列)，或微小染色體(如YCp系列)。
高等真核組織培養(yǎng)細(xì)胞是表達(dá)功能活性人類BAS-1抗原蛋白的優(yōu)選宿主細(xì)胞。原則上，許多高等真核組織培養(yǎng)細(xì)胞系是可行的，如，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，無論來自脊椎動物或無脊椎動物。然而，在此過程中協(xié)同翻譯和后翻譯都優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染并繁殖這些細(xì)胞已成為常規(guī)方法。有用細(xì)胞系的例子包括HeLa細(xì)胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，幼鼠腎(BRK)細(xì)胞系，昆蟲細(xì)胞系，鳥細(xì)胞系和猴(COS)細(xì)胞系。這些細(xì)胞系的表達(dá)載體通常包括復(fù)制起始點(diǎn)，啟動子，翻譯起始點(diǎn)，RNA剪切位點(diǎn)(若用基因組DNA)，聚腺苷酸位點(diǎn)，和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。這些載體還通常含有選擇基因或擴(kuò)增基因。合適的表達(dá)載體可為質(zhì)粒，病毒，含有衍生啟動子的反轉(zhuǎn)錄病毒，例如，從腺病毒，SV40，小球病毒，痘苗病毒，涎腺病毒來源的。合適的表達(dá)載體的代表性例子包括pCDNA1；pCD，參見Okayama，等(1985)分子細(xì)胞生物學(xué)，5:1136-1142；pMClneo polyA，參見Thomas等(1987)細(xì)胞51:503-512和桿狀病毒載體如pAC373或pAC610。
經(jīng)常期望在提供特殊或限定糖基化方式的系統(tǒng)中表達(dá)人類BAS-1抗原多肽。這種情況下，將由表達(dá)系統(tǒng)天然提供一般方式。然而，通過把多肽，例如，未糖基化形式暴露于引入異源表達(dá)系統(tǒng)的合適的糖基化蛋白，該方式可被修飾。例如，BAS-1抗原基因可和一個或多個編碼哺乳動物或其它糖基化酶的基因共轉(zhuǎn)染。用這種方法，在原核或其它細(xì)胞中可獲得某種哺乳動物糖基化方式。
BAS-1抗原亦可以和磷脂酰肌醇(PI)連接的方式產(chǎn)生并可通過用磷脂酰肌醇剪切酶，例如，磷脂酰肌醇磷脂酶C處理，從膜上除去。這使抗原以生物活性形式釋放，并允許用標(biāo)準(zhǔn)蛋白化學(xué)方法純化。參見，例如，Low(1989)生物化學(xué)生物物理年鑒988:427-454；Tse等(1985)科學(xué)230:1003-1008；和Brunner，等(1991)細(xì)胞生物雜志114:1275-1283?；蛘?，純化片段可經(jīng)基因工程進(jìn)入序列，例如，在N末端或C末端，以幫助蛋白產(chǎn)物的純化或檢測。去除這樣片段的方法也可是基因工程性的，例如，蛋白酶剪切位點(diǎn)。
既然整個序列已知，人類BAS-1抗原，片段或其衍生物可通過合成多肽的方便方法制備。這包括如Stewart和Young(1984)固相肽合成Pierce Chmical Co.,Rockford,IL；Bodanszky和Bodanszky,(1984)多肽合成實(shí)踐，Springer-Verleg，紐約和Bodanszky,(1984)多肽合成原理，Springer-Verleg，紐約所描述的方法。例如，可用疊氮方法，酰氯方法，酸酐方法，混合酸酐法，活化酯法(例如，對-硝基苯酯，N-羥基琥珀酰亞胺酯，或氰甲酯)，羰基二咪唑法，氧化還原法，或環(huán)己基碳二亞胺(DCCD)/添加法。固相和液相合成均適用上述方法。
人類BAS-1抗原，片段，或衍生物根據(jù)上述肽合成中常用的相同的方法能合適地合成，一般或者通過所謂的逐步合成方法，包括按順序逐一將氨基酸與末端氨基酸縮合，或?qū)㈦钠闻c末端氨基酸偶聯(lián)。偶聯(lián)反應(yīng)中不用的氨基必須保護(hù)以免在不恰當(dāng)?shù)奈恢门悸?lián)。
如果采用固相合成，C末端氨基酸通過其羧基結(jié)合于一不溶性的載體或支持物上，不溶性載體只要能與活性羧基結(jié)合，沒有其它特殊限制。這些不溶性載體例子包括鹵甲基樹脂，如氯甲基樹脂或溴甲基樹脂，羥甲基樹脂，苯酚樹脂，三烷氧羰基-酰肼樹脂，等。
氨基保護(hù)的氨基酸通過其活化羧基與已形成的肽或鏈的反應(yīng)性氨基縮合來結(jié)合到序列中，從而逐步合成肽，全序列合成完畢后從不溶性載體上切下肽而產(chǎn)生肽。該固相合成方法由Merrifield，等(1963)美國化學(xué)會會志85:2149-2156一般性描述。
所制備的抗原及其片段可通過肽分離方法從反應(yīng)混合物中分離和純化，例如。通過提取，沉淀，電泳和各種色譜等。根據(jù)其期望的用途可得到不同等級純度的本發(fā)明的人類BAS-1抗原?？捎帽疚乃龅牡鞍准兓夹g(shù)或用本文所述的抗體在免疫吸附親和色譜上完成純化。免疫吸附親和色譜的進(jìn)行是通過首先將抗體連于固相載體，然后用小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的可溶性裂解液，表達(dá)BAS-1抗原的其它細(xì)胞裂解液，或DNA技術(shù)導(dǎo)致的產(chǎn)生BAS-1抗原的細(xì)胞的裂解液或上清與連接的抗體接觸，見下文。
Ⅷ．用途本發(fā)明提供如本文其它處所述的具有診斷應(yīng)用的試劑，例如，在發(fā)育或生理異常的一般描述，或下文診斷試劑盒的描述。
本發(fā)明也提供具有顯著治療價(jià)值的試劑。人類BAS-1(天然存在或重組)，其片段及其抗體，具有人類BAS-1結(jié)合親和活性的化合物，在對異常B細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)癥狀的治療中有用，包括異常增生，例如，腫瘤情況或退化情況。異常增生，再生，退化，和萎縮可用此處提供的組合物通過適當(dāng)治療來調(diào)節(jié)。例如，和BAS-1的異常表達(dá)或失調(diào)應(yīng)該終止相關(guān)的疾病或失調(diào)應(yīng)該是該抗原激動劑或拮抗劑的可能靶點(diǎn)。BAS-1可能在激活或調(diào)節(jié)B細(xì)胞中起作用，其影響免疫反應(yīng)，例如，自身免疫失調(diào)或變態(tài)反應(yīng)。
另外，BAS-1:BAS-1結(jié)合配偶體相互作用可能涉及T:B細(xì)胞相互作用以允許激活，增生，和/或如高IgM綜合癥中觀察到的天然B細(xì)胞分化。若如此，可用干擾BAS-1:BAS-1結(jié)合配偶體信號傳導(dǎo)來治療?？捎行ё钄嗥湫盘?，例如，通過可溶性BAS-1或BAS-1抗體。
BAS-1:BAS-1結(jié)合配偶體相互作用還可涉及B細(xì)胞母細(xì)胞和中心母細(xì)胞在生發(fā)中心的暗區(qū)大量增生的起始和/或調(diào)節(jié)。參見，例如,Banchereau和Rosset(1992)免疫學(xué)進(jìn)展125:68-877。涉及信號引發(fā)和/或調(diào)節(jié)Ig體細(xì)胞突變過程的細(xì)胞表面相互作用可能也涉及BAS-1，還可能受激活和拮抗作用所調(diào)節(jié)。
各種細(xì)胞類型中其它異常發(fā)育情況中顯示具有，這BAS-1mRNA通過Nothern印跡分析得知。參見Berkow(編)Merck診斷和治療手冊，Merck＆Co.,Rahway,N.J.；和Thorn，等Harrison,s醫(yī)學(xué)原理，McGraw-Hill，紐約。例如，可通過此分子阻斷B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞相互作用獲得治療性免疫抑制。這代表了對自身免疫疾病和器官移植中移植排斥的控制的重要治療手段?；蛘?，可通過阻斷B細(xì)胞上的BAS-1的生長或存活結(jié)果來達(dá)到抗B細(xì)胞腫瘤治療目的。阻斷可受阻斷結(jié)合組分，例如中和抗體，或干擾BAS-1和其反受體相互作用的分子影響?？扇苄訠AS-1可阻斷反受體相互作用。
