專利名稱：用于培養(yǎng)及保存牙髓細(xì)胞的離體牙的移送方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)及保存牙髓細(xì)胞的離體牙的移送方法，尤其涉及在具有含牙髓細(xì)胞的牙髓的離體牙的移送中，提高該細(xì)胞的保存性。
背景技術(shù)：
自古以來(lái)，如同通過(guò)輸血而被大家所熟知的那樣，使用采集的細(xì)胞，使由于外傷或疾病以及事故等失去的組織或臟器再生的再生醫(yī)療的研究開(kāi)發(fā)一直很活躍。近年來(lái)，再生醫(yī)療的具體過(guò)程以如下過(guò)程為目標(biāo)采集未分化狀態(tài)的干細(xì)胞，將其在體外進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)不同情況使其分化后，移植到患處促使再生。作為用于這方面的干細(xì)胞，已知有胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是具有高增殖能力和多能性的源自胚胎的細(xì)胞，但是關(guān)于將其應(yīng)用到再生醫(yī)療方面，還存在由于使用受精卵帶來(lái)的倫理問(wèn)題及因移植產(chǎn)生的排斥反應(yīng)問(wèn)題等。另一方面，成體干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞相比，雖然限制了分化能力，但是由于以較未分化的狀態(tài)存在于活體的各種組織中，因此可以采集、培養(yǎng)自身細(xì)胞，用于治療。因此，成體干細(xì)胞在其應(yīng)用方面不具有如胚胎干細(xì)胞那樣的倫理方面及排斥反應(yīng)的問(wèn)題，因此，在再生醫(yī)療方面正在向?qū)嵱没矫姘l(fā)展。至今為止，雖然認(rèn)為在骨髓、肌肉、神經(jīng)、肝臟、脾臟、小腸等多個(gè)組織中存在成體干細(xì)胞，但由于能夠向間葉組織(皮膚、骨、軟骨、齒、神經(jīng)、血管、心肌等)分化的間葉干細(xì)胞(mesenchymal stem cell)的有用性，因此現(xiàn)今最被期待用于再生醫(yī)療中。作為含有該間葉干細(xì)胞的組織，以骨髓為首，還已知有牙髓、脂肪組織、臍帶血等。但是，由上述組織中采集干細(xì)胞時(shí)，采集對(duì)象往往要擔(dān)負(fù)痛苦等風(fēng)險(xiǎn)，例如，骨髓需要進(jìn)行基于骨髓穿刺的骨髓采集手術(shù)，從脂肪組織中的采集需要伴隨吸脂手術(shù)來(lái)實(shí)施等。此外，雖然臍帶血的采集幾乎不伴有痛苦，但是需要配備滿足嚴(yán)格采集條件的設(shè)備，并且采集的時(shí)機(jī)僅限于分娩時(shí)。因此，提出了與這些組織相比，能夠以極低的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行采集的牙髓干細(xì)胞的應(yīng)用(專利文獻(xiàn)I及2)。即，含牙髓干細(xì)胞的牙髓細(xì)胞可以采集自以往在醫(yī)療設(shè)施中作為醫(yī)療廢棄物來(lái)處理的立事牙(智齒)或乳牙等離體牙，因此容易收集，在確立培養(yǎng)方法及保存方法方面也給出了高實(shí)用性的啟示?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本專利第4125241號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 :日本特開(kāi)2004-201612號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
