本發(fā)明是在由國立衛(wèi)生研究院授予的DK080823，DK092456和GM063483下的政府支持下進行的。政府對本發(fā)明有一定的權利。

優(yōu)先權要求

本申請要求于2014年5月28日提交的題為“Methods and Systems for Converting Precursor Cells into Gastric Tissues through Directed Differentiation”的Wells等人的美國臨時專利申請No.62/003,719的優(yōu)先權和權益用于所有目的。

技術領域

本文中公開了涉及通過定向分化將干細胞轉化成特定組織或器官的方法和系統(tǒng)。特別地，公開了用于從人多能干細胞促進定形內胚層形成的方法和系統(tǒng)。還公開了用于從分化的定形內胚層促進胃類器官或組織形成的方法和系統(tǒng)。

發(fā)明背景

胃功能和構造在哺乳動物物種之間廣泛變化，以適應極其多種棲息地和飲食。因此，非人類胃發(fā)育和疾病模型具有相當大的局限性。例如，細菌幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori)感染世界人口的50％，其中10％發(fā)展為消化性潰瘍病，1-2％^1-3發(fā)展為胃癌。胃疾病，包括消化性潰瘍病和胃癌，影響世界人口的10％，并且主要是由于慢性幽門螺桿菌感染。幽門螺桿菌誘導的疾病的當前模型依賴于不表現(xiàn)出與人對感染的響應相同的病理生理特征的動物模型⁴，并且胃細胞系缺乏體內胃上皮的細胞和構造復雜性。因此，沒有足夠的模型來研究幽門螺桿菌感染的作用，就像它發(fā)生在人類中一樣。雖然最近使用成體胃干細胞的進展允許體外嚙齒類胃上皮的生長⁵，但是從人患者獲得這些細胞將需要手術。此外，這種方法不能用于對人胃的胚胎發(fā)育或基質-上皮相互作用建模。胚胎發(fā)育和成體胃的構造的物種差異使鼠模型對于器官發(fā)生和該器官的發(fā)病機理的研究變得不是最佳的。因此，需要強大的體外系統(tǒng)來闡明人類胃發(fā)育和疾病的根本機制，以及鑒定用于這些疾病的人類治療的新型治療。

本領域中需要用于精確控制前體細胞，如人多能干細胞的目的地的方法和系統(tǒng)，以便創(chuàng)建期望的特定類型的組織或生物體，特別是胃組織，其可以用于一個或多個上述目的。

發(fā)明概述

公開了誘導胃細胞和/或胃組織形成的方法，如以胃類器官的形式。可以通過激活和/或抑制前體細胞內的一種或多種信號傳導途徑來進行胃細胞和/或組織的形成。還公開了使用所公開的胃細胞，胃組織和/或源自前體細胞的胃類器官的方法。

附圖簡述

本領域技術人員將理解，下面描述的附圖僅用于說明的目的。附圖不旨在以任何方式限制本教導的范圍。

專利或申請文件包含至少一個彩色附圖。根據請求并支付必要的費用后，由官方提供具有彩色附圖的本專利或專利申請公開文本的副本。

圖1描繪了Sox2/Cdx2/B-連環(huán)蛋白在胃球體中的表達和RA的作用。

圖2A-2E描述了用于定向將hPSC分化為三維胃類器官的體外培養(yǎng)系統(tǒng)的示意圖(圖2A)，通過用Sox2，Pdx1和Cdx2對小鼠E10.5胚胎的整裝免疫熒光染色的發(fā)育中的后部前腸器官的限定標志物(圖2B)，在存在和不存在RA的情況下的PDX1表達(圖2C)，顯示后部前腸球體生長成hGO期間的形態(tài)學變化的立體顯微照片(圖2D)，在E14.5和E18.5和hGO發(fā)育的相當階段時的發(fā)育中的小鼠竇的比較(圖2E)。

圖3A-3D描述了P12竇，E18.5竇和d34類器官中的Muc5AC，TFF2，GSII UEAI和CHGA表達(圖3A)，hGO發(fā)育期間在生長，形態(tài)發(fā)生和細胞類型特化中EGF的不同作用的示意圖(圖3B)，在具有和沒有DOX的胃類器官中胃泌素，生長素釋放肽，5-HT和ChrA的表達(圖3C)，以及在多種濃度的EGF下的NEUROG3的相對表達(圖3D)。

圖4A-4D描繪了在d34類器官，E18.5竇和P12竇中的SOX9Ki67表達(圖4A)，使用亮視野顯微術和免疫熒光染色顯現(xiàn)的類器官的幽門螺桿菌感染(圖4B)，癌基因c-Met的免疫沉淀(圖4C)，和通過EdU摻入測量的hGO上皮中的細胞增殖(圖4D)。

圖5A-5D描繪了在存在GSK3β抑制劑CHIR99021的情況下的Sox2和Cdx2表達和在存在和不存在頭蛋白的情況下的重組WNT3A(圖5A)，使用明視野顯微術顯現(xiàn)的CHIR誘導的腸管形態(tài)發(fā)生和球體產生(圖5B)，單層培養(yǎng)物的免疫熒光染色以評價在CHIR/FGF處理的內胚層中的CDX2誘導和在頭蛋白和CHIR/FGF/頭蛋白處理的內胚層中的SOX2誘導(圖5C)，BMP靶基因MSX1/2的qPCR分析(圖5D)，以及在存在和不存在BMP2的情況下的SOX2和CDX2表達。

圖6A-6G描繪了比較兩個hESC系(H1和H9)和一個iPSC系(72.3)之間的球體形成和特征的表(圖6A)，源自H1和iPSC 72.3細胞系的第34天hGO的免疫熒光染色(圖6B)，第34天hGO中的器官上皮細胞類型定量(圖6C)，誘導的多能干細胞系iPSC 72.3的表征(圖6D-G)。

圖7A-7D描繪了顯示前腸模式化(patterning)實驗的示意圖(圖7A)，顯示RA增加了從前腸單層培養(yǎng)物產生的球體數(shù)目的明場圖像(圖7B)，圖1d的較低功率圖像，其顯示具有位于前腸后部部分的Hnf1β蛋白的14個體節(jié)期胚胎的免疫熒光圖像(圖7C)，用RA處理的前腸球體中的基因表達的qPCR分析(圖7D)。

圖8描述了hGO分化的晚期階段的明場圖像和免疫染色。

圖9描述了在體內竇發(fā)育的四個胚胎階段(E12.5，E14.5，E16.5和E18.5)和一個出生后階段(P12)期間在小鼠竇和人胃類器官發(fā)育期間的轉錄因子表達。

圖10描述了E12.5竇和第13天hGO中的pHH3/E-Cad/DAPI表達和aPCC/E-CAD/DAPI表達。

圖11A-11C描述了竇間質轉錄因子BAPX1的表達(圖11A)和間質細胞類型標志物的染色(圖11C)。

圖12描繪了體內胃竇內分泌細胞發(fā)育。

圖13A-13B描述了泛內分泌標志物CHGA的染色(圖13A)和內分泌標志物CHGA，胃泌素，生長素釋放肽和促生長素抑制素的表達(圖13B)。

圖14顯示了胃類器官的定向分化的方法的概述。指示分化過程中的每個步驟以及代表性的立體顯微照片。

圖15描繪了小鼠胃的示意圖和在前胃，胃底，竇和十二指腸中的已知區(qū)域標志物的測量。

圖16描繪了在前胃，胃底，竇和十二指腸中的新的區(qū)域標志物的測量。

圖17描繪了胃底特化方案和在對照，Wnt100，Wnt500和CHIR處理的細胞中的GAPDH，Gata4，Axin2，Sox2，Pdx1和Cdx2的測量。y軸代表相對基因表達。

圖18描繪了胃底方案中Axin2，IRX2，IRX3，Pitx1和IRX4的測量。y軸代表相對基因表達。

圖19是描述來自定形內胚層的腸組織，胃底組織和竇組織形成的示意圖。

發(fā)明詳述

除非另有說明，術語應根據相關領域的普通技術人員的常規(guī)用法來理解。

如本文中使用，術語“全能干細胞”(也稱為全能干細胞)是可以分化成胚胎和胚外細胞類型的干細胞。此類細胞可以構建完整的，活的生物體。這些細胞由卵和精細胞的融合產生。受精卵的前幾次分裂產生的細胞也是全能的。

如本文中使用，術語“多能干細胞(PSC)”包括可以分化為幾乎所有身體細胞類型的任何細胞，即源自三個胚層(生殖上皮)中的任一個的細胞，包括內胚層(內部胃粘膜(interior stomach lining)，胃腸道，肺)，中胚層(肌肉，骨，血液，泌尿生殖器)和外胚層(表皮組織和神經系統(tǒng))。PSC可以是前植入囊胚(primplantation blastocyst)的內細胞團細胞的后代，或通過強制某些基因的表達通過誘導非多能細胞(例如成體體細胞)獲得。多能干細胞可以源自任何合適的來源，如本領域技術人員容易理解的。多能干細胞來源的實例包括哺乳動物來源，包括人，嚙齒類，豬，牛，但不限于此。

如本文中使用，術語“誘導多能干細胞(iPSC)”，通常也縮寫為iPS細胞，是指通過誘導某些基因的“強制”表達人工源自正常非多能細胞(如成體體細胞)的多能干細胞類型。

如本文中使用，術語“胚胎干細胞(ESC)”，通常也縮寫為ES細胞，是指多能性并源自胚泡(早期胚胎)的內部細胞團的細胞。為了本發(fā)明的目的，術語“ESC”有時也廣泛用于涵蓋胚胎生殖細胞。

如本文中使用，術語“前體細胞”包括可用于本文所述的方法中的任何細胞，經由所述方法，一種或多種前體細胞獲得更新自身或分化成一種或多種特化細胞類型的能力。在一些實施方案中，前體細胞是多能的或具有變成多能性的能力。在一些實施方案中，對前體細胞進行外部因子(例如生長因子)的處理以獲得多能性。在一些實施方案中，前體細胞可以是全能(或全能)干細胞；多能干細胞(誘導或非誘導)；多能干細胞；寡能干細胞和單能干細胞。在一些實施方案中，前體細胞可來自胚胎，嬰兒，兒童或成人。在一些實施方案中，前體細胞可以是經受治療的體細胞，使得通過遺傳操作或蛋白質/肽治療賦予多能性。

在發(fā)育生物學中，細胞分化是不太特化的細胞變?yōu)楦鼗募毎愋偷倪^程。如本文中使用，術語“定向分化”描述了不太特化的細胞變?yōu)樘囟ǖ奶鼗屑毎愋偷倪^程?？赏ㄟ^可用于定義或改變初始細胞的命運的任何可應用的方法來確定特化靶細胞類型的特殊性。示例性方法包括但不限于遺傳操作，化學處理，蛋白質處理和核酸處理。

如本文中使用，術語“細胞成分”是單個基因，蛋白質，mRNA表達基因和/或任何其它可變的細胞組分或蛋白質活性，例如蛋白質修飾(例如磷酸化)的程度，例如，其通常由本領域技術人員在生物實驗(例如，通過微陣列或免疫組織化學)中測量。與存活系統(tǒng)，常見的人類疾病，基因發(fā)現(xiàn)和結構測定根本的生物化學過程的復雜網絡有關的重大發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在可歸因于作為研究過程的一部分的細胞組分豐度數(shù)據的應用。細胞組分豐度數(shù)據可以幫助鑒定生物標志物，區(qū)分疾病亞型和鑒定毒性的機制。

在所有多細胞生物體中發(fā)現(xiàn)干細胞。它們的特征在于通過有絲分裂細胞分裂自我更新并分化成多種多樣的一批特化細胞類型的能力。兩種廣泛類型的哺乳動物干細胞是1)從胚泡的內部細胞團分離的胚胎干細胞，和2)在成體組織中發(fā)現(xiàn)的成體干細胞。在發(fā)育中的胚胎中，干細胞可以分化成所有特化的胚胎組織。在成年生物體中，干細胞和祖細胞充當身體的修復系統(tǒng)，補充特化的細胞，但也保持再生器官(如血液，皮膚或胃組織)的正常更新。