重組BAS-1或BAS-1抗體可被純化并然后用于病人。這些試劑為治療應(yīng)用可和其它活性組分結(jié)合，例如與適合的可藥用的載體或稀釋劑，例如，免疫佐劑，和生理無害的穩(wěn)定劑和賦形劑結(jié)合。這些結(jié)合物可過濾除菌并分為劑量形式通過凍干于劑量小瓶或以穩(wěn)定的水制劑儲存。本發(fā)明還涉及不完全結(jié)合的抗體或結(jié)合片段的應(yīng)用。
用BAS-1或其片段進(jìn)行藥物篩選可進(jìn)行以發(fā)現(xiàn)具有對BAS-1結(jié)合親和性的化合物，包括相關(guān)化合物的分離。接著可用生物學(xué)檢測以測定該化合物是否具有內(nèi)在的刺激活性及是否在阻斷配體活性時是阻斷劑或拮抗劑。類似的，具有內(nèi)在刺激活性的化合物可以活化抗原并在刺激BAS-1活性時是激動劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及BAS-1抗體作為拮抗劑的治療應(yīng)用。此方面對其它BAS-1物種變種特別有用。
有效治療所需的試劑的定量依賴于許多不同的因素，包括給藥方法，靶點(diǎn)，病人的生理狀態(tài)，和其它醫(yī)療措施。由此，治療劑量應(yīng)滴定至最安全有效。典型的，體外應(yīng)用劑量可提供這些試劑體內(nèi)給藥量的有用的指導(dǎo)。對動物特定疾病治療有效量試驗(yàn)將提供對人類劑量的進(jìn)一步指導(dǎo)。描述了不同的考慮，例如，Gilman，等(編)(1990)Goodman和gilman’s治療藥物學(xué)基礎(chǔ)。第八版，Pergamon Press；和Remington’s藥學(xué)科學(xué)，第17版(1990),Mark Publishing Co.,Easton,Penn.此處和下文討論了給藥方法，例如，口服，靜脈給藥，腹膜內(nèi)給藥，肌肉內(nèi)給藥，經(jīng)皮擴(kuò)散，和其它。藥用可接受載體包括水，鹽水，緩沖液，和其它所述化合物，例如，Merck目錄中，Merck&Co.,Rahway,New Jersey。劑量范圍一般預(yù)期低于1mM濃度的量，典型低于約10μM濃度，通常低于約100nM濃度，優(yōu)選低于約10pM(皮摩爾picomolar)，最優(yōu)選低于約1fM(femtomolar)，和合適的載體一起。緩釋劑，或緩釋裝置常常應(yīng)用以持續(xù)給藥。
人類BAS-1，及其片段，和其或其片段的抗體，拮抗劑，和激動劑，可直接對受試宿主給藥，或依據(jù)化合物的大小，可預(yù)期在給藥前將其連與載體蛋白如卵清蛋白或血清白蛋白。治療制劑可以多種合適的劑量制劑給藥。一旦活性成分可以單獨(dú)給藥，優(yōu)選將其作為藥用制劑存在。制劑典型包括至少一種活性成分，如上定義，和一種或多種其可接受載體。每一載體考慮到和其它成分相容并不對病人有害，都是藥用和生理可接受的。制劑包括適合表面，口服，直腸，鼻腔，或非腸道(包括皮下，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，和皮內(nèi))給藥的那些制劑。制劑常規(guī)下以單位劑量形式存在并以藥學(xué)領(lǐng)域熟知的方法制備。參見，例如，Gilman，等(編)(1990)Goodman和gilman’s治療藥物學(xué)基礎(chǔ)，第八版，Pergamon Press；和Remington’s藥學(xué)科學(xué)，第17版(1990),Mark Publishing Co.,Easton,Penn.本發(fā)明的治療可與其它化療或化學(xué)保護(hù)試劑結(jié)合或與其它化療或化學(xué)保護(hù)試劑相關(guān)進(jìn)行應(yīng)用。
本發(fā)明的天然存在和重組形式的BAS-1可以特別用于能篩選對該蛋白有結(jié)合活性的化合物的試劑盒和試驗(yàn)方法。最近已發(fā)展了幾種自動試驗(yàn)方法可允許短期內(nèi)篩選數(shù)萬種化合物。參見，例如，F(xiàn)ordor，等(1991)科學(xué)251:767-773，描述了通過固相支持物上多步特定多聚物合成測試結(jié)合親和性的方法。合適的試驗(yàn)發(fā)展可通過得到本發(fā)明提供的大量的純化的，可溶性BAS-1而大大地有利進(jìn)行。
例如，一旦BAS-1的結(jié)構(gòu)確定，可以正常找到其拮抗劑。用純化的BAS-1的高度自動試驗(yàn)方法的發(fā)展使測試潛在的配體拮抗劑成為可能。特別的，用此處實(shí)現(xiàn)的篩選技術(shù)可發(fā)現(xiàn)新的激動劑和拮抗劑。找到具有和多個BAS-1蛋白結(jié)合親和力的化合物，例如，可作為BAS-1等位變種的拮抗劑的化合物，具有特別的重要性。
進(jìn)一步，由于通過BAS-1:BAS-1結(jié)合配偶體的信號可以和其它信號結(jié)合起作用，例如CD28/CTLA-4:B7/B70和/或CD40:CD40配體通路，結(jié)合組合物和此通路的結(jié)合治療也被考慮。由此，多個信號途徑的拮抗理機(jī)，或多個通路的刺激可能是有用的。
本發(fā)明通過在任一藥物篩選技術(shù)中利用重組抗原特別用于篩選化合物。用重組蛋白篩選特異配體的優(yōu)點(diǎn)包括；(a)改進(jìn)的特定來源的BAS-1的可更新源；(b)試驗(yàn)中每個細(xì)胞潛在含有的更多抗原分子數(shù)提供更好的信噪比；且(c)物種變種特異性(理論上給出更高的生物和疾病特異性)。
藥物篩選的一種方法利用用表達(dá)BAS-1的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞。將以分離形式表達(dá)BAS-1的細(xì)胞和其它細(xì)胞分離。此細(xì)胞，以生存的或固定形式存在，可用于標(biāo)準(zhǔn)抗原/配體結(jié)合試驗(yàn)。參見，Parce，等(1989)科學(xué)246:243-247；和Owicki，等(1990)美國國家科學(xué)院院刊87:4007-4011，描述了檢測細(xì)胞反應(yīng)的敏感方法。競爭性試驗(yàn)特別有用，其中細(xì)胞(BAS-1源)和具有已知的抗原結(jié)合親和力的標(biāo)記配體，如125I配體，及待測與BAS-1結(jié)合親和力的受試化合物接觸并共孵育。接著分離結(jié)合配體和游離配體以測定配體結(jié)合程度。受試化合物結(jié)合的量和測得的標(biāo)記配體結(jié)合的量成反比。數(shù)種技術(shù)中的任一種可用于從游離配體中分離結(jié)合配體以測定配體結(jié)合程度。此分離步驟通?？缮婕俺绦蛉缯掣接跒V紙然后洗滌，粘附于塑料然后洗滌，或細(xì)胞膜離心。生存的細(xì)胞也可用于篩選藥物對BAS-1介導(dǎo)的功能的影響，例如，第二信使水平，即，Ca++；細(xì)胞增生；肌醇磷酸池變化；和其它。一些測定方法可以省略分離步驟，例如，接近敏感檢測系統(tǒng)。鈣敏感染色可用于檢測Ca++水平，用熒光計(jì)或熒光細(xì)胞排列裝置。
另一方法應(yīng)用轉(zhuǎn)化真核或原核宿主細(xì)胞的膜作為人類BAS-1的來源，這些細(xì)胞用指導(dǎo)人類BAS-1抗原表達(dá)的DNA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化?；镜?，從細(xì)胞制備膜并用于任何受體/配體結(jié)合試驗(yàn)如前述競爭試驗(yàn)中。
還有一種方法是使用來自轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞的可溶的，未純化的或可溶的，純化的BAS-1。這允許“分子”結(jié)合試驗(yàn)，具有提高特異性的優(yōu)點(diǎn)，自動的能力，和高的藥物試驗(yàn)產(chǎn)率。
另一藥物篩選技術(shù)涉及在篩選具有和人類BAS-1合適結(jié)合親和力的化合物時提供高產(chǎn)率的方法，并在Geysen，歐洲專利申請84/03564,1984,9,13發(fā)布中詳細(xì)描述。首先，大量的不同的小肽試驗(yàn)化合物在固相支持物上合成，例如，塑料針或其它合適的表面，參見Fodor，等(1991)。接著所有的針和未純化的增溶的或純化的增溶的BAS-1反應(yīng)，并洗滌。下一步涉及檢測結(jié)合的BAS-1。