要解決的技術(shù)問(wèn)題但是，一般情況下，以用于再生醫(yī)療為目的進(jìn)行采集、培養(yǎng)的干細(xì)胞需要冷凍保存，直至實(shí)際用于治療時(shí)為止。但是，個(gè)人將干細(xì)胞在最佳條件下進(jìn)行長(zhǎng)期保存是完全不現(xiàn)實(shí)的事情，因此現(xiàn)在，對(duì)采集干細(xì)胞的培養(yǎng)、保存處理及保存，大多必然要委托給具備細(xì)胞保藏設(shè)備的機(jī)構(gòu)。因此，在牙髓干細(xì)胞的情況下，在各牙科醫(yī)療機(jī)構(gòu)拔除的牙在從該機(jī)構(gòu)移送給細(xì)胞保藏機(jī)構(gòu)，直至進(jìn)行培養(yǎng)、保存處理為止的這段時(shí)間，顯然需要使干細(xì)胞處于存活狀態(tài)。但是，為了更加切實(shí)地利用從離體牙中采集的僅極微量的牙髓干細(xì)胞，使其在維持同活體內(nèi)一樣高的增殖能力的狀態(tài)下，將牙髓干細(xì)胞移送到細(xì)胞保藏機(jī)構(gòu)的技術(shù)還未見(jiàn)報(bào)道。因此，在所述機(jī)構(gòu)中進(jìn)行細(xì)胞采集、保存處理的階段，存在已經(jīng)對(duì)干細(xì)胞造成功能損傷的可能性。即，在上述體制的情況下，由于進(jìn)行準(zhǔn)備及運(yùn)輸，從牙齒被拔除掉開(kāi)始到取出 牙髓細(xì)胞、進(jìn)行培養(yǎng)及保存處理為止，需要2Γ48小時(shí)左右，但是難以從經(jīng)過(guò)這樣一段時(shí)間后的離體牙中確保完整的牙髓細(xì)胞。尤其是恒牙的情況下，即使浸潰于保存液中進(jìn)行移送，但由于保存液被象牙質(zhì)所包圍，不能夠充分浸透到牙髓，因此牙髓細(xì)胞只能夠保持極短的時(shí)間。因此，能夠想到預(yù)先從離體牙中取出帶有牙髓細(xì)胞的牙髓，并浸潰到保存液中進(jìn)行移送，但是在技術(shù)及設(shè)備存在差異的各醫(yī)療設(shè)施中，要將因微量而難以處理的牙髓以穩(wěn)定的品質(zhì)進(jìn)行處理，實(shí)際上被認(rèn)為是不可能的。本發(fā)明是鑒于上述問(wèn)題而完成的，其目的在于提供一種不損傷牙髓細(xì)胞在活體內(nèi)的功能，移送用于培養(yǎng)及保存牙髓細(xì)胞的離體牙的方法。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)離體牙進(jìn)行使牙髓露出的特定處理，然后以保存狀態(tài)進(jìn)行運(yùn)送，能夠在使牙髓干細(xì)胞保持再生醫(yī)療所需的正常功能的狀態(tài)下，移送含牙髓的離體牙，至此完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明的用于培養(yǎng)及保存牙髓細(xì)胞的離體牙的移送方法，其特征為，其包括下列工序在離體牙的表面添加直線形的槽；沿著槽分割所述離體牙，使牙髓露出；將所述離體牙浸入培養(yǎng)基，以維持在適合細(xì)胞保存的溫度的狀態(tài)進(jìn)行運(yùn)送。并且，在所述方法中，所述直線形的槽優(yōu)選為沿著從離體牙的齒冠至齒根的縱切線，從該離體牙的側(cè)面向中心形成槽。并且，在所述方法中，所述直線形的槽優(yōu)選為沿著離體牙的齒冠部咬合面的分割線，從該離體牙的上面向中心形成。并且，在所述方法中，所述運(yùn)送所需時(shí)間優(yōu)選為48小時(shí)以內(nèi)。并且，在所述方法中，所述離體牙為恒牙，優(yōu)選為牙髓未經(jīng)處理的阻生牙、多生牙或方便拔掉的牙。并且，在所述方法中，所述直線形的槽的長(zhǎng)度優(yōu)選為5 10mm、寬度優(yōu)選為
O.5^1. 5mm、深度優(yōu)選為2 4mm。此外，本發(fā)明的用于培養(yǎng)及保存牙髓細(xì)胞的離體牙的移送方法，其特征為，包括將形成2/3以上后繼恒牙齒根的離體乳牙浸入培養(yǎng)基內(nèi)，以維持在適合細(xì)胞保存的溫度的狀態(tài)進(jìn)行運(yùn)送的工序。
并且，在上述方法中，所述運(yùn)送所需時(shí)間優(yōu)選為48小時(shí)以內(nèi)。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，將具有含牙髓干細(xì)胞的牙髓的離體牙向細(xì)胞保藏機(jī)構(gòu)等移送所需的2Γ48小時(shí)期間，能夠不損害并維持在活體內(nèi)的功能。因而，在拔牙后能夠保持接近活體內(nèi)的狀態(tài)直至進(jìn)行牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)、保存處理，因此能夠?qū)碾x體牙中采集的僅極微量的牙髓干細(xì)胞有效地應(yīng)用于再生醫(yī)療。