現(xiàn)在可以通過細胞培養(yǎng)使干細胞生長并轉化成具有與各種組織(如肌肉或神經)的細胞一致的特征的特化細胞。來自多種來源的高度塑性成體干細胞，包括臍帶血和骨髓，常規(guī)用于醫(yī)療療法。通過治療性克隆產生的胚胎細胞系和自體胚胎干細胞也已被提出作為未來治療的有希望的候選者。

干細胞的經典定義通常指示兩種性質：自我更新，經歷多次細胞分裂周期同時保持未分化狀態(tài)的能力，以及效力，分化成特化細胞類型的能力。在一些實施方案中，干細胞是全能的或多能的，即它們能夠產生任何成熟細胞類型，盡管多能或單能祖細胞有時可以稱為干細胞。

效力指定干細胞的分化潛能(分化成不同細胞類型的潛力)。全能干細胞(也稱為全能性干細胞)可以分化成胚胎和胚外細胞類型。這些細胞可以構建完整的，活的生物體。細胞由卵和精細胞的融合產生。受精卵的前幾次分裂產生的細胞也是全能的。多能干細胞(PSC)是全能細胞的后代，并且可以分化成幾乎所有細胞，即源自三個胚層中的任一個的細胞，包括內胚層(內部胃粘膜，胃腸道，肺)，中胚層(肌肉，骨，血，泌尿生殖器)和外胚層(表皮組織和神經系統(tǒng))。多能干細胞可以分化成許多細胞，但是僅分化為密切相關的細胞家族的細胞。寡能干細胞可以分化成僅少數(shù)細胞，如淋巴樣或髓樣干細胞。單能細胞只能產生一種它們自己的細胞類型，但具有將其與非干細胞(例如肌肉干細胞)區(qū)分開的自我更新的性質。

胚胎和誘導的多能干細胞對研究人類疾病和產生在動物模型中治療有效的替代組織的能力已經具有前所未有的影響。

在發(fā)育生物學中，細胞分化是不太特化的細胞變成更特化的細胞類型的過程。定向將人PSC分化為治療性細胞類型的最成功的努力是基于胚胎器官發(fā)育的研究。實例包括肝的肝細胞和胰腺內分泌細胞的產生，其在肝病和糖尿病的動物模型中顯示出功能潛力。類似地，PSC分化為腸可以為疾病，如壞死性小腸結腸炎(necrotizing enterocolitis)，炎性腸病和短腸綜合征提供治療益處。

如上討論，多能干細胞具有分化成三種胚層中的任一種的潛能：內胚層(內部胃粘膜，胃腸道，肺)，中胚層(肌肉，骨，血液，泌尿生殖器)和外胚層(表皮組織和神經系統(tǒng))。因此，多能干細胞可以產生任何胎兒或成人細胞類型。然而，特定多能干細胞的命運由許多細胞信號傳導途徑和許多因素控制。此外，多能干細胞單獨不能發(fā)育成胎兒或成年動物，因為它們缺乏有助于胚胎外組織，如胎盤的潛力。

迄今為止，尚未從人多能干細胞(hPSC)產生胃組織。將PSC分化為肺，肝，胰腺和腸細胞的成功努力已經取決于對這些器官的胚胎發(fā)育的良好的分子理解。^6-10不幸的是，本領域中的一個問題是在內胚層形成后的胃發(fā)育的理解中的許多缺口。因此，為了指導hPSC分化為胃組織，申請人鑒定了調節(jié)早期胃發(fā)育的幾個關鍵階段的信號傳導途徑，包括前腸特化和模式化，胃特化，以及最后胃上皮生長和分化。此外，為了產生更功能性的，復雜的三維組織，申請人旨在誘導在胃發(fā)育期間發(fā)生的幾種形態(tài)發(fā)生過程，包括前腸管的形態(tài)發(fā)生和胃上皮結構(包括腺體和凹陷(pit))的形成。

如本文中所述，使用生長因子操作的時間系列來建立方法和系統(tǒng)，以模擬培養(yǎng)物中的胚胎胃組織發(fā)育。特別地，建立了在體外指導PSC(人胚胎干細胞(hESC)和誘導多能干細胞(iPSC)二者)分化成胃組織的方法和系統(tǒng)。這些因素在體外在接近胎兒腸發(fā)育的階段中指導人類腸發(fā)育：激活蛋白誘導的定形內胚層(DE)形成；FGF/Wnt/BMP誘導后部前腸模式化，和最后通過調節(jié)視黃酸和EFG信號轉導獲得的前胃培養(yǎng)系統(tǒng)，所述信號轉導促進胃組織生長，形態(tài)發(fā)生和細胞分化成功能性胃細胞類型和形態(tài)，包括胃腺體和凹陷，增殖區(qū)，表面和竇粘液細胞和表達胃泌素，生長素釋放肽和促生長素抑制素的內分泌細胞。

申請人已經鑒定了新的胚胎信號傳導途徑，其允許人PSC有效地逐步分化成具有復雜構造和細胞組成的胃細胞，胃組織和/或三維胃組織(hGO)。申請人進一步發(fā)現(xiàn)了，發(fā)育中的hGO經歷分子和形態(tài)學分化階段，其與小鼠發(fā)育中的竇幾乎相同，并且所得的胃類器官可含有構成與胎兒/出生后胃相當?shù)恼８]上皮和三維構造的粘液，內分泌和祖細胞的排列(array)。

所公開的人胃細胞，胃組織和/或胃類器官(hGO)可以用作體外系統(tǒng)以鑒定人胃發(fā)育，生理學的新機制，并且可以用作胃上皮對幽門螺桿菌的病理生理應答的模型。所公開的胃細胞，胃組織和/或胃hGO和方法為藥物發(fā)現(xiàn)和胃癌的早期階段的建模呈現(xiàn)了新的機會。此外，本文中公開了人胚胎前腸的第一次三維產生，其是產生其它前腸器官組織，包括肺和胰腺的有前景的起點。

在一個方面，公開了誘導從前體細胞形成胃細胞，胃組織和/或胃hGO的方法。所述方法可以包括以下步驟：a)激活前體細胞內的一種或多種信號傳導途徑，其中所述一種或多種信號傳導途徑選自WNT信號傳導途徑，WNT/FGF信號傳導途徑和FGF信號傳導途徑，以獲得從前體細胞轉變的胃細胞，胃組織和/或胃hGO。該方法可以進一步包括抑制前體細胞內的一種或多種信號傳導途徑的步驟b)。受到抑制的一種或多種信號傳導途徑可以包含BMP信號傳導途徑。

該方法還可以包括使前體細胞與視黃酸接觸的步驟。前體細胞與視黃酸的接觸可以在上述激活和抑制步驟之后發(fā)生。

該方法可以進一步包括以足以將胃類器官的直徑增加到直徑大于約1mm或直徑大于約2mm，或直徑大于約3mm，或直徑大于約4mm的濃度和/或時間長度使胃類器官與EGF接觸的步驟。

在一個方面，所述一種或多種信號傳導途徑可以選自Wnt信號傳導途徑，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導，Wnt/APC信號傳導和Wnt/PCP途徑信號傳導。

在一個方面，激活Wnt信號途徑的步驟可包括使前體細胞與選自Wnt1，Wnt2，Wnt2b，Wnt3，Wnt3a，Wnt4，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt8a，Wnt8b，Wnt9a，Wnt9b，Wnt10a，Wnt10b，Wnt11和Wnt16的一種或多種分子接觸。

在一個方面，激活FGF信號傳導途徑的步驟可包括使前體細胞與選自FGF1，F(xiàn)GF2，F(xiàn)GF3，F(xiàn)GF4，F(xiàn)GF5，F(xiàn)GF6，F(xiàn)GF7，F(xiàn)GF8，F(xiàn)GF9，F(xiàn)GF10，F(xiàn)GF11，F(xiàn)GF12，F(xiàn)GF13，F(xiàn)GF14，F(xiàn)GF16，F(xiàn)GF17，F(xiàn)GF18，F(xiàn)GF19，F(xiàn)GF20，F(xiàn)GF21，F(xiàn)GF22和FGF23的一種或多種分子接觸。

在一個方面，抑制BMP信號傳導途徑的步驟可以包括使前體細胞與BMP抑制劑接觸。在一個方面，BMP抑制劑可以選自Dorsomorphin，LDN189，DMH-1，頭蛋白及其組合。在一個方面，BMP抑制劑可以是頭蛋白。

在一個方面，激活步驟可以包括在稱為溫育期的規(guī)定期里使前體細胞與Wnt3a，F(xiàn)GF4和BMP抑制劑接觸。接觸步驟可以同時進行，或者在其它方面，接觸步驟可以隨后進行。

在一個方面，在第一溫育期可以通過信號傳導劑接觸可包含定形內胚層的前體細胞，所述信號傳導劑可以包含1)Wnt3a或GSK-抑制劑(例如CHIRON)與2)FGF4的組合。第一溫育期可以進一步包含BMP抑制劑。在第一溫育期后，可將前體細胞進行第二溫育期，其中使前體細胞與視黃酸(RA)接觸。在一個方面，第一溫育期和第二溫育期重疊。在一些實施方案中，第一溫育期和第二溫育期不重疊。

在一個方面，第一和/或第二溫育期和/或第一和第二溫育期的總體可以為24至120小時，或約36至約108小時，或約48至約110小時，約96小時，或約60至約84小時。在一個方面，第一溫育期可以是至少約24小時。

一方面，第二溫育期(其中前體細胞可與RA接觸)在第一溫育期后約72小時開始。在另一方面，第二溫育期在培養(yǎng)物已經從前體細胞形成前腸球體之后開始。然后，可將前腸球體在適于形成胃類器官的生長條件下轉移至3-維基質，例如通過將前腸球應用于基質膠^TM(Corning，BD Bioscience)進行。在轉移到基質膠后，在第三溫育期期間使前腸球體與RA接觸，在第三溫育期中可發(fā)生持續(xù)的3D生長。然后，可以在第四溫育期期間使球體與EGF接觸，所述第四溫育期可與第三溫育期重疊。第三溫育期可以是約24小時。

在一個方面，前體細胞可以與50-1500ng/ml，或約100至約1200ng/ml，或約200至約1000ng/ml，或約300至約900ng/ml，或約400至約800ng/ml，或約500至約700ng/ml的濃度的Wnt3a接觸。

在一個方面，前體細胞可以選自胚胎干細胞，胚胎生殖細胞，誘導的多能干細胞，中胚層細胞，定形內胚層細胞，后內胚層細胞和后腸細胞。

在一個方面，前體細胞可以是源自多能干細胞的定形內胚層細胞。

在一個方面，前體細胞可以是多能干細胞，如胚胎干細胞，胚胎干細胞或誘導的多能干細胞。

在一個方面，可通過使多能干細胞與選自激活蛋白，TGF-β生長因子的超家族的BMP亞類；Nodal，激活蛋白A，激活蛋白B，BMP4，Wnt3a及其組合的一種或多種分子接觸衍生定形內胚層細胞。

在一個方面，可以從一種或多種前體細胞體外產生胃組織。

在一個方面，一種或多種前體細胞可以選自胚胎干細胞，中胚層細胞，定形內胚層細胞，后內胚層細胞，前內胚層細胞，前腸細胞和后腸細胞。

在一個方面，多能干細胞可以是哺乳動物多能干細胞，包括但不限于人多能干細胞或小鼠多能干細胞。

在一個方面，人多能干細胞可以選自人胚胎干細胞，人胚胎生殖細胞和誘導的人多能干細胞。

在一個方面，提供了包含在體外從一種或多種前體細胞產生的胃細胞，組織或類器官的試劑盒。

在一個方面，提供了用于鑒定胃細胞或組織的吸收效應的方法。該方法可以包括以下步驟：使源自前體細胞的胃細胞，組織或類器官與化合物接觸；并且檢測所述胃細胞或組織對化合物的吸收水平。

在一個方面，提供了用于鑒定化合物對胃細胞或組織的毒性的方法。該方法可以包括以下步驟：使源自前體細胞的胃細胞，組織或類器官與化合物接觸；并且檢測所述胃細胞或組織對化合物的吸收水平。

在一個方面，公開了包含從頭產生的三維人胃類組織(hGO)的組合物，以及通過人多能干細胞(hPSC)的定向分化來制備它們的方法。此類hGO可用于對胃發(fā)育以及幽門螺桿菌感染期間發(fā)生的早期事件建模。