合理的藥物設(shè)計(jì)也可基于BAS-1和其它效應(yīng)劑或配體的分子形狀的結(jié)構(gòu)研究。效應(yīng)劑可以是介導(dǎo)反應(yīng)于配體結(jié)合的其它功能的其它蛋白，或通常和抗原作用的其它蛋白。測定特異和其它蛋白作用的位點(diǎn)的一種方法是物理結(jié)構(gòu)測定，例如，X射線晶體衍射圖或二維NMR技術(shù)。這些將提供哪個氨基酸殘基形成分子接觸區(qū)的提示。蛋白結(jié)構(gòu)測定的詳細(xì)描述，參見，例如，Blundell和Johnson(1976)蛋白晶體圖，Academic Press，紐約。
純化的BAS-1可直接包被于板上用于前述藥物篩選技術(shù)。然而，這些抗原的非中和抗體可用作捕獲抗體來使各個BAS-1固定在固相上。
Ⅸ．試劑盒本發(fā)明還涉及BAS-1蛋白，其片段，肽，和其融合產(chǎn)物在各種檢測BAS-1或配體的存在的診斷試劑盒和方法中的應(yīng)用。典型的，試劑盒包括含有限定的BAS-1肽或基因片段或識別其中之一或另一的試劑的部分。
測定受試化合物和BAS-1的結(jié)合親和力的試劑盒通常含有試驗(yàn)化合物；標(biāo)記化合物，例如已知具有對BAS-1結(jié)合親和力的配體或抗體；BAS-1源(天然存在或重組)；和從游離標(biāo)記化合物中分離結(jié)合形式的方法，如固定BAS-1的固相。一旦篩選了化合物，具有對BAS-1合適結(jié)合親和力的化合物可在適合的生物學(xué)試驗(yàn)中評價(jià)，如本領(lǐng)域所熟知，以測定其是否可作為激動劑或拮抗劑起作用。利用重組BAS-1多肽也提供校正此試驗(yàn)的良好限定標(biāo)準(zhǔn)。
測定濃度，例如，樣品中BAS-1，的優(yōu)選試劑盒通常包括標(biāo)記化合物，例如配體或抗體，其具有已知的BAS-1結(jié)合活性，BAS-1源(天然存在或重組)；和從游離標(biāo)記化合物中分離結(jié)合形式的方法，如，固定BAS-1的目相。一般提供含有試劑，和說明的組分。
測定樣品中BAS-1濃度的方法通常包括步驟(1)從含有BAS-1源的樣品中制備膜；(2)洗膜并重懸于緩沖液；(3)通過與加入適當(dāng)去垢劑的培養(yǎng)基共同孵育膜而增溶BAS-1；(4)調(diào)整增溶的BAS-1中的去垢劑濃度；(5)將所述稀釋液接觸并和放射性標(biāo)記的配體共孵育以形成復(fù)合物；(6)通過濾過聚乙烯亞胺處理的過濾膜回收復(fù)合物；并(7)測量恢復(fù)的復(fù)合物的放射活性。
特異針對人類BAS-1或BAS-1片段的抗體，包括抗原結(jié)合片段，可應(yīng)用于診斷，例如，檢測升高的BAS-1和/或其片段水平的存在。此診斷試驗(yàn)可用裂解液，活細(xì)胞，固定細(xì)胞，免疫熒光，細(xì)胞培養(yǎng)，體液，和進(jìn)一步可涉及血清中BAS-1相關(guān)抗原的檢測，或此類。診斷試驗(yàn)可以是同源(沒有游離試劑和抗原-配體復(fù)合物的分離步驟)或異源(有分離步驟)。存在多種商業(yè)試驗(yàn)，如放射免疫測試(RIA)，酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)，酶免疫試驗(yàn)(EIA)，酶多聚免疫試驗(yàn)技術(shù)(EMIT)，底物標(biāo)記的熒光免疫試驗(yàn)(SLFIA)，和此類。例如，未標(biāo)記的抗體可通過用標(biāo)記的識別BAS-1或其特定片段抗體的第二抗體來應(yīng)用。這些試驗(yàn)已在文獻(xiàn)中詳細(xì)討論。參見，例如，Harlow和Lane(1988)抗體實(shí)驗(yàn)室手冊，CSH。
抗獨(dú)特型抗體可類似的用于診斷抗人類BAS-1抗體的存在，這在多種異常狀態(tài)下是可診斷的。例如，過量產(chǎn)生的BAS-1可導(dǎo)致產(chǎn)生各種各樣的可診斷異常生理狀態(tài)，特別是如癌或異常分化等增生細(xì)胞條件時的免疫反應(yīng)。
經(jīng)常，診斷試驗(yàn)試劑以試劑盒提供，以優(yōu)化試驗(yàn)的敏感性。對本發(fā)明，根據(jù)試驗(yàn)的原理，方法，和標(biāo)記，提供標(biāo)記抗體或未標(biāo)記抗體，或標(biāo)記BAS-1。通常還有與其它附加物，如緩沖液，穩(wěn)定劑，產(chǎn)生信號所需的材料如酶底物，和此類結(jié)合。優(yōu)選的，試劑盒還含有正確使用和使用后處理的說明。典型的，試劑盒分隔每一有用試劑?？梢灶A(yù)期，試劑以凍干粉末提供，其中試劑可以重溶于含水基質(zhì)提供合適的試劑濃度以進(jìn)行試驗(yàn)。
任何前述的藥物篩選和診斷試驗(yàn)的部分可不修飾使用或以多種方法修飾。例如，通過共價(jià)或非共價(jià)連接直接或間接提供可檢測信號的部分進(jìn)行標(biāo)記。在任一這些試驗(yàn)中，配體，試驗(yàn)化合物，BAS-1，或抗體可直接或間接標(biāo)記。可能的直接標(biāo)記包括標(biāo)記基團(tuán)放射性標(biāo)記如125I，酶(美國專利3,645,090)，如過氧化物酶和堿性磷酸酶，和熒光標(biāo)記(美國專利3.940,465)，可監(jiān)測熒光強(qiáng)度，波長遷移，或熒光極化的改變。兩項(xiàng)專利此處都引為參考。間接標(biāo)記的可能包括生物素化的一個組分然后結(jié)合偶聯(lián)有以上標(biāo)記基團(tuán)的親和素。
還有多種方法從游離配體中分離結(jié)合形式，或另外從游離試驗(yàn)化合物中分離結(jié)合形式。BAS-1可固定于各種各樣的基質(zhì)，然后洗滌。合適的基質(zhì)包括塑料如ELISA板，濾紙，和珠。固定BAS-1于基質(zhì)的方法包括，不限定于，直接粘附于塑料，用捕獲抗體，化學(xué)偶聯(lián)，和生物素-親和素。本方法的最后一步涉及用幾種方法中的一種沉淀抗原/配體復(fù)合物，包括這些用，例如有機(jī)溶劑如聚乙二醇或鹽如硫酸銨。其它合適的分離技術(shù)包括，不限定于，熒光抗體磁化顆粒法，Rattle等描述，(1984)臨床化學(xué)30:1457-1461，和雙抗體磁化顆粒分離，美國專利4,659,678描述。
連接蛋白或其片段與各種標(biāo)記的方法已在文獻(xiàn)中詳細(xì)報(bào)道。許多技術(shù)涉及應(yīng)用活化的羧基基團(tuán)，或利用碳二亞胺或利用活化酯，來形成肽鍵，通過巰基與活化的鹵素如氯乙酰，或活化的烯烴如馬來酰亞胺反應(yīng)，作為連接，來形成硫醚，或類似。融合蛋白在這些應(yīng)用中亦有用。
本發(fā)明的另一診斷方面涉及來自BAS-1序列的聚核苷酸或寡核苷酸序列的應(yīng)用。這些序列可用作探針檢測懷疑有異常情況的病人的標(biāo)本中抗原的水平，例如，癌或發(fā)育問題。RNA和DNA核苷酸序列的制備，序列的標(biāo)記，和優(yōu)選序列大小都已在文獻(xiàn)中描述和討論。普通的一個寡核苷酸探針應(yīng)該至少有大約14個核苷酸，通常至少約18個核苷酸，且聚核苷酸探針可長達(dá)幾千堿基對?？墒褂貌煌臉?biāo)記，最一般為放射性核苷酸，特別是32P。然而，其它技術(shù)也可應(yīng)用，如用生物素修飾的核苷酸引入聚核苷酸中。生物素可作為結(jié)合親和素或抗體的位點(diǎn)，可用各種各樣的多種標(biāo)簽來標(biāo)記，如放射性核苷酸，熒光素，酶，或此類?；蛘?，可使用識別特異的雙鏈體，包括DNA雙鏈體，RNA雙鏈體，DNA-RNA雜交雙鏈體，或DNA-蛋白雙鏈體的抗體。接著抗體可被標(biāo)記，試驗(yàn)可以進(jìn)行，其中雙鏈體結(jié)合于表面，這樣通過表面上雙鏈體的形成，結(jié)合于雙鏈體的抗體的存在可被檢測到。新的反義RNA的探針可用于任何常規(guī)技術(shù)如核酸雜交，加數(shù)和減數(shù)篩選，重組檢測，雜交釋放翻譯(HRT)，和雜交局限翻譯(HART)。這還包括擴(kuò)增技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
也涉及定性或定量檢測其它標(biāo)記存在的診斷試劑盒。診斷或預(yù)測依賴于用作標(biāo)記的多指示劑的結(jié)合。這樣，試劑盒可檢測標(biāo)記的結(jié)合。參見，例如，Viallet，等(1989)生長因子研究進(jìn)展1:89-97。
Ⅹ．配體或反受體。
此處BAS-1蛋白的描述提供了分辨配體或反受體的方法。這樣的配體或反受體可以相當(dāng)高的親和力結(jié)合于BAS-1。制備不同的構(gòu)建物允許標(biāo)記BAS-1檢測其配偶體。例如，直接標(biāo)記BAS-1，融合標(biāo)記物來二次標(biāo)記，例如，F(xiàn)LAG或其它附加表位，Ig區(qū)融合，等，可以檢測結(jié)合配偶體。這可以是組織學(xué)的，作為生化純化的親和方法，或在表達(dá)克隆過程中標(biāo)記或篩選。雙雜交選擇系統(tǒng)也可用于可得到的BAS-1序列制備合適的構(gòu)建物。參見，例如，F(xiàn)ields和Song(1989)自然340:245-246。
本發(fā)明的寬廣范圍參考以下實(shí)施例可被最好理解，并不試圖將本發(fā)明限定于具體實(shí)施方案。
實(shí)施例Ⅰ．一般方法描述或參考了一些標(biāo)準(zhǔn)方法，例如，Maniatis，等(1982)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港出版社；Sambrook，等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，(第二版)，第1-3卷，CSH出版，紐約；Ausubel，等生物學(xué)，Greene Publishing Associates,Brooklyn,NY；或Ausubel，等(1987和增刊)分子生物學(xué)方法綜覽，Greene/Wiley，紐約。蛋白純化的方法包括如硫酸銨沉淀，色譜柱，電泳，離心，結(jié)晶，和其它。參見，例如，Ausubel，等(1987和定期增刊)；Deutscher(1990)“蛋白純化指南”酶學(xué)方法，182卷，和此系列中的其它卷；和生產(chǎn)商關(guān)于蛋白純化產(chǎn)品使用說明，例如，Pharmacia，Piscataway,N.J.,或Bio-Rad,Richmond,CA.結(jié)合重組技術(shù)可融合于適當(dāng)?shù)钠?，例如，F(xiàn)LAG序列或通過蛋白酶可去除序列融合的相應(yīng)物。參見，例如，Hochuli(1989)化學(xué)工業(yè)12:69-70；Hochuli(1990)“通過金屬螯合吸收純化重組蛋白”Setlow(編)基因工程原理和方法12:87-98.PlenumPress，紐約；和Crowe，等(1992)QIAexpress高水平表達(dá)和蛋白純化系統(tǒng)QUIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA.
進(jìn)行計(jì)算機(jī)序列分析，例如，用適用的軟件程序，包括來自GCG(U.Wisconsin)和GenBank來源的。也利用來自GenBank和其它的公共序列數(shù)據(jù)庫。
Ⅱ．用PCR擴(kuò)增人類BAS-1片段根據(jù)小鼠RP105序列設(shè)計(jì)兩個引物。參見Miyake，等(1995)免疫學(xué)雜志154:3333-3340。指定核酸從其中CTT序列數(shù)起。5’引物A(TTG…)相應(yīng)于162至185位的24個核苷酸且3’引物F(…TTC)相應(yīng)于1462-1485位的24個核苷酸。從人類扁桃體B細(xì)胞未得到PCR產(chǎn)物。
制備3個5’引物引物B(ACA…)含321-344位核苷酸，引物C(AAG…)含568-591位核苷酸，引物D(TCT…)含859-882位核苷酸，制備另外3個3’引物引物G(…TTA)含1765-1788位核苷酸，引物H(…GAA)含2024-2027位核苷酸，引物E(…TGG)含1164-1187位核苷酸。
為增加從人類扁桃體B細(xì)胞獲得PCR產(chǎn)物的機(jī)會，通過用一個5’引物和四個3’引物結(jié)合來進(jìn)行PCR反應(yīng)。這四組PCR反應(yīng)中，只獲得一300bp的清晰產(chǎn)物，跨過5’引物D和3’引物E。純化此產(chǎn)物，亞克隆入pCRTM載體(Invitrogen,San Diego CA)，接著測序。參見SEQ ID NO1。
根據(jù)300bp的人類序列，設(shè)計(jì)3個引物5’引物K；3’引物I和L.利用類似的PCR方法，另外300bp人類片段通過結(jié)合引物C和I得到(參見SEQ ID NO1)Ⅲ．人類BAS-1的組織分布利用引物對D-E擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(參見SEQ ID NO1)用作探針(D-E探針)研究BAS-1在人類組織中的組織分布。通過Northern印跡從人脾中檢測到一個2.6kb mRNA并在心臟中以低水平存在。未在人腦，胸腺，肺，肝，骨骼肌，腎，前列腺，睪丸，卵巢，小腸，結(jié)腸，和外周血淋巴細(xì)胞容易檢測到它。另外，此2.6kb信使RNA通過Northern印跡可在sIgD+淋巴瘤細(xì)胞系B104中檢測到并在Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞系BL2中有低水平，而不存在于腎上皮癌細(xì)胞系CHA，肺上皮癌細(xì)胞系MRC-5,EBV細(xì)胞系JY，或單核細(xì)胞細(xì)胞系U937。
通過PGR，人類BAS-1信使RNA被發(fā)現(xiàn)存在于sIgD+CD38-天然B細(xì)胞，sIgD+CD38+生發(fā)中心B細(xì)胞，sIgD-CD38+生發(fā)中心B細(xì)胞，sIgD-CD38-記憶B細(xì)胞，sCD38++CD20low漿細(xì)胞，用GM-CSF加IL-4培養(yǎng)的CD14+單核細(xì)胞產(chǎn)生的樹狀細(xì)胞，用GM-CSF加TNF-α培養(yǎng)的CD34+索血細(xì)胞產(chǎn)生的樹狀細(xì)胞。通過PCR在人類T細(xì)胞系MT9未檢測到此信使。
Ⅳ．篩選來自人類sIgD+淋巴瘤細(xì)胞系B104的質(zhì)粒cDNA文庫從Northern印跡分析結(jié)果，在6μg B104細(xì)胞系的poly-A mRNA中檢測到BAS-1的表達(dá)。由此，在質(zhì)粒pSPORT1質(zhì)粒中構(gòu)建B104 cDNA文庫(Gibco Life Technologies,Cergy Pontoise，法國)。篩選150.000細(xì)菌菌落后，用D-E探針沒有獲得陽性克隆。這可能反映BAS-1在人類細(xì)胞中的表達(dá)很低。
Ⅴ．篩選人類脾臟的λgt10細(xì)菌噬菌體文庫為篩選更多克隆，使用人類脾臟的λgt10細(xì)菌噬菌體文庫(Clontech)。篩選2.4×106克隆后，獲得8個陽性克隆。將這些克隆分離，純化，亞克隆入pME18S質(zhì)粒(DNAX,Palo Alto,CA)。測序后，發(fā)現(xiàn)兩個克隆S2和L1代表全長人類BAS-1(參見SEQ ID NO1)。分離的人類全長BAS-1 cDNA含有約2635bp，編碼約661氨基酸的蛋白。此蛋白產(chǎn)物含有約11個潛在的糖基化位點(diǎn)和約22個亮氨酸豐富重復(fù)結(jié)構(gòu)域。人類BAS-1cDNA的編碼區(qū)和小鼠RP105序列的編碼區(qū)有約72％的同源性，且此完整BAS-1cDNA和完整小鼠cDNA序列有大約67％同源性。人類BAS-1和小鼠RP105之間的氨基酸同源性約為73.5％。
Ⅵ．人類BAS-1蛋白的表達(dá)通過去除5’和3’非編碼區(qū)并加入Marylin Kozak(參見生物化學(xué)雜志266:19867,1991)共有序列(ACCATGG；SEQ ID NO3)以增強(qiáng)翻譯水平來制備所有構(gòu)建物。
可溶性BAS-1-FLAG蛋白已在Cos 7細(xì)胞中瞬時表達(dá)，如下。在羧基端顯示FLAG肽(Hoppe，等(1988)生物技術(shù)6:1205-1210)的BAS-1重組形式引入表達(dá)載體pME18S并接著電穿孔轉(zhuǎn)染到Cos-7細(xì)胞中。電穿孔的細(xì)胞在單獨(dú)DMEM或加入1％Nudridoma HU(Boehringer Mannheim,Mennheim，德國)的DMEM培養(yǎng)基中生長5天。