在一個方面，公開了通過人多能干細胞(hPSC)的定向分化體外產生hGO的方法。該人胃組織可用于對人胃發(fā)育和疾病建模。還公開了誘導定形內胚層(DE)以形成3維腸管結構的方法。在一個方面，這可以通過激活FGF和WNT信號傳導來進行，而前腸命運可以通過同時抑制BMP信號傳導來促進。然后，可以通過操縱視黃酸和EGF信號傳導將前腸球體定向為后部前腸和胃命運，產生hGO。

形成中的hGO可以經歷與發(fā)育中的小鼠竇幾乎相同的分子和形態(tài)發(fā)生變化，形成胃腺和凹陷，增殖區(qū)，表面和竇粘液細胞和表達胃泌素，生長素釋放肽和促生長素抑制素的內分泌細胞。使用hGO對人胃發(fā)育建模，已經確定EGF信號傳導抑制轉錄因子NEUROGENIN 3上游的內分泌細胞發(fā)育。申請人進一步發(fā)現(xiàn)hGO忠實地重演由幽門螺桿菌引發(fā)的胃疾病的早期階段，包括快速激活c-Met信號傳導和上皮增殖。這些研究一起描述一個新穎和強力的體外系統(tǒng)以闡明人類胃發(fā)育和疾病的根本機制。

源自胚胎細胞的多能干細胞

在一個方面，方法可包括獲得多能性或可被誘導變成多能性的干細胞的步驟。在一些實施方案中，多能干細胞源自胚胎干細胞，其又源自早期哺乳動物胚胎的全能細胞，并且能夠在體外具有無限的未分化增殖。胚胎干細胞是源自胚泡(早期胚胎)的內細胞團的多能干細胞。用于從胚細胞衍生胚胎干細胞的方法是本領域熟知的。例如，雖然本文中舉例說明了某些細胞類型，但是本領域技術人員應當理解，本文中所述的方法和系統(tǒng)適用于任何干細胞。

可以在根據本發(fā)明的實施方案中使用的另外的干細胞包括但不限于以下提供的或由以下主辦的數(shù)據庫；和由普林斯頓大學和賓夕法尼亞大學主辦的干細胞數(shù)據庫中描述的那些干細胞：國家干細胞庫(National Stem Cell Bank,NSCB)，人類胚胎干細胞研究中心(NSCB)，在加利福尼亞大學舊金山分校(UCSF)；WISC細胞庫，在Wi細胞研究所；威斯康星大學干細胞和再生醫(yī)學中心(UW-SCRMC)；Novocell,Inc.(San Diego,Calif.)；Cellartis AB(Goteborg,Sweden)；ES Cell International Pte Ltd(新加坡)；Technion，以色列理工學院(以色列海法)?？捎糜诟鶕景l(fā)明的實施方案中的示例性胚胎干細胞包括但不限于SA01(SA001)；SA02(SA002)；ES01(HES-1)；ES02(HES-2)；ES03(HES-3)；ES04(HES-4)；ES05(HES-5)；ES06(HES-6)；BG01(BGN-01)；BG02(BGN-02)；BG03(BGN-03)；TE03(13)；TE04(14)；TE06(16)；UC01(HSF1)；UC06(HSF6)；WA01(H1)；WA07(H7)；WA09(H9)；WA13(H13)；WA14(H14)。

在一些實施方案中，干細胞可以進一步修飾以摻入另外的性質。示例性修飾的細胞系包括但不限于H1 OCT4-EGFP；H9 Cre-LoxP；H9 hNanog-pGZ；H9 hOct4-pGZ；GFPhES中的H9；以及H9 Syn-GFP。

關于胚胎干細胞的更多細節(jié)可以參見例如Thomson et al.,1998,“Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts,”Science 282(5391):1145-1147；Andrews et al.,2005,“Embryonic stem(ES)cells and embryonal carcinoma(EC)cells:opposite sides of the same coin,”Biochem Soc Trans 33:1526-1530；Martin 1980,“Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis,”.Science 209(4458):768-776；Evans and Kaufman,1981,“Establishment in culture of pluripotent cells from小鼠embryos,”Nature 292(5819):154-156；Klimanskaya et al.,2005,“Human embryonic stem cells derived without feeder cells,”Lancet 365(9471):1636-1641；每篇在此以其整體并入本文。

或者，多能干細胞可源自胚胎生殖細胞(EGC)，其是產生有性繁殖的生物體的配子的細胞。EGC源自在晚期胚胎的性腺脊中發(fā)現(xiàn)的原始生殖細胞，具有胚胎干細胞的許多性質。胚胎中的原始生殖細胞發(fā)育成干細胞，其在成年人中產生繁殖配子(精子或卵)。在小鼠和人中，可以在合適的條件下在組織培養(yǎng)物中培養(yǎng)胚胎生殖細胞。EGC和ESC二者都是多能的。為了本發(fā)明的目的，術語“ESC”有時廣泛地用于涵蓋EGC。

誘導的多能干細胞(iPSC)

在一些實施方案中，通過將某些干細胞相關基因轉染到非多能細胞(如成體成纖維細胞)中衍生iPSC。轉染通常通過病毒載體，如逆轉錄病毒實現(xiàn)。轉染的基因包括主轉錄調節(jié)子Oct-3/4(Pouf51)和Sox2，雖然提示了其它基因增強誘導的效率。3-4周后，少量轉染的細胞開始在形態(tài)和生物化學上類似于多能干細胞，并且通常通過形態(tài)選擇，倍增時間或通過報告基因和抗生素選擇來分離。如本文中使用，iPSC可包括但不限于第一代iPSC，小鼠中的第二代iPSC和人誘導的多能干細胞。在一些實施方案中，逆轉錄病毒系統(tǒng)可用于使用四種關鍵基因：Oct3/4，Sox2，Klf4和c-Myc將人成纖維細胞轉化為多能干細胞。在備選實施方案中，慢病毒系統(tǒng)用于用OCT4，SOX2，NANOG和LIN28轉化體細胞。其表達可在iPSC中誘導的基因包括但不限于Oct-3/4(例如Pou5fl)；Sox基因家族的某些成員(例如Sox1，Sox2，Sox3和Sox15)；Klf家族的某些成員(例如Klf1，Klf2，Klf4和Klf5)，Myc家族的某些成員(例如C-myc，L-myc和N-myc)，Nanog和LIN28。

在一些實施方案中，可以采用基于非病毒的技術來產生iPSC。在一些實施方案中，腺病毒可用于將必需的四種基因轉運到小鼠的皮膚和肝細胞的DNA中，產生與胚胎干細胞相同的細胞。由于腺病毒不將其自身基因中的任一種與靶向宿主組合，消除了創(chuàng)建腫瘤的危險。在一些實施方案中，重編程可以通過根本沒有任何病毒轉染系統(tǒng)的質粒完成，盡管效率非常低。在其它實施方案中，蛋白質的直接遞送用于產生iPSC，因此消除對病毒或遺傳修飾的需要。在一些實施方案中，使用類似的方法可以產生小鼠iPSC：用通過聚精氨酸錨定物引導入細胞中的某些蛋白質重復處理細胞足以誘導多能性。在一些實施方案中，多能性誘導基因的表達也可以通過在低氧條件下用FGF2處理體細胞來增加。

關于胚胎干細胞的更多細節(jié)可以參見例如Kaji et al.,2009,“Virus free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors,”Nature 458:771-775；Woltjen et al.,2009,“piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells,”Nature 458:766-770；Okita et al.,2008,“Generation of小鼠Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors,”Science 322(5903):949-953；Stadtfeld et al.,2008,“Induced Pluripotent Stem Cells Generated without Viral Integration,”Science 322(5903):945-949；and Zhou et al.,2009,“Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins,”Cell Stem Cell 4(5):381-384；每篇在此以其整體并入本文。

在一些實施方案中，示例性iPS細胞系包括但不限于iPS-DF19-9；iPS-DF19-9；iPS-DF4-3；iPS-DF6-9；iPS(包皮)；iPS(IMR90)；和iPS(IMR90)。

已經顯示iPSC能夠以類似于ESC的方式分化成完全分化的組織。例如，將iPSC分化成表達βIII-微管蛋白，酪氨酸羥化酶，AADC，DAT，ChAT，LMX1B和MAP2的神經元。兒茶酚胺相關酶的存在可能表明iPSCs，像hESC一樣，可以是可分化成多巴胺能神經元。顯示干細胞相關基因在分化后下調。還已經顯示iPSC可以分化成自發(fā)開始跳動的心肌細胞。心肌細胞表達TnTc，MEF2C，MYL2A，MYHCβ和NKX2.5。干細胞相關基因在分化后下調。

胃器官和發(fā)育

在申請人的發(fā)明之前，沒有系統(tǒng)可用于將前體細胞，如胚胎干細胞和/或iPSC轉化為胃組織。

在一些實施方案中，PSC，如ESC和iPSC以逐步方式首先進行定向分化成內胚層(DE)，然后分化成三維腸管結構(前腸球體)，然后通過后部前腸/胃組織的形成分化成三維胃類器官組織(hGO)。

在一些實施方案中，PSC，如ESC和iPSC以非步進方式進行定向分化，其中用于促進DE形成的分子(例如生長因子，配體)和用于隨后組織形成的分子在相同的時間添加。

定形內胚層

胃的上皮源自稱為定形內胚層(DE)的簡單的細胞片層。前部DE形成前腸及其相關器官，包括肺，食道，胃，肝和胰腺，并且后部DE形成中腸和后腸，其形成小腸和大腸以及泌尿生殖系統(tǒng)的部分。DE在體內產生胃腸道和呼吸道的上皮。使用小鼠，雞和青蛙胚胎的研究表明在原腸胚階段在DE中建立前部-后部模式是隨后的前腸和后腸發(fā)育的先決條件。在一些實施方案中，PSC，如ESC和iPSC以逐步的方式首先定向分化成定形內胚層(DE)，然后分化成前部/前腸上皮(例如，前腸球)，然后分化成胃組織。認為BMP，Wnt和FGF信號傳導途徑對于該過程是關鍵的。WNT和FGF的激活作用為促進腸管形態(tài)發(fā)生，并且抑制BMP信號傳導促進前腸命運。前腸的簡單立方上皮首先發(fā)育成假復層柱狀上皮，然后發(fā)育成腺體和凹陷，它們含有胃上皮和在絨毛基部的增殖區(qū)，其對應于假定的祖先域。

建立了強力和有效的過程，以在體外指導DE分化成胃組織。在一些實施方案中，通過選擇性激活iPSC和/或DE細胞中的某些信號傳導途徑來實現(xiàn)定向分化。在一些實施方案中，信號傳導途徑是在胃組織發(fā)育中有活性的那些，包括但不限于Wnt信號傳導途徑，Wnt/APC信號傳導途徑，F(xiàn)GF信號傳導途徑，TGF-β信號傳導途徑，BMP信號傳導途徑；EGF信號途徑和視黃酸信號途徑。

關于與DE發(fā)育和/或腸發(fā)育相關的信號傳導途徑的功能的更多細節(jié)一般可以參見例如Zorn and Wells,2009,“Vertebrate endoderm development and organ formation,”Annu Rev Cell Dev Biol 25:221-251；Dessimoz et al.,2006,“FGF signaling is necessary for establishing gut tube domains along the anterior-posterior axis in vivo,”Mech Dev 123:42-55；McLin et al.,2007,“Repression of Wnt/{beta}-catenin signaling in the anterior endoderm is essential for liver and pancreas development.Development,”134:2207-2217；Wells and Melton,2000,Development 127:1563-1572；de Santa Barbara et al.,2003,“Development and differentiation of the intestinal epithelium,”Cell Mol Life Sci 60(7):1322-1332；Sancho et al.,2004,“Signaling Pathways in Intestinal Development and Cancer,”Annual Review of Cell and Developmental Biology 20:695-723；Logan and Nusse,2004,“The Wnt Signaling Pathway in Development and Disease,”Annual Review of Cell and Developmental Biology 20:781-810；Taipalel and Beachyl,2001,“The Hedgehog and Wnt signalling pathways in cancer,”Nature 411:349-354；Gregorieff and Clevers,2005,“Wnt signaling in the intestinal epithelium:from endoderm to cancer,”Genes&Dev.19:877-890；每篇在此以其整體并入本文。