Ⅶ．可溶性BAS-1 Flag蛋白的純化典型的，280ml含有可溶性BAS-1FLAG的上清通過連于ChelatingSepharose Fast F1ow基質(zhì)的(Pharmacia,Upsalla,Sweden)20ml Cu++離子柱。用16體積結(jié)合緩沖液(His-Bind Bufferkit,Novagen,Madison,WI)洗滌后，金屬離子滯留的蛋白用20-100mMImidazole梯度洗脫。洗脫組分中的人類BAS-1FLAG內(nèi)含物通過用抗-FLAG單抗M2(Eastman Kodak,New Haven,CT)點(diǎn)印跡和考馬斯藍(lán)和銀染色還原SDS-PAGE測定。含BAS-1FLAG蛋白的部分接著合并并對PBS透析。通過Western印跡，富集的人類BAS-1相應(yīng)于約95-97kd蛋白，和氨基酸序列所預(yù)測的一樣。
Ⅷ．在NIH-3T3細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)膜BAS-1天然膜形式被亞克隆入表達(dá)載體pMAMneo(Clontech,Palo Alto,California)，此載體含有連于地塞米松-可誘導(dǎo)MMTV-LTR啟動子的RSV-LTR增強(qiáng)子。此構(gòu)建物接著電穿孔轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞接種于加入10％胎牛血清的選擇性0.5mg/ml Geneticin(G418)(Boehringer-Mannheim,Mannheim，德國)DMEM。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞中膜BAS-1蛋白的生化特性有代謝標(biāo)記。接著細(xì)胞在含10％胎牛血清和1μM終濃度地塞米松(Sigma,SaintQuentin Fallavier，法國)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。接著細(xì)胞在后12小時與35S-Met和35S-Cys孵育以標(biāo)記細(xì)胞蛋白。分析還原條件下的SDS-PAGE的蛋白顯示轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞裂解液中有預(yù)測的110kDa蛋白，而未轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞裂解液中沒有。
Ⅸ．制備BAS-1特異的抗體近交Balb/c小鼠用人類蛋白的重組形式腹膜內(nèi)免疫。首先接受純化的可溶性BAS-1FLAG且第二次接受穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞。動物在適當(dāng)?shù)臅r候用蛋白加強(qiáng)，有或沒有附加佐劑以進(jìn)一步刺激抗體產(chǎn)生。收集血清，或用得到的脾制備雜交瘤。
或者，Balb/c小鼠用基因或其片段轉(zhuǎn)化的細(xì)胞免疫，內(nèi)源或外源細(xì)胞，或用分離的富集的表達(dá)抗原的膜。適當(dāng)時候收集血清，典型經(jīng)過多次進(jìn)一步免疫后。多種基因治療技術(shù)是有用的，例如，原位產(chǎn)生蛋白以產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
可制備單克隆抗體。例如，脾細(xì)胞和合適的融合配偶體融合且以標(biāo)準(zhǔn)程序在培養(yǎng)基中篩選雜交瘤。篩選雜交瘤上清中結(jié)合人類BAS-1的抗體的存在，例如，通過ELISA或其它試驗(yàn)。也可選擇或制備特異識別人類BAS-1而不識別物種變異的抗體。
另一方法中，合成多肽或純化蛋白提供給一免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體。參見，例如，Coligan(1991)免疫學(xué)方法Wiley/Greene；和harlow和Lane(1989)抗體實(shí)驗(yàn)室手冊冷泉港出版。在合適情況下，結(jié)合試劑如上述標(biāo)記，例如，熒光或其它，或固定于底物用于Panning法。核酸也可引入動物中的細(xì)胞以產(chǎn)生抗原，它用于引起免疫反應(yīng)。參見，例如，Wang，等(1993)Proc.Nat’l.Acad.Sci.90:4156-4160；Barry，等(1994)生物技術(shù)16:616-619；和Xiang，等(1995)免疫學(xué)2:129-135。
Ⅹ．在NSO細(xì)胞中大量生產(chǎn)BAS-1大量可溶性BAS-1和可溶性BAS-1FLAG可從制備好的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的NSO細(xì)胞產(chǎn)生，例如，根據(jù)Celltech(Slough,Berkshire，英國；國際專利申請WO86/05807,WO87/04462,WO89/01036和WO89/10404)發(fā)展的方法。BAS-1和BAS-1FLAG被亞克隆入pEE12并接著通過電穿孔轉(zhuǎn)染NSO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染NSO細(xì)胞接種于含10％胎牛血清的選擇性無谷氨酰胺DMEM，如Celltech的方法所述。最好的生產(chǎn)細(xì)胞系的上清用于生物試驗(yàn)并純化可溶性BAS-1和可溶性BAS-1-FLAG。
其它表達(dá)系統(tǒng)可用于產(chǎn)生大量重組蛋白。
Ⅺ．用BAS-1產(chǎn)生融合蛋白用BAS-1細(xì)胞外區(qū)制備不同融合構(gòu)建物。該基因的此部分融合于另一蛋白，例如，F(xiàn)LAG附加表位，Ig區(qū)，或融合于雙雜交系統(tǒng)構(gòu)建物。參見，例如，F(xiàn)ield和Song(1989)自然340:245-246。
附加表位可用于表達(dá)克隆程序用抗FLAG抗體檢測以檢測結(jié)合配偶體，例如，BAS-1的配體?；蛘撸琁g區(qū)可用于用抗原類似親和性純化配體。雙雜交系統(tǒng)也可用于分離特異結(jié)合BAS-1的蛋白。
Ⅻ．通過原位雜交對人BAS-1制圖。
制備伸展染色體。在培養(yǎng)72小時的植物血凝素刺激的人類淋巴細(xì)胞來源的染色體制劑上進(jìn)行原位雜交。培養(yǎng)的最后7小時加入5-溴脫氧尿苷(60μg/ml培養(yǎng)基)，以確保雜交后染色體帶的高質(zhì)量。
用引物，例如，相應(yīng)于核苷酸395-411和1027-1050，以總B細(xì)胞cDNA為模板，幫助擴(kuò)增的一655堿基對PCR片段，克隆入合適載體。載體用3H通過缺口平移標(biāo)記。放射性標(biāo)記的探針和中期伸展的染色體以終濃度200ng/ml雜交液雜交，如Mattei，等(1985)人類遺傳69:327-221描述。
用核示蹤乳膠(KODAK NTB2)覆蓋后，膠片在4℃曝光18天。為避免銀粒在顯帶過程中滑動，染色體伸展首先用緩沖Giemsa溶液染色并中期照相。R顯帶然后用熒光相裂解-Giemsa(FPG)法進(jìn)行并在分析前中期再照相。
原位雜交后檢測的100個中期細(xì)胞中，20％銀染顆粒定位于5號染色體。顆粒分布不是隨機(jī)的，67％位于5號染色體長臂q11.2-q13.1區(qū)。由此定位人類BAS-1于人類基因組5q11.2-q13.1區(qū)。
ⅩⅢ．人類BAS-1受體的分離人類BAS-1可用作特異結(jié)合試劑來分辨其結(jié)合配偶體，通過利用其結(jié)合特異性，更象使用抗體。結(jié)合試劑如上描述標(biāo)記，例如，熒光或其它，或固定于底物用于panning法。
用結(jié)合組合物篩選表達(dá)結(jié)合配偶體，即受體的細(xì)胞系制備的表達(dá)文庫。標(biāo)準(zhǔn)染色技術(shù)用來接觸或分辨細(xì)胞內(nèi)或表面表達(dá)受體，或用panning篩選表面表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。篩選細(xì)胞內(nèi)表達(dá)用染色或免疫熒光方法進(jìn)行。也參見Mcmahan，等(1991)EMBO J.10:2821-2832.