用于從多能細胞(例如iPSC或ESC)產生定形內胚層的任何方法適用于本文所述的方法。在一些實施方案中，多能細胞源自桑椹胚。在一些實施方案中，多能干細胞是干細胞。在這些方法中使用的干細胞可以包括但不限于胚胎干細胞。胚胎干細胞可以源自胚胎內細胞團或胚胎性腺脊。胚胎干細胞或生殖細胞可以源自多種動物物種，包括但不限于各種哺乳動物物種，包括人。在一些實施方案中，人胚胎干細胞用于產生定形內胚層。在一些實施方案中，人胚胎生殖細胞用于產生定形內胚層。在一些實施方案中，iPSC用于產生定形內胚層。

在一些實施方案中，在從多能干細胞到DE細胞的分化過程中使用一種或多種生長因子。在分化過程中使用的一種或多種生長因子可以包括來自TGF-β超家族的生長因子。在此類實施方案中，一種或多種生長因子包含TGF-β生長因子超家族的Nodal/激活蛋白和/或BMP亞群。在一些實施方案中，所述一種或多種生長因子選自Nodal，激活蛋白A，激活蛋白B，BMP4，Wnt3a或任何這些生長因子的組合。

在一些實施方案中，用一種或多種生長因子將胚胎干細胞或誘導的多能細胞和iPSC處理6小時以上；12小時以上；18小時以上；24小時以上；36小時以上；48小時以上；60小時以上；72小時以上；84小時以上；96小時以上；120小時以上；150小時以上；180小時以上；或240小時以上。

在一些實施方案中，用濃度為10ng/ml或更高；20ng/ml或更高；50ng/ml或更高；75ng/ml或更高；100ng/ml或更高；120ng/ml或更高；150ng/ml或更高；200ng/ml或更高；500ng/ml或更高；1,000ng/ml或更高；1,200ng/ml或更高；1,500ng/ml或更高；2,000ng/ml或更高；5,000ng/ml或更高；7,000ng/ml或更高；10,000ng/ml或更高；或15,000ng/ml或更高的一種或多種生長因子處理胚胎干細胞或生殖細胞和iPSC。在一些實施方案中，在整個治療中生長因子的濃度維持在恒定水平。在其它實施方案中，生長因子的濃度在治療過程中變化。在一些實施方案中，生長因子懸浮在包括具有不同HyClone濃度的胎牛絲氨酸(FBS)的培養(yǎng)基中。本領域技術人員將理解，本文所述的方案適用于單獨或組合的任何已知的生長因子。當使用兩種或更多種生長因子時，每種生長因子的濃度可以獨立地變化。

在一些實施方案中，使用富含定形內胚層細胞的細胞群體。在一些實施方案中，定形內胚層細胞是分離的或基本純化的。在一些實施方案中，分離的或基本上純化的定形內胚層細胞以比OCT4，AFP，TM，SPARC和/或SOX7標志物更大的程度表達SOX17，F(xiàn)OXA2和/或CXRC4標志物。

也涵蓋了用定形內胚層富集細胞群體的方法。在一些實施方案中，可以如下從混合的細胞群體分離或基本上純化定形內胚層細胞：使細胞與結合存在于定形內胚層細胞表面上但不存在于混合細胞群體中的其它細胞表面上的分子的試劑接觸，然后分離與試劑結合的細胞。在某些實施方案中，存在于定形內胚層細胞表面上的細胞成分是CXCR4。

本發(fā)明的其它實施方案涉及CXCR4抗體，SDF-1配體或CXCR4的其它配體可用于獲得富集，分離或基本純化形式的定形內胚層細胞。例如，CXCR4抗體，SDF-1配體或CXCR4的另一種配體可以在諸如基于親和力的分離或基于磁性的分離的方法中用作試劑，以富集，分離或基本上純化結合試劑的定形內胚層的制備物。

在一些實施方案中，用一種或多種生長因子處理定形內胚層細胞和hESC。此類生長因子可以包括來自TGF-β超家族的生長因子。在此類實施方案中，一種或多種生長因子包含TGF-β生長因子超家族的Nodal/激活蛋白和/或BMP亞組。在一些實施方案中，所述一種或多種生長因子選自Nodal，激活蛋白A，激活蛋白B，BMP4，Wnt3a或任何這些生長因子的組合。

用于獲得或創(chuàng)建可用于本發(fā)明的DE細胞的其它方法包括但不限于描述于D'Amour等人的美國專利號7,510,876；Fisk等人的美國專利號7,326,572；Kubol et al.,2004,“Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture,”Development 131:1651-1662；D'Amour et al.,2005,“Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm,”Nature Biotechnology 23:1534-1541；and Ang et al.,1993,“The formation and maintenance of the definitive endoderm lineage in the小鼠:involvement of HNF3/forkhead proteins,”Development 119:1301-1315；其各自通過引用整體并入本文。

后化DE(posteriorized DE)的定向分化

在一些實施方案中，激活蛋白誘導的定形內胚層(DE)可進一步經歷FGF/Wnt/頭蛋白誘導的前內胚層模式化，前腸特化和形態(tài)發(fā)生，以及最后前胃培養(yǎng)系統(tǒng)，以促進胃組織生長，形態(tài)發(fā)生和細胞分化成功能性胃細胞類型，包括表面粘液細胞，粘液腺細胞，內分泌和祖細胞。在一些實施方案中，人PSC被有效地導向在體外分化成包括粘液，內分泌和祖細胞類型的胃上皮。應當理解，諸如生長因子等分子可以添加到發(fā)育的任何階段以促進特定類型的胃組織形成。

在一些實施方案中，DE的前化(anteriorized)內胚層細胞進一步發(fā)育成一種或多種特化的細胞類型。

在一些實施方案中，可溶性FGF和Wnt配體和BMP拮抗劑用于模擬培養(yǎng)物中的早期前腸規(guī)定，以通過定向分化將從iPSC或ESC發(fā)育的DE轉化成前腸上皮，其有效地產生所有主要胃竇胃細胞類型。在人類中，通過選擇性激活對胃發(fā)育重要的某些信號傳導途徑來實現(xiàn)DE的定向分化。

人胃/胃發(fā)育在體外發(fā)生在近似胎兒腸發(fā)育的階段；內胚層形成，前內胚層模式化，前腸形態(tài)發(fā)生，胎兒胃，竇和胃底發(fā)育，上皮形態(tài)發(fā)生，推定的祖先域的形成和分化為胃的功能性細胞類型。

本領域技術人員應當理解，根據本發(fā)明改變任何Wnt信號傳導蛋白與任何FGF配體的組合的表達可以產生定向分化。在一些實施方案中，所述改變是Wnt3，特別是Wnt3a的過表達。在一些實施方案中，所述改變是Wnt1或其它Wnt配體的過表達。

本領域技術人員應當理解，根據本發(fā)明，改變Wnt信號傳導途徑的信號傳導活性與改變FGF信號傳導途徑的信號傳導活性相組合可以產生定向分化。在一些實施方案中，所述改變是通過使用激活上述途徑的小分子調節(jié)劑。例如，Wnt途徑的小分子調節(jié)劑包括但不限于氯化鋰；2-氨基-4,6-二取代的嘧啶(雜)芳基嘧啶；IQ1；QS11；NSC668036；DCAβ-連環(huán)蛋白；2-氨基-4-[3,4-(亞甲基二氧基)-芐基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶。

在可選的實施方案中，可以抑制與Wnt和/或FGF信號傳導途徑相關的細胞成分，例如，途徑的天然抑制劑或拮抗劑，導致Wnt和/或FGF信號傳導途徑的激活。

在一些實施方案中，細胞成分被其它細胞成分或外在分子抑制。Wnt信號傳導的示例性天然抑制劑包括但不限于Dkk1，SFRP蛋白和FrzB。在一些實施方案中，外在分子可以包括但不限于小分子，例如WAY-316606；SB-216763；或BIO(6-溴靛玉紅-3'-肟(6-bromoindirubin-3′-oxime))。

更多細節(jié)參見例如Liu et al.,“A small-molecule agonist of the Wnt signaling pathway,”Angew Chem Int Ed Engl.44(13):1987-1990(2005)；Miyabayashi et al.,“Wnt/beta-catenin/CBP signaling maintains long-term murine embryonic stem cell pluripotency,”Proc Natl Acad Sci USA.104(13):5668-5673(2007)；Zhang et al.,“Small-molecule synergist of the Wnt/beta-catenin signaling pathway,”Proc Natl Acad Sci U S A.104(18):7444-7448(2007)；Neiiendam et al.,“An NCAM-derived FGF-receptor agonist,the FGL-peptide,induces neurite outgrowth and neuronal survival in primary rat neurons,”J.Neurochem.91(4):920-935(2004)；Shan et al.,“Identification of a specific inhibitor of the dishevelled PDZ domain,”Biochemistry 44(47):15495-15503(2005)；Coghlan et al.,“Selective small molecule inhibitors of glycogen synthase kinase-3 modulate glycogen metabolism and gene transcription,”Chem.Biol.7(10):793-803(2000)；Coghlan et al.,“Selective small molecule inhibitors of glycogen synthase kinase-3 modulate glycogen metabolism and gene transcription,”Chemistry&Biology 7(10):793-803；和Pai et al.,“Deoxycholic acid activates beta-catenin signaling pathway and increases colon cell cancer growth and invasiveness,”Mol Biol Cell.15(5):2156-2163(2004)；每篇通過引用整體并入本文。

在一些實施方案中，使用靶向與Wnt和/或FGF信號傳導途徑相關的細胞成分的siRNA和/或shRNA來激活這些途徑。本領域技術人員應當理解，靶細胞組分可以包括但不限于SFRP蛋白；GSK3，Dkk1和FrzB。

關于基于RNAi的技術的更多細節(jié)可以參見例如Couzin,2002,Science 298:2296-2297；McManus et al.,2002,Nat.Rev.Genet.3,737-747；Hannon,G.J.,2002,Nature 418,244-251；Paddison et al.,2002,Cancer Cell 2,17-23；Elbashir et al.,2001.EMBO J.20:6877-6888；Tuschl et al.,1999,Genes Dev.13:3191-3197；Hutvagner et al.,Sciencexpress 297:2056-2060；每篇通過引用整體并入本文。

成纖維細胞生長因子(FGF)是涉及血管生成，傷口愈合和胚胎發(fā)育的生長因子家族。FGF是肝素結合蛋白，并且已經顯示與細胞表面相關的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用對于FGF信號轉導是必需的。FGF是極其多種細胞和組織的增殖和分化過程中的關鍵參與者。在人類中，已鑒定了FGF家族的22個成員，所有這些都是結構相關的信號傳導分子。成員FGF1至FGF10都結合成纖維細胞生長因子受體(FGFR)。FGF1也稱為酸性，并且FGF2也稱為堿性成纖維細胞生長因子。成員FGF11，F(xiàn)GF12，F(xiàn)GF13和FGF14，也稱為FGF同源因子1-4(FHF1-FHF4)，已顯示與FGF相比具有獨特的功能差異。雖然這些因子具有顯著相似的序列同源性，但它們不結合FGFR并且參與與FGF無關的胞內過程。該組也稱為“iFGF”。成員FGF16至FGF23是較新的，并且沒有被良好表征。FGF15是人FGF19的小鼠直向同源物(因此不存在人FGF15)。人FGF20基于其與蟾蜍(Xenopus)FGF-20(XFGF-20)的同源性鑒定。與其它FGF的局部活性相反，F(xiàn)GF15/FGF19，F(xiàn)GF21和FGF23具有更多的全身作用。

在一些實施方案中，本領域技術人員將理解，任何FGF可以與來自Wnt信號傳導途徑的蛋白質聯(lián)合使用。在一些實施方案中，可溶性FGF可包括但不限于FGF4，F(xiàn)GF2和FGF3。

在一些實施方案中，F(xiàn)GF信號傳導途徑的細胞組分受其它細胞成分或外在分子抑制。FGF信號傳導的示例性天然抑制劑可以包括但不限于Sprouty蛋白家族和Spred蛋白家族。如上所討論，蛋白質，小分子，核酸可用于激活FGF信號傳導途徑。

本領域技術人員將理解，通過實例提供了本文所述的與Wnt和FGF信號傳導途徑有關的方法和組合物。類似的方法和組合物適用于本文中公開的其它信號傳導途徑。

在一些實施方案中，可用本文所述的信號傳導途徑的一個或多個分子處理DE培養(yǎng)物達6小時以上；12小時以上；18小時以上；24小時以上；36小時以上；48小時以上；60小時以上；72小時以上；84小時以上；96小時以上；120小時以上；150小時以上；180小時以上；200小時或更多小時，240小時或更多小時；270小時以上；300小時以上；350小時以上；400小時以上；500小時以上；600小時以上；700小時以上；800小時以上；900小時以上；1,000小時以上；1,200小時以上；或1,500小時以上。

在一些實施方案中，以10ng/ml或更高；20ng/ml或更高；50ng/ml或更高；75ng/ml或更高；100ng/ml或更高；120ng/ml或更高；150ng/ml或更高；200ng/ml或更高；500ng/ml或更高；1,000ng/ml或更高；1,200ng/ml或更高；1,500ng/ml或更高；2,000ng/ml或更高；5,000ng/ml或更高；7,000ng/ml或更高；10,000ng/ml或更高；或15,000ng/ml或更高的濃度用本文所述的一種或多種信號傳導途徑分子處理DE培養(yǎng)物。在一些實施方案中，信號傳導分子的濃度在整個治療中保持恒定。在其它實施方案中，信號傳導途徑分子的濃度在治療過程中變化。在一些實施方案中，將根據本發(fā)明的信號傳導分子懸浮在包含DMEM和胎牛絲氨酸(FBS)的培養(yǎng)基中。FBS可以為2％以上；5％以上；10％以上；15％以上；20％以上；30％以上；或50％以上的濃度。本領域技術人員應當理解，本文所述的方案可單獨或組合地應用于本文所述的信號傳導途徑的任何已知分子，包括但不限于Wnt和FGF信號傳導途徑中的任何分子。

在兩種或更多的信號分子用于處理DE培養(yǎng)物的實施方案中，可以同時或分別添加信號傳導分子。當使用兩種或更多種分子時，每種分子的濃度可以獨立地變化。

PSC分化成DE培養(yǎng)物并隨后分化成各種中間成熟胃細胞類型可以通過階段特異性細胞標志物的存在來確定。在一些實施方案中，代表性細胞成分的表達用于測定DE形成。代表性的細胞成分可包括但不限于，CMKOR1，CXCR4，GPR37，RTN4RL1，SLC5A9，SLC40A1，TRPA1，AGPAT3，APOA2，C20orf56，C21orf129，CALCR，CCL2，CER1，CMKOR1，CRIP1，CXCR4，CXorf1，DIO3，DIO30S，EB-1，EHHADH，ELOVL2，EPSTI1，F(xiàn)GF17，F(xiàn)LJ10970，F(xiàn)LJ21195，F(xiàn)LJ22471，F(xiàn)LJ23514，F(xiàn)OXA2，F(xiàn)OXQ1，GATA4，GPR37，GSC，LOC283537，MYL7，NPPB，NTN4，PRSS2，RTN4RL1，SEMA3E，SIAT8D，SLC5A9，SLC40A1，SOX17，SPOCK3，TMOD1，TRPA1，TTN，AW166727，AI821586，BF941609，AI916532，BC034407，N63706和AW772192。

適合于檢測DE形成的另外的細胞組分可以參見例如2005年6月23日提交的美國專利申請流水號11/165,305；2005年12月22日提交的美國專利申請流水號11/317,387；2004年12月23日提交的美國專利申請流水號11/021,618；2005年4月26日提交的美國專利申請流水號11/021,618,11/115,868；2005年12月22日提交的美國專利申請流水號11/317,387；2006年6月23日提交的美國專利申請流水號11/474,211；2005年6月23日提交的美國專利申請流水號11/165,305；2008年8月29日提交的美國專利申請流水號11/587,735；2008年2月28日提交的美國專利申請流水號12/039,701；2009年3月30日提交的美國專利申請流水號12/414,482；2009年6月2日提交的美國專利申請流水號12/476,570；2008年7月21日提交的美國專利申請流水號12/093,590；2009年10月20日提交的美國專利申請流水號12/582,600；其各自通過引用整體并入本文。

在一些實施方案中，使用SOX2的表達揭示在DE已經與FGF4和Wnt3a加頭蛋白溫育一段時間，例如12小時以上；18小時以上；24小時以上；36小時以上；48小時以上；60小時以上；或90小時以上后的前腸形成傾向。在一些實施方案中，需要較長的溫育期以實現(xiàn)穩(wěn)定前內胚層表型，如通過長期表達CDX2測量。在此類實施方案中，溫育時段可以是60小時以上；72小時以上；84小時以上；96小時以上；108小時或更長；120小時以上；140小時以上；160小時以上；180小時以上；200小時以上；240小時或更長；或300小時以上。

或者，在一些實施方案中，細胞組分(如后腸標志物例如CDX2)的不存在可用于揭示定向前腸形成。在一些實施方案中，胃轉錄因子PDX1，KLF5和SOX9可用于代表胃發(fā)育。在一些實施方案中，GATA4和/或GATA6蛋白表達可用于代表胃發(fā)育。在這些實施方案中，溫育時段可以持續(xù)12小時以上；18小時以上；24小時以上；36小時以上；48小時以上；60小時以上；或90小時以上。或者，溫育時段可以持續(xù)60小時以上；72小時以上；84小時以上；96小時以上；108小時以上；120小時以上；140小時以上；160小時或更長；180小時以上；200小時以上；240小時以上；或300小時以上。

在一些實施方案中，通過使用靶向相關信號傳導途徑中的分子的一抗和/或二抗的免疫組織化學測定細胞組分的豐度數(shù)據，例如蛋白質和/或基因表達水平。在其它實施方案中，通過微陣列分析測定細胞組分的豐度數(shù)據，例如蛋白質和/或基因表達水平。

或者，形態(tài)學變化可用于表示定向分化的進展。在一些實施方案中，前腸球體可以進一步經受用于進一步成熟的3維培養(yǎng)條件。此外，可以在6天以上；7天以上；9天以上；10天以上；12天以上；15天以上；20天以上；25天以上；28天以上；32天以上；36天以上；40天以上；45天以上；50天以上；或60天以上中觀察胃類器官。

多能干細胞的定向分化

在一些實施方案中，通過“一步”方法將多能干細胞轉化為胃細胞類型。例如，可以將多能干細胞分化為DE培養(yǎng)物的一種或多種分子(例如，激活蛋白A)與可以促進DE培養(yǎng)物的定向分化的另外的分子(例如Wnt3a/FGF4激活劑和BMP抑制劑)組合，以直接處理多能干細胞。

效用和試劑盒實施方案

在一些實施方案中，本文所述的胃組織或相關細胞類型可用于對藥物篩選胃攝取和/或運輸機制和/或幽門螺桿菌的治療。例如，這可以以高通量方式進行，以篩選最容易吸收或有效的藥物，并且可以增加為了研究藥物胃吸收和胃毒性進行的1期臨床試驗。這可以包括小分子，肽，代謝物，鹽的胞周和胞內轉運機制。本文中公開的胃組織可以進一步用于評估與旨在與胃組織接觸以評價生物相容性的任何藥劑和/或裝置的相容性。

在一些實施方案中，本文所述的胃細胞，胃組織和/或胃hGO可用于鑒定正常人胃發(fā)育的分子基礎。

在一些實施方案中，本文所述的胃細胞，胃組織和/或胃hGO可用于鑒定影響人胃發(fā)育的先天缺陷的分子基礎。

在一些實施方案中，本文所述的胃細胞，胃組織和/或胃hGO可用于校正由遺傳突變引起的先天性胃遺傳缺陷。特別地，影響人胃發(fā)育的突變可以使用本文所述的iPSC技術和遺傳正常的胃組織或相關細胞類型來校正。在一些實施方案中，本文所述的胃組織或相關細胞類型可用于產生替換組織。遺傳性疾病的實例包括但不限于Neurog3突變和腸道內分泌腺病，PTF1a突變和新生兒糖尿病，實現(xiàn)胃的腸內分泌細胞的PDX1突變。

在一些實施方案中，本文所述的胃細胞，胃組織和/或胃hGO可用于產生用于疾病或病癥(如消化性潰瘍病，梅內特里耶病(Ménétrier's disease))或胃癌患者的替換胃組織。

在一些實施方案中，本文所述的胃細胞，胃組織和/或胃hGO可用于研究與人宿主上皮和宿主免疫的微生物相互作用。

在一些實施方案中，本文所述的胃組織或相關細胞類型，特別是腸內分泌細胞可用于研究由胃內分泌介導的攝食行為，代謝的激素調節(jié)。

在一些實施方案中，本文所述的胃細胞，胃組織和/或胃hGO，特別是產生激素胃泌素或生長素釋放肽的腸內分泌細胞，可用于研究和改善例如具有肥胖，代謝綜合征或2型糖尿病的患者中的代謝控制。

在一些實施方案中，本文所述的胃細胞，胃組織和/或胃hGO可用于代替有需要的受試者中的任何損傷或移除的胃組織。

在一些實施方案中，本文所述的胃細胞，胃組織和/或胃hGO可用于篩選作用于胃組織的任何藥物的毒性和功效。

在其中本文所述的胃細胞，胃組織和/或胃hGO用于測定化合物的吸收水平的一些實施方案中，化合物將與胃細胞，胃組織和/或胃hGO接觸；并且可以量化由胃細胞，胃組織和/或胃hGO對化合物的吸收水平。在一些實施方案中，化合物可以用放射性同位素，熒光標記物和/或初級或次級可見標志物標記。

在一些實施方案中，開發(fā)診斷試劑盒或包裝以包括本文所述并且基于一種或多種上述效用的胃細胞，胃組織和/或胃hGO。

已經詳細描述了本發(fā)明，顯而易見的是，在不脫離所附權利要求書中限定的本發(fā)明的范圍的情況下，修改，變化和等同實施方案是可能的。此外，應當理解，本公開中的所有示例都作為非限制性示例提供。

實施例

提供以下非限制性實施例以進一步說明本文公開的本發(fā)明的實施方案。本領域技術人員應當理解，以下實施例中公開的技術代表已經發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實踐中良好地起作用的方法，因此可以被認為構成其實踐的模式的實例。然而，根據本公開內容，本領域技術人員應當理解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對所公開的具體實施方案進行許多改變，并且仍然獲得相同或相似的結果。

多能干細胞培養(yǎng)物

從WiCell獲得人胚胎干細胞系WA01(H1)和WA09(H9)。ESC和iPSC系在無滋養(yǎng)層條件下在mTesR1培養(yǎng)基(Stem Cell Technologies)中的HESC量化基質膠(BD Biosciences)上維持為集落。每四天用分散酶(Invitrogen)常規(guī)傳代細胞。

DE誘導。

(圖14中總結)在經基質膠(BD Biosciences)包被的24孔板中以每孔150,000個細胞將人ES和iPS細胞作為單細胞鋪在加有ROCK抑制劑Y27632(10μM；Stemgent)的mTesR1培養(yǎng)基中。ROCK抑制劑在用于分化的鋪板后增強干細胞的存活。從第二天開始，在含有漸增濃度的0％，0.2％和2.0％的限定胎牛血清(dFBS；Invitrogen)的RPMI 1640(Invitrogen)中用激活蛋白A(100ng ml-1；Cell Guidance Systems)處理細胞三天。

定形內胚層(DE)的分化

為了分化，使用accutase(Stem Cell Technologies)，在具有ROCK抑制劑Y-27632(10μM；Stemgent)的mTesR1中以150,000個細胞/孔的密度將PSC作為單細胞鋪板在基質膠包被的24孔板。次日，如前所述^11,35，將PSC分化為DE。在RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen)中將細胞暴露于激活蛋白A(100ng ml-1；Cell Guidance Systems)三天，所述培養(yǎng)基含有漸增濃度的0％0.2％和2.0％限定胎牛血清(dFBS；Invitrogen)。此外，在DE誘導的第一天添加BMP4(50ngml-1；R&D Systems)。