例如，第0天，每室1ml用纖維結(jié)合素，10ng/ml于PBS中，室溫30分鐘，預(yù)先包被2室permanox板。用PBS漂洗一次。然后每室加2-3×105COS細(xì)胞，于1.5ml生長培養(yǎng)基中平板培養(yǎng)。37℃孵育過夜。
第一天對于每一樣品，準(zhǔn)備0.5ml66μg/ml DEAE-葡聚糖溶液，66μM氯喹，和血清中4μg無DME DNA。為每一套準(zhǔn)備一個陽性對照，例如，人類BAS-1-FLAG cDNA的1和1/200稀釋液，和陰性模型。無DME血清漂洗細(xì)胞。加入DNA溶液在37℃孵育5小時。移去培養(yǎng)基并加0.5ml DME中的10％DMSO孵育2.5分鐘。移去并用DME漂洗一遍。加1.5ml生長培養(yǎng)基并孵育過夜。
第二天，更換培養(yǎng)基。第三或四天，細(xì)胞固定并染色。用Hank’sBuffered Saline Solution(HBSS)漂洗細(xì)胞兩遍并用4％多聚甲醛(PFA)/葡萄糖固定5分鐘。用HBSS洗三遍。移去所有液體后載玻片保存于-80℃。對于每一室，0.5ml孵育物進(jìn)行如下操作。加HBSS/皂甙(0.1％)和32μl/ml 1M NaN3放20分鐘。然后細(xì)胞用HBSS/皂甙洗一遍。向細(xì)胞加人類BAS-1或BAS-1/抗體復(fù)合物放30分鐘。用HBSS/皂甙洗兩遍。若合適，加一抗放30分鐘。加二抗，例如，Vector抗小鼠抗體，1/200稀釋液，孵育30分鐘。準(zhǔn)備ELISA溶液，例如，VectorElite ABC辣根過氧化物酶溶液，并預(yù)熱30分鐘。對于每2.5ml HBSS/皂甙使用例如一滴溶液A(親和素)和一滴溶液B(生物素)。用HBSS/皂甙洗兩遍細(xì)胞。加ABCHRP溶液并孵育30分鐘。用HBSS洗細(xì)胞兩遍，第二遍兩分鐘，封閉細(xì)胞。然后加二氨基苯甲酸(DAB)放5到10分鐘。每5ml玻璃雙蒸水用2滴緩沖液加4滴DAB加2滴H2O2，小心移去室并在水中洗板。晾干幾分鐘，然后加一滴Crystal Mount并加蓋玻片。85-90℃孵育5分鐘。
評價(jià)池中的陽性染色并進(jìn)一步亞克隆到分離的引起結(jié)合的單基因。
或者，BAS-1試劑可用于親和純化或列出表達(dá)受體的細(xì)胞。參見，例如，sambrook，等或Ausubel等。
篩選膜結(jié)合受體的另一策略為淘洗法。受體cDNA如上述構(gòu)建。配體可被固定并用于固定表達(dá)細(xì)胞。通過使用合適的抗體，例如識另 BAS-1融合構(gòu)建物的FLAG序列，或通過應(yīng)用針對一抗的抗體可以獲得固定。選擇和放大的循環(huán)導(dǎo)致合適克隆的富集和受體表達(dá)克隆的最后分離。
可用人類BAS-1篩選噬菌體表達(dá)文庫。合適的標(biāo)記技術(shù)，例如，抗FLAG抗體，將允許對合適克隆的特異性標(biāo)記。
每一單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾埦唧w而獨(dú)立地被指明作為參考，此處所有引用由同樣范圍在此引作參考。
本發(fā)明的許多修飾和變化可以不背離其精神和范圍實(shí)現(xiàn)，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。此處描述的具體實(shí)施方案只是以實(shí)施例的方式提出，而本發(fā)明由附加的權(quán)利要求的范圍所限定，同時給與伴隨這些權(quán)利要求的相同物的整個范圍以權(quán)利。
序列列表(1)一般信息(ⅰ)申請人Schering Corporation(ⅱ)發(fā)明題目人類B細(xì)胞抗原；相關(guān)試劑(ⅲ)序列數(shù)目3(ⅳ)聯(lián)系地址(A)收件人Schering-plough Corporation(B)街道2000 Galloping Hill Road(C)城市Kenilworth(D)州New Jersey(E)國家USA(F)郵政編碼07033(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀類型(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)Macintosh(C)操作系統(tǒng)7、5、3(ⅵ)目前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日期(ⅶ)優(yōu)先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朞S 08/649553(B)申請日17-MAY-1996
(ⅷ)代理人/委托人信息(A)姓名Cynthia L.Koulke,Esq.
(B)登記號32364(C)文獻(xiàn)/摘要號DX0580PCT(ⅸ)通訊信息(A)電話908-298-2987(B)傳真908-298-5388(2)SEQ ID NO:1 信息(ⅰ)序列特征(A)長度2635堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)定位97..2082(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:1:ATTCCGGCGG CTGCCAAATT GCCAGGGCCT TCACAGTTTG ATTCCATTTC TCAGCTCCAA60GCATTAGGTA AACCCACCAA GCAATCCTAG CCTGTGATG GCG TTT GAC GTC AGC114Met Ala Phe Asp Val Ser1 5TGC TTC TTT TGG GTG GTG CTG TTT TCT GCC GGC TGT AAA GTC ATC ACC162Cys Phe Phe Trp Val Val Leu Phe Ser Ala Gly Cys Lys Val Ile Thr10 15 20TCC TGG GAT CAG ATG TGC ATT GAG AAA GAA GCC AAC AAA ACA TAT AAC210Ser Trp Asp Gln Met Cys Ile Glu Lys Glu Ala Asn Lys Thr Tyr Asn25 30 35TGT GAA AAT TTA GGT CTC AGT GAA ATC CCT GAC ACT CTA CCA AAC ACA258Cys Glu Asn Leu Gly Leu Ser Glu Ile Pro Asp Thr Leu Pro Asn Thr40 45 50ACA GAA TTT TTG GAA TTC AGC TTT AAT TTT TTG CCT ACA ATT CAC AAT306Thr Glu Phe Leu Glu Phe Ser Phe Asn Phe Leu Pro Thr Ile His Asn55 60 65 70AGA ACC TTC AGC AGA CTC ATG AAT CTT ACC TTT TTG GAT TTA ACT AGG354Arg Thr Phe Ser Arg Leu Met Asn Leu Thr Phe Leu Asp Leu Thr Arg75 80 85TGC CAG ATT AAC TGG ATA CAT GAA GAC ACT TTT CAA AGC CAT CAT CAA402Cys Gln Ile Asn Trp Ile His Glu Asp Thr Phe Gln Ser His His Gln90 95 100TTA AGC ACA CTT GTG TTA ACT GGA AAT CCC CTG ATA TTC ATG GCA GAA450Leu Ser Thr Leu Val Leu Thr Gly Asn Pro Leu Ile Phe Met Ala Glu105 110 115ACA TCG CTT AAT GGG CCC AAG TCA CTG AAG CAT CTT TTC TTA ATC CAA498Thr Ser Leu Asn Gly Pro Lys Ser Leu Lys His Leu Phe Leu Ile Gln120 125 130ACG GGA ATA TCC AAT CTC GAG TTT ATT CCA GTG CAC AAT CTG GAA AAC546Thr Gly Ile Ser Asn Leu Glu Phe Ile Pro Val His Asn Leu Glu Asn135 140 145 150TTG GAA AGC TTG TAT CTT GGA AGC AAC CAT ATT TCC TCC ATT AAG TTC594Leu Glu Ser Leu Tyr Leu Gly Ser Asn His Ile Ser Ser Ile Lys Phe155 160 165CCC AAA GAC TTC CCA GCA CGG AAT CTG AAA GTA CTG GAT TTT CAG AAT642Pro Lys Asp Phe Pro Ala ArG Asn Leu Lys Val Leu Asp Phe Gln Asn170 175 180AAT GCT ATA CAC TAC ATC TCT AGA GAA GAC ATG AGG TCT CTG GAG CAG690Asn Ala Ile His Tyr Ile Ser Arg Glu Asp Met ArG Ser Leu Glu Gln185 190 195GCC ATC AAC CTA AGC CTG AAC TTC AAT GGC AAT AAT GTT AAA GGT ATT738Ala Ile Asn Leu Ser Leu Asn Phe Asn Gly Asn Asn Val Lys Gly Ile200 205 210GAG CTT GGG GCT TTT GAT TCA ACG GTC TTC CAA AGT TTG AAC TTT GGA786Glu Leu Gly Ala Phe Asp Ser Thr Val Phe Gln Ser Leu Asn Phe Gly215 220 225 230GGA ACT CCA AAT TTG TCT GTT ATA TTC AAT GGT CTG CAG AAC TCT ACT834Gly Thr Pro Asn Leu Ser Val Ile Phe Asn Gly Leu Gln Asn Ser Thr235 240 245ACT CAG TCT CTC TGG CTG GGA ACA TTT GAG GAC ATT GAT GAC GAA GAT882Thr Gln Ser Leu Trp Leu