內胚層模式化和腸管形態(tài)發(fā)生。

在DE誘導后，在具有2.0％dFBS的RPMI 1640中用生長因子/拮抗劑處理細胞三天。為了產生后部前腸球體，用頭蛋白(200ng ml-1；R&D Systems)，F(xiàn)GF4(500ng ml-1；R&D Systems)和WNT3A(500ng ml-1；R&D Systems)或CHIR99021(2μM；Stemgent)處理DE三天。CHIR99021是刺激Wnt信號傳導途徑的小分子。在最后一天添加RA(2μM；Sigma Aldrich)。三維生長和竇特化。如前所述^10,12，將后部前腸球體包埋入的基質膠(BD Biosciences)中，隨后在補充有N2(Invitrogen)，B27(Invitrogen)，L-谷氨酰胺，10μM HEPES，青霉素/鏈霉素，和EGF(100ng ml-1；R&D Systems)的Advanced DMEM/F12(Invitrogen)中培養(yǎng)。對于竇特化，在三維生長的前三天添加RA和頭蛋白。對于內分泌細胞特化，在第30天將EGF濃度降低至10ng ml^-1。

內胚層模式化和前腸球體產生

DE誘導后，將細胞在含有2.0％dFBS和生長因子：WNT3A(500ng ml-1；R&D Systems)，CHIR99021(2μM；Stemgent)；FGF4(500ng ml-1；R&D Systems)和頭蛋白(200ng ml-1；R&D Systems)的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每天更換培養(yǎng)基。三天后，WNT3A(或CHIR99021)，F(xiàn)GF4和頭蛋白的組合在培養(yǎng)孔中導致浮動的前腸球體。為了前化前腸內胚層，在WNT/FGF/頭蛋白處理的第三天加入RA(2μM；Sigma Aldrich)。

胃類器官的三維培養(yǎng)

將球體轉移到三維體外培養(yǎng)系統(tǒng)，如先前所述的5，10，12。簡言之，收集球體，重懸于50μl基質膠(BD Biosciences)中，并鋪板在三維液滴中。在允許基質膠在組織培養(yǎng)溫育箱中固化10-15分鐘后，用腸培養(yǎng)基覆蓋球形體：具有N2(Invitrogen)，B27(Invitrogen)，L-谷氨酰胺，10μM HEPES，青霉素/鏈霉素，和EGF(100ng ml-1；R&D Systems)的Advanced DMEM/F12。對于前三天，將RA和頭蛋白加入到腸培養(yǎng)基中。在必要時，每3-4天更換培養(yǎng)基。在第20天，收集類器官，并在約1:12的稀釋度的新鮮基質膠中重新鋪板。

dox誘導型hNEUROG3hESC系的產生

為了產生過表達構建體，使用Gateway Cloning(Invitrogen)方法將hNEUROG3 cDNA(Dana-Farber/Harvard Cancer Center DNA Resource Core；克隆HsCD00345898)克隆到pInducer20慢病毒載體(來自T.Westbrook36的贈品)中。高滴度慢病毒顆粒由CCHMC Viral Vector Core產生。將H1hESC用Accutase解離，作為單細胞懸液在具有10μMY-27632的mTesR1中鋪板，并暴露于慢病毒4小時。每天更換mTesR1，兩天后，向培養(yǎng)基中加入G418(200μg ml-1)以選擇整合的克隆。G418抗性細胞無限期地保持在抗生素中，但是以其它方式培養(yǎng)并正常傳代。

iPSC系的產生和表征

原代人包皮成纖維細胞(HFF)從新生兒人包皮組織培養(yǎng)并通過辛迪納大學皮膚病學系(Department of Dermatology,University of Cincinnati)從2個供體獲得，并且是來自Susanne Wells博士的贈品。將HFF在由補充有10％FCS(Hyclone)的DMEM(Invitrogen)組成的成纖維細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并用于在第5代和第8代之間重編程。先前描述了用于此研究的基于EBNA1/OriP的附加型質粒pCLXE-hOct3/4-shp53，pCLXE-hSox2-Klf4，pCLXE-hLmyc-Lin28，和pCLXE-GFP³⁷，并從Addgene(分別為ID#：27077，27078，27080和27082)獲得。優(yōu)化的人真皮成纖維細胞Nucleofector試劑盒(VPD-1001；Lonza)用于用附加體質粒轉染HFF。簡言之，對于每次轉染，通過在室溫下以200×g離心10分鐘使1×10 6個HFF沉淀，重懸于100μl室溫Nucleofector溶液中，并用1.25μg每種附加體質粒(程序U20)核轉染。將來自2次轉染(2x10 6總細胞)的細胞在成纖維細胞培養(yǎng)基中的10cm組織培養(yǎng)板中重新鋪板，并在37℃/5％CO2下培養(yǎng)。轉染后6天，將4.5×10 5個HFF在成纖維細胞培養(yǎng)基中在明膠包被的含有1.07x10⁶個照射的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的10cm皿中重新鋪板。從轉染后第7天開始，每天用補充有20％敲除血清替換，1mM L-谷氨酰胺，0.1mMβ-巰基乙醇，0.1mM非必需氨基酸和4ng ml-1堿性FGF(均來自Invitrogen)的DMEM/F12培養(yǎng)基中喂養(yǎng)細胞。大約2周后，手動切出具有hESC樣形態(tài)的離散集落，并在用hESC量化的基質膠(Becton Dickinson)包被的組織培養(yǎng)皿中在mTeSR1培養(yǎng)基(Stem Cell Technologies)中重新鋪板。在適應于mTeSR1/基質膠培養(yǎng)后，擴增保持強力增殖和具有最小自發(fā)分化的hESC樣形態(tài)的iPSC，用于冷凍保存和表征。

通過CCHMC細胞遺傳學實驗室測定標準中期擴展和G帶化核型。對于畸胎瘤形成，將來自6孔皿的3個孔的iPSC組合，并輕輕地重懸浮于冰冷的DMEM/F12中。在即將注射之前，加入基質膠至終濃度約33％，并將細胞皮下注射到免疫受損的NOD/SCID GAMMA C-/-小鼠中。腫瘤在6-12周內形成。固定切出的畸胎瘤，包埋在石蠟中，用蘇木精和曙紅染色切片用于組織學檢查。

用于胃類器官的示例性方案

下表說明了用于從前體細胞形成胃類器官的示例性處理方案。**基礎腸培養(yǎng)基＝Advanced DMEM/F12+B27+N2+1-谷氨酰胺+HEPES；mTesR1可獲自StemCell Technologies。

胃底特化方案

申請人首先尋求在胚胎階段鑒定在胃底中但不在竇中特異性表達的基因。顯微切割E14.5小鼠胚胎的消化道，并分成四個區(qū)域：前胃(包括食管)，胃底，竇和十二指腸。參見圖15。然后，通過qPCR對這些區(qū)域分析區(qū)域化的標志物。圖15顯示了已知在不同區(qū)域中表達的對照基因的表達。可以通過Sox2和Gata4的其高表達，以及不存在P63和Cdx2，將胃底和竇與前胃和十二指腸區(qū)分開。重要的是，Pdx1(竇的標志物)以在竇組織中比在胃底中高得多的水平表示，表明準確的解剖。

使用來自胚胎小鼠內胚層和成年人胃組織的公開的微陣列數(shù)據集的生物信息學分析來產生可以優(yōu)先在胃底而不是竇中表達的候選基因的列表。通過qPCR檢測這些推定的標志物在E14.5小鼠節(jié)段中的表達。Irx1，Irx2，Irx3，Irx5和Pitx1確實在胃底中比在竇中以更高的水平表達。因此，這些標志物可以用作hPSC衍生的前腸培養(yǎng)物中的胃底特化的指標。參見圖16。

接下來，測試Wnt信號傳導在胃類器官分化方案的6-9天的胃底-竇模式化的調節(jié)中的功能。添加Wnt3a(在100ng/mL和500ng/mL)對球體基因表達沒有影響，但它也的確誘導Wnt靶基因Axin2的表達。因此，測試了小分子CHIR99021(CHIR；2uM)的作用。CHIR99021以受體非依賴性方式刺激Wnt信號傳導。暴露于CHIR導致Pdx1表達水平的強力抑制，與胃底特化一致。CHIR不誘導腸標志物Cdx2的表達。參見圖17。圖18顯示，與Pdx1的阻抑一致，暴露于CHIR誘導了胃底特異性標志物IRX3和IRX5的高水平表達。

幽門螺桿菌感染

在由Columbia Agar Base(Fisher Scientific)，5％馬血液(Colorado Serum Company)，5μg ml-1，萬古霉素和10μgml-1甲氧芐啶組成的血液瓊脂板上培養(yǎng)幽門螺桿菌菌株G2738和缺少CagA(ΔCagA)39的突變體G27菌株，如先前描述⁴⁰。對于類組織注射，將幽門螺桿菌以1x10 9細菌ml-1的濃度重懸于布魯氏肉湯(brucella broth)中，并裝載到Nanoject II(Drummond)微量注射器裝置上。將大約200nl(含有2x10 5個細菌)直接注射到每種類器官的內腔中，并將注射的類器官培養(yǎng)24小時。注射布魯氏菌肉湯作為陰性對照。

材料和方法

免疫熒光染色

將所有組織在4％多聚甲醛中在室溫下固定1小時用于冷凍處理或在4℃下過夜用于石蠟處理。對于冷凍切片，將組織在30％蔗糖中在4℃下保護過夜，然后包埋在OCT(Tissue-Tek)中，并切成10μm。對于石蠟切片，通過分級乙醇系列，然后二甲苯處理組織，然后包埋在石蠟中并在7μm處切割。將組織培養(yǎng)細胞在室溫下固定15分鐘并直接染色。為了染色，將凍結的載玻片解凍至室溫并在PBS中再水合，而石蠟載玻片脫蠟并進行抗原修復。將載玻片在室溫下在含有0.5％Triton-X的PBS中的5％正常驢血清(Jackson Immuno Research)中封閉30分鐘。將一抗(在方法表1中列出)在封閉緩沖液中稀釋，并在4℃溫育過夜。將載玻片在PBS中洗滌，并在室溫下與二抗溫育1小時，并使用Fluoromount-G(Southern Biotech)安裝蓋玻片。在Nikon A1Rsi倒置共焦顯微鏡上捕獲共焦圖像。

RNA分離和qPCR

使用Nucleospin RNA II試劑盒(Machery-Nagel)從組織中分離總RNA。使用Superscript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)根據制造商的方案從100ng RNA進行逆轉錄。使用Quantitect SybrGreen Master Mix(Qiagen)在CFX-96實時PCR檢測系統(tǒng)(BioRad)上進行qPCR。使用ΔΔCT方法進行分析。使用來自qPrimerDepot(http://primerdepot.nci.nih.gov)的序列設計PCR引物，并列于表2中。

免疫沉淀和Western印跡分析

在冰冷的PBS中從基質膠收獲幽門螺桿菌感染的類器官，并在150g下離心5分鐘。將組織在補充有蛋白酶抑制劑(Roche)的M-PER哺乳動物蛋白提取試劑(Thermo Scientific)中裂解。來自細胞裂解物的10μg總蛋白用抗c-Met抗體(2μg；Cell Signaling 4560)在4℃下免疫沉淀16小時。然后加入蛋白A/G瓊脂糖珠(20μl；Santa Cruz Biotechnology)，將樣品在4℃下溫育16小時。將免疫沉淀物在PBS中洗滌3次，然后重懸于含有β-巰基乙醇(40μl；BioRad)的Laemmli上樣緩沖液中。樣品在4-20％Tris-甘氨酸梯度凝膠(Invitrogen)上運行并在80V下運行3.5小時。將凝膠在105V下轉移到硝酸纖維素膜(Whatman Protran，0.45μm)上1.5小時。將膜在KPL檢測器封閉溶液(Kirkeaard&Perry Laboratories)中在室溫下封閉1小時，然后在4℃與一抗溫育過夜。使用的一抗：抗磷酸酪氨酸(Santa Cruz，sc-7020；1:100)，抗c-Met(Abcam，ab59884；1:100)和抗幽門螺桿菌CagA(Abcam，ab90490；1:100)。將膜洗滌并在Alexa Fluor抗小鼠680(Invitrogen；1:100)二抗中溫育。使用Odyssey紅外成像軟件系統(tǒng)(Licor)對印跡進行成像。

討論

將hPSC分化成定形內胚層(DE)¹¹，其在體內產生胃腸道和呼吸道的上皮。所有內胚層器官的發(fā)育中的下兩個基本事件是沿著前部-至-后部(A-P)軸和腸管形態(tài)發(fā)生的DE模式化，導致在前部中的Sox2+前腸和在后部中的Cdx2+中-后腸的形成(如在E8.5,14體節(jié)階段小鼠胚胎中突出顯示的，圖1A)。這種形態(tài)發(fā)生和內胚層和中胚層之間的組織相互作用似乎對于體內和體外二者的正確器官發(fā)生是關鍵的。WNT3A和FGF4先前已經證明協(xié)同作用做三件事：后化hPSC衍生的DE，促進間質的擴張，并且誘導表達中后腸標志物CDX2的腸管樣結構的組裝^10,12。圖1A顯示Sox2蛋白標記前腸內胚層，并且Cdx2蛋白標記e8.5(14體節(jié)期)小鼠胚胎中的中/后腸內胚層。圖1B顯示抑制BMP抑制中/后腸的命運并促進前腸標志物SOX2的表達。在單獨(對照)或具有指定的生長因子/拮抗劑的培養(yǎng)基中暴露于三天的hPSC-DE培養(yǎng)物中的模式化標志物的PCR分析。如先前報道的¹⁰，WNT和FGF的組合活性誘導CDX2表達，而BMP拮抗劑頭蛋白抑制CDX2表達，并且足以誘導高水平的前腸標志物SOX2。*，與對照相比p<0.05。**，與WNT/FGF相比p<0.005。圖1C描述了與單獨用Wnt和FGF產生的具有高水平CDX2的球體相比，根據整裝免疫熒光染色和mRNA，用Wnt/FGF/頭蛋白產生的前腸球體具有高水平的SOX2蛋白。*，p<1.0×10-6。圖1D描述了e8.5，14-體細胞階段小鼠胚胎中的后部前腸產生胃和胰腺并且具有高水平的Hnf1β蛋白。圖1E描述了在球體產生步驟的最后一天將培養(yǎng)物暴露于RA誘導在SOX2表達上皮中HNF1β的表達，導致后部前腸球體的形成。*，p<0.005。圖1F描繪了總結在前部和后部前腸內胚層兩者的形成中頭蛋白和RA的模式化效應的譜系圖。比例尺，100μm。誤差棒表示標偏差。

表1：一抗。

表2：qPCR引物序列

為了促進hPSC衍生的DE中前腸結構的形成，申請人試圖分離WNT/FGF刺激腸管形態(tài)發(fā)生的能力與其在促進后部內胚層命運中的作用?；趤碜园l(fā)育模型生物的體內研究^13,14，測試BMP信號傳導在調節(jié)A-P模式化中的功能，申請人確定WNT/FGF需要BMP活性來啟動后腸程序。具體地，即使在存在WNT/FGF的情況下，用拮抗劑頭蛋白抑制BMP信號傳導抑制CDX2并在三天后在DE培養(yǎng)物中誘導前腸標志物SOX2(圖1B-C和圖5)。重要的是，對BMP信號傳導的抑制對WNT/FGF促進間質擴展和腸管結構的裝配的能力沒有影響，因此導致SOX2⁺前腸球體的形成。

圖5顯示與WNT和FGF的激活平行地需要BMP信號傳導以促進后部命運。圖5A顯示GSK3β抑制劑CHIR99021(CHIR；2μM)誘導與重組WNT3A相同的后化作用，并且這些可以被BMP抑制阻斷。圖5B顯示CHIR誘導的腸管形態(tài)發(fā)生和球體產生以與WNT3A類似的方式發(fā)生。圖5C描繪了單層培養(yǎng)物的免疫熒光染色，其證實了在CHIR/FGF處理的內胚層中的CDX2誘導和頭蛋白和CHIR/FGF/頭蛋白處理的內胚層中的SOX2誘導的高效率。圖5D顯示BMP靶基因MSX1/2的qPCR分析，其指示BMP活性不響應于Wnt/FGF而增加，但是靶基因響應頭蛋白而抑制，表明存在內源性BMP信號傳導。圖5E顯示加入BMP2(100ng mL-1)不代替或提升Wnt/FGF使內胚層后化的能力。這些數(shù)據指示Wnt/FGF的后化作用不是由BMP信號傳導的上調介導的，但是確實需要內源性BMP活性。比例尺，圖5B中的1mm；圖5C中的100μm。誤差棒表示標準偏差。

球體形態(tài)發(fā)生在hESC和hiPSC系二者中是強力的過程(圖6A)，并且>90％的球體細胞表達SOX2(圖1C)，指示有效規(guī)定成前腸譜系。因此，申請人已經鑒定了WNT，F(xiàn)GF和BMP之間的新的上位關系，其中所有三種途徑協(xié)作以促進中后腸命運，而WNT和FGF與BMP分開作用以驅動內胚層和中胚層組裝成腸管結構。

圖2A-2G描繪了胃類器官分化是有效的和細胞系非依賴性過程。圖2A，比較兩個hESC系(H1和H9)和一個iPSC系(72.3)之間的球體形成和特征的表。圖2B，源自H1和iPSC 72.3細胞系的第34天hGO的免疫熒光染色。iPSC衍生的類器官表現(xiàn)出與源自hESC的那些相同的形態(tài)和分子特征。圖2C。在第34天hGO中的器官上皮細胞類型定量。大于90％的上皮是竇性的，由PDX1表達和缺乏PTF1A表達指示，而小于5％表達與源自內胚層的其它器官相關的標志物，包括CDX2(腸)，白蛋白(肝)和p63(鱗狀上皮)。d-g，誘導的多能干細胞系iPSC 72.3的表征。圖2D，iPSC 72.3表現(xiàn)出與H1hESC系相比的多能干細胞集落的正常形態(tài)學特征，并且圖2E具有正常的46；XY核型。圖2F，iPSC 72.3表達多能標志物OCT3/4和NANOG，并且圖2G，通過在體內畸胎瘤測定法中分化成內胚層，中胚層和外胚層譜系來證明多能性。比例尺，100μm。誤差棒表示標準偏差。

在體內，胃的基底和竇域與胰腺，肝和十二指腸一起都源自Sox2⁺前腸內胚層的后段。為了將SOX2⁺前腸球體定向成胃譜系，申請人試圖鑒定促進后部前腸命運的信號傳導途徑。申請人聚焦于視黃酸(RA)信號傳導，鑒于其在后部前腸衍生的器官的發(fā)育中的作用。^15-17在體內，后部前腸由Hnf1β的表達標記(圖1D)。申請人鑒定了在模式化/球體生成階段(FGF4/WNT3A/頭蛋白)的最后一天(第5-6天)的24小時暴露于RA導致后部前腸標志物的強烈激活和SOX2/HNF1β⁺后部前腸球體的形成(圖1E和圖7)。因此，RA，WNT，F(xiàn)GF和BMP信號傳導途徑的精確時間和組合操作允許產生三維后部前腸球體。

圖7A-7D顯示視黃酸使前腸內胚層后化。圖7A描述了前腸模式化實驗的示意圖。DE培養(yǎng)物用Wnt(CHIR)/FGF/頭蛋白處理三天以產生Sox2陽性前腸球體，并且在模式化的第三天添加RA達24小時。圖7B描述了顯示RA增加從前腸單層培養(yǎng)物產生的球體數(shù)目的明視野圖像。圖7C描繪了圖1D的低倍圖像，顯示了具有位于前腸后部的Hnf1β蛋白的14個體節(jié)期胚胎的免疫熒光圖像。胚胎的框示區(qū)域顯示在圖1D中。圖7D顯示用RA處理的前腸球體中基因表達的qPCR分析。后部前腸標志物HNF1β和HNF6通過24小時暴露于RA而被強烈誘導。*，p<0.05。比例尺，圖7B中的1mm；圖7C中的100μm。誤差棒表示標準偏差。

將后部前腸定向為不同器官譜系的分子機制了解甚少。在發(fā)育早期，推定的器官域由不同的基因表達模式標記：Sox2⁺基底，Sox2/Pdx1⁺竇，Pdx1/Ptf1α⁺胰腺和Pdx1/Cdx2⁺十二指腸(圖2B)。申請人使用這些分子標志物來鑒定將后部前腸球體培養(yǎng)物定向為胃譜系的信號傳導途徑。在將球體轉移到三維培養(yǎng)條件后，用RA進一步處理72小時(6-9天)導致PDX1mRNA水平>100倍的增加，同時保持高SOX2表達(圖2C)。重要的是，RA處理不促進其它人⁹觀察到的胰腺命運，因為沒有誘導胰腺特異性標志物PTF1α的表達。這些數(shù)據證明RA信號傳導與三維生長的組合有效地將后部前腸球體定向成指示早期竇性命運的SOX2/PDX1⁺上皮。

圖2一般地描述了人竇胃類器官的特化和生長。誤差棒表示標準偏差。圖2A描繪了用于指導hPSC分化為三維胃類器官的體外培養(yǎng)系統(tǒng)的示意圖，圖2B描述了通過用Sox2，Pdx1和Cdx2對小鼠E10.5胚胎進行整裝疫熒光染色來限定發(fā)育中的后部前腸器官的標志物。Sox2和Pdx1的共表達是對于胃上皮的遠端部分是獨特的，推定的竇(a)，Sox2表達標記胃底(f)，Pdx1(和Ptf1a)表達標記背側(dp)和腹側(vp)胰腺，并且Pdx1/Cdx2共表達標記十二指腸(d)。圖2C顯示在RA(2μM)存在下在三維基質中培養(yǎng)三天的后部前腸球體共表達高水平的PDX1和SOX2，并且不表達胰腺標志物PTF1α，類似于發(fā)展中的竇*p<0.05。圖2D描繪了顯示后部前腸球體生長成胃類器官期間形態(tài)學變化的立體顯微照片。到四周，hGO的上皮展現(xiàn)出復雜的腺體構造，比例尺，500μm。圖2E描述了E14.5和E18.5和相當?shù)膆GO發(fā)育階段時的發(fā)育中的小鼠竇的比較。Sox2和Pdx1在小鼠竇和hGO二者中的早期假復層上皮中共表達。在后期階段，Sox2被下調，因為上皮轉變成更成熟的腺體結構。Pdx1在體內貫穿成人期和在hGO中檢查的所有階段保持在竇中，圖2E中的比例尺100μm。

申請人使用SOX2/PDX1⁺球體來鑒定促進早期胃上皮的生長和形態(tài)發(fā)生的途徑，并且發(fā)現(xiàn)高濃度的EGF(100ng mL^-1)足以促進人竇胃類器官(hGO)的強力生長。在3-4周的過程中，直徑<100μm的球體生長成直徑為2-4mm的類器官。在培養(yǎng)的后期(約第27天)，hGO上皮經歷了一系列形態(tài)發(fā)生變化，使人想起胚胎胃發(fā)育的晚期，在此期間，簡單的平坦的假復層上皮轉變成精細的，旋繞的腺上皮(圖2D)。前腸球體的初始生長依賴于EGF(數(shù)據未顯示)；此外，當在第27天從培養(yǎng)基中除去EGF時，不發(fā)生上皮擴張和形態(tài)發(fā)生成腺體(圖8)。這些結果支持已公布的發(fā)現(xiàn)，其指示EGF在促進胃粘膜的適當生長中的重要作用^19,20。