Gly Thr Phe Glu Asp Ile Asp Asp Glu Asp250 255 260ATT AGT TCA GCC ATG CTC AAG GGA CTC TGT GAA ATG TCT GTT GAG AGC930Ile Ser Ser Ala Met Leu Lys Gly Leu Cys Glu Met Ser Val Glu Ser265 270 275CTC AAC CTG CAG GAA CAC CGC TTC TCT GAC ATC TCA TCC ACC ACA TTT978Leu Asn Leu Gln Glu His Arg Phe Ser Asp Ile Ser Ser Thr Thr Phe280 285 290CAG TGC TTC ACC CAA CTC CAA GAA TTG GAT CTG ACA GCA ACT CAC TTG1026Gln Cys Phe Thr Gln Leu Gln Glu Leu Asp Leu Thr Ala Thr His Leu295 300 305 310AAA GGG TTA CCC TCT GGG ATG AAG GGT CTG AAC TTG CTC AAG AAA TTA1074Lys Gly Leu Pro Ser Gly Met Lys Gly Leu Asn Leu Leu Lys Lys Leu315 320 325GTT CTC AGT GTA AAT CAT TTC GAT CAA TTG TGT CAA ATC AGT GCT GCC1122Val Leu Ser Val Asn His Phe Asp Gln Leu Cys Gln Ile Ser Ala Ala330 335 340AAT TTC CCC TCC CTT ACA CAC CTC TAC ATC AGA GGC AAC GTG AAG AAA1170Asn Phe Pro Ser Leu Thr His Leu Tyr Ile Arg Gly Asn Val Lys Lys345 350 355CTT CAC CTT GGT GTT GGC TGC TTG GAG AAA CTA GGA AAC CTT CAG ACA1218Leu His Leu Gly Val Gly Cys Leu Glu Lys Leu Gly Asn Leu Gln Thr360 365 370CTT GAT TTA AGC CAT AAT GAC ATA GAG GCT TCT GAC TGC TGC AGT CTG1266Leu Asp Leu Ser His Asn Asp Ile Glu Ala Ser Asp Cys Cys Ser Leu375 380 385 390CAA CTC AAA AAC CTG TCC CAC TTG CAA ACC TTA AAC CTG AGC CAC AAT1314Gln Leu Lys Asn Leu Ser His Leu Gln Thr Leu Asn Leu Ser His Asn
395 400 405GAG CCT CTT GGT CTC CAG AGT CAG GCA TTC AAA GAA TGT CCT CAG CTA1362Glu Pro Leu Gly Leu Gln Ser Gln Ala Phe Lys Glu Cys Pro Gln Leu410 415 420GAA CTC CTC GAT TTG GCA TTT ACC CGC TTA CAC ATT AAT GCT CCA CAA1410Glu Leu Leu Asp Leu Ala Phe Thr Arg Leu His Ile Asn Ala Pro Gln425 430 435AGT CCC TTC CAA AAC CTC CAT TTC CTT CAG GTT CTG AAT CTC ACT TAC1458Ser Pro Phe Gln Asn Leu His Phe Leu Gln Val Leu Asn Leu Thr Tyr440 445 450TGC TTC CTT GAT ACC AGC AAT CAG CAT CTT CTA GCA GGC CTA CCA GTT1506Cys Phe Leu Asp Thr Ser Asn Gln His Leu Leu Ala Gly Leu Pro Val455 460 465 470CTC CGG CAT CTC AAC TTA AAA GGG AAT CAC TTT CAA GAT GGG ACT ATC1554Leu Arg His Leu Asn Leu Lys Gly Asn His Phe Gln Asp Gly Thr Ile475 480 485ACG AAG ACC AAC CTA CTT CAG ACC GTG GGC AGC TTG GAG GTT CTG ATT1602Thr Lys Thr Asn Leu Leu Gln Thr Val Gly Ser Leu Glu Val Leu Ile490 495 500TTG TCC TCT TGT GGT CTC CTC TCT ATA GAC CAG CAA GCA TTC CAC AGC1650Leu Ser Ser Cys Gly Leu Leu Ser Ile Asp Gln Gln Ala Phe His Ser505 510 515TTG GGA AAA ATG AGC CAT GTA GAC TTA AGC CAC AAC AGC CTG ACA TGC1698Leu Gly Lys Met Ser His Val Asp Leu Ser His Asn Ser Leu Thr Cys520 525 530GAC AGC ATT GAT TCT CTT AGC CAT CTT AAG GGA ATC TAC CTC AAT CTG1746Asp Ser Ile Asp Ser Leu Ser His Leu Lys Gly Ile Tyr Leu Asn Leu535 540 545 550GCT GCC AAC AGC ATT AAC ATC ATC TCA CCC CGT CTC CTC CCT ATC TTG1794Ala Ala Asn Ser Ile Asn Ile Ile Ser Pro Arg Leu Leu Pro Ile Leu555 560 565TCC CAG CAG AGC ACC ATT AAT TTA AGT CAT AAC CCC CTG GAC TGC ACT1842Ser Gln Gln Ser Thr Ile Asn Leu Ser His Asn Pro Leu Asp Cys Thr570 575 580TGC TCG AAT ATT CAT TTC TTA ACA TGG TAC AAA GAA AAC CTG CAC AAA1890Cys Ser Asn Ile His Phe Leu Thr Trp Tyr Lys Glu Asn Leu His Lys585 590 595CTT GAA GGC TCG GAG GAG ACA CGT GTG CAA AAC CCG CCA TCT CTA AGG1938Leu Glu Gly Ser Glu Glu Thr Arg Val Gln Asn Pro Pro Ser Leu Arg600 605 610GGA GTT AAG CTA TCT GAT GTC AAG CTT TCC TGT GGG ATT ACA GCC ATA1986Gly Val Lys Leu Ser Asp Val Lys Leu Ser Cys Gly Ile Thr Ala Ile615 620 625630GGC ATT TTC TTT CTC ATA GTA TTT CTA TTA TTG TTG GCT ATT CTG CTA2034Gly Ile Phe Phe Leu Ile Val Phe Leu Leu Leu Leu Ala Ile Leu Leu635 640 645TTT TTT GCA GTT AAA TAC CTT CTC AGG TGG AAA TAC CAA CAC TTT TAG2082Phe Phe Ala Val Lys Tyr Leu Leu Arg Trp Lys Tyr Gln His Phe650 655 660TGCTGAAGGT TTCCAGAGAA AGCAAATAAG TGTGCTTAGC AAAATTGCTC TAAGTGAAAG2142AACTGTCATC TGCTGGTGAC CAGACCAGAC TTTTCAGATT GCTTCCTGGA ACTGGGCAGG2202GACTCACTGT GCTTTTCTGA GCTTCTTACT CCTGTGAGTC CCAGAGCTAA AGAACCTTCT2262AGGCAAGTAC ACCGAATGAC TCAGTCCAGA GGGTCAGATG CTGCTGTGAG AGGCACAGAG2322CCCTTTCCGC ATGTGGAAGA GTGGGAGGAA GCAGAGGGAG GGACTGGGCA GGGACTGCCG2382GCCCCGGAGT CTCCCACAGG GAGGCCATTC CCCTTCTACT CACCGACATC CCTCCCAGCA2442CCACACACCC CGCCCCTGAA AGGAGATCAT CAGCCCCCAC AATTTGTCAG AGCTGAAGCC2502AGCCCACTAC CCACCCCCAC TACAGCATTG TGCTTGGGTC TGGGTTCTCA GTAATGTAGC2562CATTTGAGAA ACTTACTTGG GGACAAAGTC TCAATCCTTA TTTTAAATGA AAAAGAAAA2622GAAAAGCATA ATA2635(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)長度661氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:2(略)Met Ala Phe Asp Val Ser Cys Phe Phe Trp Val Val Leu Phe Ser Ala1 5 10 15Gly Cys Lys Val Ile Thr Ser Trp Asp Gln Met Cys Ile Glu Lys Glu
20 25 30Ala Asn Lys Thr Tyr Asn Cys Glu Asn Leu Gly Leu Ser Glu Ile Pro35 40 45Asp Thr Leu Pro Asn Thr Thr Glu Phe Leu Glu Phe Ser Phe Asn Phe50 55 60Leu Pro Thr Ile His Asn Arg Thr Phe Ser Arg Leu Met Asn Leu Thr65 70 75 80Phe Leu Asp Leu Thr Arg Cys Gln Ile Asn Trp Ile His Glu Asp Thr85 90 95Phe Gln Ser His His Gln Leu Ser Thr Leu Val Leu Thr Gly Asn Pro100 105 110Leu Ile Phe Met Ala Glu Thr Ser Leu Asn Gly Pro Lys Ser Leu Lys115 120 125His Leu Phe Leu Ile Gln Thr Gly Ile Ser Asn Leu Glu Phe Ile Pro130 135 140Val His Asn Leu Glu Asn Leu Glu Ser Leu Tyr Leu Gly Ser Asn His145 150 155 160Ile Ser Ser Ile Lys Phe Pro Lys Asp Phe Pro Ala Arg Asn Leu Lys165 170 175Val Leu Asp Phe Gln Asn Asn Ala Ile His Tyr Ile Ser Arg Glu Asp180 185 190Met Arg Ser Leu Glu Gln Ala Ile Asn Leu Ser Leu Asn Phe Asn Gly195 200 205Asn Asn Val Lys Gly Ile Glu Leu Gly Ala Phe Asp Ser Thr Val Phe210 215 220Gln Ser Leu Asn Phe Gly Gly Thr Pro Asn Leu Ser Val Ile Phe Asn225 230 235 240Gly Leu Gln Asn Ser Thr Thr Gln Ser Leu Trp Leu Gly Thr Phe Glu245 250 255Asp Ile Asp Asp Glu Asp Ile Ser Ser Ala Met Leu Lys Gly Leu Cys260 265 270Glu Met Ser Val Glu Ser Leu Asn Leu Gln Glu His Arg Phe Ser Asp275 280 285Ile Ser Ser Thr Thr Phe Gln Cys Phe Thr Gln Leu Gln Glu Leu Asp290 295 300Leu Thr Ala Thr His Leu Lys Gly Leu Pro Ser Gly Met Lys Gly Leu305 310 315 320Asn Leu Leu Lys Lys Leu Val Leu Ser Val Asn His Phe Asp Gln Leu325 330 335Cys Gln Ile Ser Ala Ala Asn Phe Pro Ser Leu Thr His Leu Tyr Ile340 345 350Arg Gly Asn Val Lys Lys Leu His Leu Gly Val Gly Cys Leu Glu Lys355 360 365Leu Gly Asn Leu Gln Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Asp Ile Glu Ala370 375 380Ser Asp Cys Cys Ser Leu Gln Leu Lys Asn Leu Ser His Leu Gln Thr385 390 395 400Leu Asn Leu Ser His Asn Glu Pro Leu Gly Leu Gln Ser Gln Ala Phe405 410 415Lys Glu Cys Pro Gln Leu Glu Leu Leu Asp Leu Ala Phe Thr Arg Leu420 425 430His Ile Asn Ala Pro Gln Ser Pro Phe Gln Asn Leu His Phe Leu Gln435 440 445Val Leu Asn Leu Thr Tyr Cys Phe Leu Asp Thr Ser Asn Gln His Leu450 455 460Leu Ala Gly Leu Pro Val Leu Arg His Leu Asn Leu Lys Gly Asn His465 470 475 480Phe Gln Asp Gly Thr Ile Thr Lys Thr Asn Leu Leu Gln Thr Val Gly485 490 495Ser Leu Glu Val Leu Ile Leu Ser Ser Cys Gly Leu Leu Ser Ile Asp500 505 510Gln Gln Ala Phe His Ser Leu Gly Lys Met Ser His Val Asp Leu Ser515 520 525His Asn Ser Leu Thr Cys Asp Ser Ile Asp Ser Leu Ser His Leu Lys530 535 540Gly Ile Tyr Leu Asn Leu Ala Ala Asn Ser Ile Asn Ile Ile Ser Pro545 550 555 560Arg Leu Leu Pro Ile Leu Ser Gln Gln Ser Thr Ile Asn Leu Ser His565 570 575Asn Pro Leu Asp Cys Thr Cys Ser Asn Ile His Phe Leu Thr Trp Tyr580 585 590Lys Glu Asn Leu His Lys Leu Glu Gly Ser Glu Glu Thr Arg Val Gln595 600 605Asn Pro Pro Ser Leu Arg Gly Val Lys Leu Ser Asp Val Lys Leu Ser610 615 620Cys Gly Ile Thr Ala Ile Gly Ile Phe Phe Leu Ile Val Phe Leu Leu625 630635 640Leu Leu Ala Ile Leu Leu Phe Phe Ala Val Lys Tyr Leu Leu Arg Trp645 650 655Lys Tyr Gln His Phe660(2)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)長度7堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:3:ACCATGG權(quán)利要求
1．編碼人類BAS-1蛋白或其片段的分離或重組核酸。
2．權(quán)利要求1的分離或重組核酸，其中所述核酸含有SEQ ID NO1限定的序列。
3．權(quán)利要求2的核酸，其中所述核酸與編碼所述片段的天然cDNA有至少約80％同一性。
4．權(quán)利要求2的分離或重組核酸，它至少編碼SEQ ID NO2的8個連續(xù)殘基。
5．權(quán)利要求4的核酸，它編碼至少12個連續(xù)殘基。
6．權(quán)利要求4的核酸，其中所述核酸與編碼所述片段的天然cDNA有至少約80％同一性。
7．基本上純的BAS-1蛋白或其肽。
8．權(quán)利要求7的蛋白或肽，選自a)來自靈長類，包括人類，的蛋白或肽；b)包含至少一個SEQ ID NO2限定的多肽片段的蛋白或肽；c)具有同天然BAS-1蛋白不同的翻譯后修飾方式的蛋白或肽；和d)缺乏BAS-1細(xì)胞內(nèi)區(qū)的蛋白。
9．權(quán)利要求8的蛋白或肽，包含和人類BAS-1相應(yīng)部分有序列同源性的片段，其中；a)所述同源性是至少約90％同一且所述部分是至少約9個氨基酸；b)所述同源性是至少約80％同一且所述部分是至少約17個氨基酸；或c)所述同源性是至少約70％同一且所述部分是至少約25個氨基酸。
10．包含有權(quán)利要求7 BAS-1肽的融合蛋白。
11．含有權(quán)利要求7蛋白和可藥用載體的組合物。
12．抗體或抗體結(jié)合片段，它特異結(jié)合重組或純化的靈長類BAS-1蛋白或其片段。
13．權(quán)利要求12的抗體，其中所述BAS-1蛋白是靈長類蛋白，包括來源于人類的一種。
14．權(quán)利要求12的抗體，其中所述抗體是針對SEQ ID NO2限定的肽序列。
15．權(quán)利要求12的抗體，其中所述抗體具有至少約10μM的Kd。
16．權(quán)利要求12的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
17．權(quán)利要求12的抗體，其中所述抗體被標(biāo)記。
18．權(quán)利要求12的抗體，其a)誘導(dǎo)B細(xì)胞強(qiáng)增殖；和/或b)保護(hù)B細(xì)胞免于輻射引起的編程性死亡。
19．包含權(quán)利要求1核酸的表達(dá)載體。
20．包含權(quán)利要求19載體的宿主細(xì)胞。
21．篩選樣品中BAS-1結(jié)合配偶體的方法，包括產(chǎn)生純化或重組BAS-1蛋白，篩選所述樣品中所述BAS-1蛋白特異結(jié)合的所述結(jié)合配偶體的步驟。
22．權(quán)利要求21的方法，其中所述樣品含有來自T細(xì)胞，樹狀細(xì)胞，包括濾泡樹狀細(xì)胞，或基質(zhì)細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，和上皮細(xì)胞的蛋白。
23．權(quán)利要求21的方法，其中所述結(jié)合配偶體是抗體，且所述樣品是雜交瘤上清。
24．調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理或發(fā)育的方法，包括用BAS-1蛋白的激動劑或拮抗劑觸所述細(xì)胞。
25．權(quán)利要求24的方法，其中所述拮抗劑是針對靈長類BAS-1蛋白的抗體。
26．權(quán)利要求24的方法，其中所述接觸是通過抗原受體，CD40:CD40配體通路，或CD28/CTLA-4:B7/B70通路和信號的介體結(jié)合。
全文摘要
一個編碼人類B細(xì)胞抗原的基因的純化和分離。提供了細(xì)胞發(fā)育,例如,淋巴樣細(xì)胞,調(diào)節(jié)中有用的核酸,蛋白,抗體,和其它試劑,以及其應(yīng)用方法。
文檔編號C07K14/435GK1225130SQ97196405
公開日1999年8月4日 申請日期1997年5月15日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月15日
發(fā)明者劉勇軍, I·福吉爾-韋維爾, J·班徹雷奧 申請人:先靈公司