圖8顯示EGF是胃類器官中腺體形態(tài)發(fā)生所需的。明視野圖像和免疫染色證明了在hGO分化的晚期階段上皮形態(tài)發(fā)生和腺形成需要EGF。當在第27天從生長培養(yǎng)基中除去EGF時，在腺形態(tài)發(fā)生之前，hGO上皮保持了不能形成腺體的簡單的立方結構。比例尺，100μm。

hGO生長與胚胎小鼠胃發(fā)育的比較揭示了hGO發(fā)育與體內胃器官發(fā)生驚人地相似。在早期階段(小鼠中的E12-14和13天hGO)，這兩種上皮都是假復層的，并且包含集中朝向腔面的有絲分裂細胞(圖9和圖10)，指示相互動力核遷移過程(interkinetic nuclear migration process)²¹。早期hGO是適當?shù)貥O化的，并且包含由頂端標志物aPKC22的表達描繪輪廓的次級腔(secondary lumina)(圖10)。

在E16.5和產后早期階段之間，竇轉化成表現(xiàn)出由腺體和凹陷組成的高度結構化構造的簡單柱狀上皮(圖2E和圖9)。在體外13和34天之間，hGO上皮經歷類似的轉變以形成具有類似于晚期胎兒竇的腺狀結構的高柱狀上皮(圖2E)。對轉錄因子Sox2，Pdx1，Gata4和Klf5的表達的分析揭示在體內和體外伴隨這些形態(tài)發(fā)生過程的定型(stereotypic)時空表達模式(圖9)。在早期階段，這些因子都在未成熟的假復層上皮中共表達。然而，在后期階段，Sox2表達下調，因為上皮形成早期腺體和凹陷，而其它因素的表達無限期地維持?；谶@些數(shù)據，估計13天hGO代表類似于E12-14小鼠竇的發(fā)育階段，而34天hGO更相當于晚期胎兒早期產后竇。此外，推斷hGO重演正常胚胎發(fā)育，并且發(fā)生在竇發(fā)育期間的分子和形態(tài)發(fā)生過程在嚙齒類和人類之間是保守的。

圖9顯示在小鼠竇和人胃類器官發(fā)育期間轉錄因子表達的比較。分析了體內竇發(fā)育的四個胚胎期(E12.5，E14.5，E16.5和E18.5)和一個出生后階段(P12)的轉錄因子表達：Sox2，Pdx1，Gata4，Klf5和FoxF1。在體外hGO發(fā)育的兩個階段(第13天和第34天)分析相同的標志物，并且揭示類器官發(fā)育與在體內發(fā)生的事情平行。在竇發(fā)育的早期階段，上皮標志物Sox2遍在表達，但在后期階段時下調，而其它上皮轉錄因子Pdx1，Gata4和Klf5在整個發(fā)育中表現(xiàn)出持續(xù)表達。早期和晚期hGO二者都包含圍繞上皮的FoxF1陽性間質細胞。比例尺，100μm。圖10顯示早期階段人胃類器官表現(xiàn)出定型結構和核行為。在13天，hGO含有顯示由頂端標志物aPKC和基底外側標志物E-鈣粘蛋白標記的頂基部(apicobasal)極性的假復層上皮細胞，類似于E12.5小鼠竇。此外，在類器官上皮內看到襯里為頂膜的次級腔(白色箭頭)。E12.5小鼠竇和第7天hGO兩者似乎僅在細胞的頂端部分中經歷相互動力學核遷移，其由有絲分裂核，pHH3的存在指示。比例尺，50μm。

前腸球體含有類似于先前描述¹⁰的中后腸球體的間質組分。在分化為胃類器官組織期間，間質擴展并表達與竇間質發(fā)育相關的關鍵轉錄因子，包括FOXF1和BAPX1(圖10和圖11)。在后期階段，hGO間質主要由VIMENTIN⁺粘膜下成纖維細胞和較少數(shù)量的ACTA2⁺上皮下肌纖維母細胞(指示未成熟的胃間質)組成(圖11)。hGO不形成如在體內發(fā)生的平滑肌的分化層。鑒于在除了EGF之外沒有任何外源因子的情況下存在這種強力的上皮形態(tài)發(fā)生，似乎可能的是間質在上皮發(fā)育中起作用。因此，令人驚訝的是，上皮不表現(xiàn)出促進間質的強力分化。這提示其它刺激物(可能是機械的)在胃間質分化中發(fā)揮作用。

圖11顯示胃類器官中的間質分化。圖11A顯示竇間質轉錄因子BAPX1的時間表達分析。類似于其已知的胚胎表達模式，BAPX1是在hGO分化的早期階段期間上調，然后下調，與功能細胞類型標志物表達一致。圖11B顯示間質細胞類型標志物的染色揭示第34天hGO含有FOXF1/波形蛋白陽性粘膜下成纖維細胞和少量表達波形蛋白/ALPHA-SM-ACTIN(SMA)的上皮下成纖維細胞。hGO缺乏穩(wěn)定的平滑肌層，其由體內竇中的SMA/結蛋白陽性細胞表示。比例尺，100μm。誤差棒表示標準偏差。

在竇中發(fā)現(xiàn)的主要功能細胞類型是粘液細胞，其分泌作為胃上皮襯里的保護性粘液層和分泌激素以調節(jié)胃腸生理學和代謝穩(wěn)態(tài)的內分泌細胞²⁴。到第34天，hGO含有將粘液分泌到管腔中并具有與其體內對應物相同的高柱狀形態(tài)的表面粘液細胞(MUC5AC/UEAI⁺)。hGO還含有TFF2/GSII⁺竇腺細胞，指示在竇粘液譜系中的適當分化(圖3A)。此外，hGO形成由基本定位的增殖和SOX9表達區(qū)域指示的祖細胞小生境(圖4A)，盡管上皮的增殖指數(shù)是可變的并且在1-10％之間變化。因此，體外hGO含有包含祖細胞和分化細胞類型二者的生理性胃上皮。

圖4顯示人胃類器官表現(xiàn)出對幽門螺桿菌感染的急性響應。圖4A顯示第28天hGO含有以Ki67標記的增殖細胞和限制到早期腺體底部的SOX9+祖細胞，類似于晚期胚胎和出生后小鼠竇。圖4B顯示hGO用于對幽門螺桿菌感染的人特異性疾病過程建模。將細菌顯微注射到hGO的腔中，并且通過明視野顯微術(黑色箭頭)和免疫熒光染色在注射后24小時在腔中顯現(xiàn)細菌。圖4C描述了癌基因c-Met的免疫沉淀，并且證明幽門螺桿菌誘導c-Met的強力激活(酪氨酸磷酸化)，并且這是CagA依賴性過程。此外，CagA直接與人類胃上皮細胞中的c-Met相互作用。圖4D顯示在24小時內，幽門螺桿菌感染導致hGO上皮中的增殖細胞數(shù)量增加兩倍，其通過EdU摻入測量。*，p<0.05。比例尺，a中100μm；b中25μm。誤差棒表示。

圖3證明人胃類器官組織含有正常分化的竇細胞類型，并且可用于對人胃發(fā)育建模。圖3A證明hGO含有所有主要的竇細胞譜系。34天hGO具有表面粘液細胞(Muc5AC)和粘液腺細胞(TFF2)，以及凝集素染色區(qū)分表面粘液，UEAI和粘液腺細胞GSII。hGO還包含如由染色顆粒素(Chromogranin)A(CHGA)標記的內分泌細胞。圖3B是在hGO發(fā)育期間EGF在生長，形態(tài)發(fā)生和細胞類型特化中的不同作用的示意圖。在早期發(fā)育階段需要高水平的EGF以形成腺體，然而其在發(fā)育的晚期抑制內分泌分化；因此，到第30天，EGF濃度降低以允許內分泌細胞發(fā)育。圖3C顯示，在撤去包括胃泌素，生長素釋放肽和血清素(5-HT)的EGF時，所有主要內分泌激素在hGO中表達。圖3D顯示高水平的EGF抑制NEUROG3表達。在第30天EGF濃度的降低導致在第34天通過qPCR測量的NEUROG3表達的顯著增加，指示EGF在內分泌特化中作用于NEUROG3的上游。*，p<0.05。圖3E顯示NEUROG3在EGF下游作用以誘導內分泌細胞命運。使用dox誘導性系統(tǒng)的NEUROG3的強制表達足以超越高EGF(100ng mL-1)的內分泌抑制作用。hGO在第30天暴露于dox(1μg/mL)24小時，并在第34天進行分析。經Dox處理的類器官表現(xiàn)出對表達ChrA的內分泌細胞的強烈誘導。比例尺，100μm。誤差棒表示標準偏差。

在34天hGO中還存在豐富的染色顆粒素-A(CHGA)⁺內分泌細胞，包括表達胃泌素，生長素釋放肽，生長抑素和血清素的竇中的四種主要內分泌細胞類型(圖3C和圖12)。有趣的是，我們觀察到高水平的EGF抑制內分泌細胞形成，使得100ng ml^-1導致每個類器官的<1個內分泌細胞。相反，從第30-34天在較低水平的EGF(10ng ml^-1)中培養(yǎng)的hGO產生大量的內分泌細胞(圖13)。此外，高EGF還抑制促內分泌轉錄因子NEUROG3的表達(圖3D)，其在胰腺和腸中廣泛研究^25-28并且是大多數(shù)胃內分泌譜系的形成中所需要的^29,30。這些數(shù)據提示EGFR信號傳導在NEUROG3上游的胃內分泌細胞特化中的新的抑制作用。為了測試該模型，申請人使用多西環(huán)素誘導型hNEUROG3過表達hESC系，并且發(fā)現(xiàn)NEUROG3表達足以克服高EGF(100ng ml^-1)的內分泌抑制作用，導致CHGA⁺內分泌細胞的強力形成(圖3E和圖13)。從這些發(fā)現(xiàn)，我們得出結論，EGF通過抑制NEUROG3抑制內分泌祖細胞的形成，并且NEUROG3足以用于人胃內分泌細胞的特化。

圖12顯示了體內胃竇內分泌細胞發(fā)育。竇中的內分泌細胞分化首先在E18.5明顯，但在出生后階段更明確(顯示的P12)。在早期階段，所有預期的胃內分泌亞型是明顯的，包括胃泌素，生長素釋放肽，生長抑素和血清素(5-HT)。比例尺，100μm。圖13顯示EGF信號傳導抑制NEUROG3依賴性胃內分泌特化程序。圖13A顯示維持在高濃度的EGF(100ng mL-1)中的hGO在第34天具有非常少的內分泌細胞，其通過泛內分泌標志物CHGA的染色顯示。在第24天EGF濃度(10ng mL-1)的減少導致胃上皮中內分泌細胞的更多生理數(shù)目。圖13B顯示從用dox誘導型NEUROG3過表達轉基因穩(wěn)定轉染的hESC系產生hGO，以測試NEUROG3上游是否發(fā)生內分泌分化的EGF阻遏。hGO維持在高EGF(100ng mL-1)中，然后在第30天用多西環(huán)素(1μg/mL-1)處理24小時，然后在第34天進行分析。經Dox處理的hGO顯示內分泌標志物CHGA，胃泌素，生長素釋放肽和促生長素抑制素，并且它們含有具有內分泌形態(tài)的CHGA-(圖3A)，生長素釋放肽-和促生長素抑制素陽性細胞。*，p<0.05。比例尺，100μm。誤差棒表示標準偏差。

臨床證據指示竇的主要定植在幽門螺桿菌介導的疾病中具有重要作用^31,32。因此，申請人測試了hGO是否可用于對人胃對病原體幽門螺桿菌的病理生理響應建模。為了模擬正常的宿主-病原體界面，我們通過顯微注射到類器官的腔中直接將幽門螺桿菌引入上皮的腔表面并測量上皮信號傳導和增殖(圖4)。通過免疫熒光觀察細菌與hGO上皮緊密結合(圖4B)。在24小時內，申請人觀察到對幽門螺桿菌的顯著上皮應答，包括胃癌基因c-Met³³的強力激活和上皮細胞增殖的2倍增加。幽門螺桿菌毒力因子CagA在疾病的病因中起關鍵作用。與已發(fā)表的研究³⁴一致，申請人證明CagA移位到類器官上皮細胞中并與c-Met形成復合物(圖4C)。此外，當用缺乏CagA的幽門螺桿菌的非致病性菌株注射hGO時，上皮應答被消除，增強了該因子在幽門螺桿菌介導的人類發(fā)病機理中的重要性。因此，hGO對幽門螺桿菌的病理生理應答使它們成為闡明由幽門螺桿菌介導的人胃疾病的起始事件的前所未有的模型。

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