圖I為根據(jù)本發(fā)明方法的(A)乳牙、(B)恒牙的牙髓細(xì)胞的增殖曲線。圖2為根據(jù)本發(fā)明方法的(A)乳牙、(B)恒牙的牙髓細(xì)胞的ALP染色質(zhì)像。
圖3為根據(jù)本發(fā)明方法的(A)乳牙、(B)恒牙的牙髓細(xì)胞的SA-β -gal染色質(zhì)像。圖4為根據(jù)本發(fā)明方法的牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞的染色體像。圖5為根據(jù)本發(fā)明方法的牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞的染色體像。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種例如在細(xì)胞保藏機(jī)構(gòu)中對(duì)牙髓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、保存處理，必要時(shí)應(yīng)用于再生醫(yī)療的這一模型中，在從齒科醫(yī)療機(jī)構(gòu)運(yùn)送到細(xì)胞保藏機(jī)構(gòu)期間，用于保存牙髓的存活細(xì)胞數(shù)量及其功能的移送方法，所述牙髓細(xì)胞存在于從在各地齒科醫(yī)療機(jī)構(gòu)被拔除的牙中得到的牙髓中，并含有牙髓干細(xì)胞。從將牙髓中的微量細(xì)胞切實(shí)地用于培養(yǎng)、保存的角度來(lái)看，本發(fā)明與技術(shù)、設(shè)備無(wú)關(guān)，在任何齒科醫(yī)療機(jī)構(gòu)都可以容易地實(shí)施，并且可發(fā)揮穩(wěn)定的細(xì)胞保持效果。此外，本發(fā)明方法顯然也能夠適用于除所述的從齒科醫(yī)療機(jī)構(gòu)送至細(xì)胞保藏機(jī)構(gòu)以外的的細(xì)胞移送中。下面，對(duì)本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明使用的離體牙，只要是具有牙髓的離體牙即可，可以是乳牙，也可以是恒牙。通常，可以使用在牙科醫(yī)療機(jī)構(gòu)通過(guò)牙科處理來(lái)拔除掉的離體牙。并且即使是自然脫離的牙，只要牙的狀態(tài)符合下述條件，并且能夠迅速地進(jìn)行后述的對(duì)離體牙的處理，就可以使用。作為特別適合利用牙髓干細(xì)胞的離體牙可以例舉如下?tīng)顟B(tài)的離體牙。作為乳牙，可以使用未經(jīng)過(guò)處理的牙、修復(fù)牙中的任何一種，但進(jìn)行了牙髓切斷及拔髓等處理的牙不優(yōu)選。并且，對(duì)于已被確認(rèn)為搖動(dòng)的乳牙，優(yōu)選沒(méi)有齲齒，且形成2/3以上后繼恒牙齒根的離體牙。患有齲齒、根尖牙周炎(Per)等的離體牙，由于不能期望采集到正常的牙髓，因此不適合使用。此外，對(duì)于沒(méi)有被確認(rèn)搖動(dòng)的乳牙，同樣優(yōu)選沒(méi)有齲齒，且形成2/3以上后繼恒牙齒根的離體牙。但是，即使有齲齒，但進(jìn)程停止在Cl (琺瑯質(zhì)齲齒)或C2 (象牙質(zhì)齲齒)并確認(rèn)形成2/3以上后繼恒牙齒根的離體牙也可以使用。另一方面，因齲齒而發(fā)生牙髓炎的離體牙。作為恒牙，適合使用作為所謂立事牙(智齒)的阻生牙、多生牙或方便拔掉的牙等可以拔掉的牙，但同乳牙一樣，不優(yōu)選經(jīng)過(guò)牙髓處理的離體牙及牙髓患病的離體牙。即使是因拔牙處理等出現(xiàn)牙損傷或缺損的情況下，只要該離體牙為停止在琺瑯質(zhì)或象牙質(zhì)等不影響后述的離體牙處理，就沒(méi)有問(wèn)題，能夠使用。接下來(lái)，對(duì)離體牙的處理進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。上述離體牙，根據(jù)需要對(duì)其表面進(jìn)行擦拭、消毒，并在表面設(shè)置直線形的槽。由于該槽作為下一步工序中對(duì)牙齒進(jìn)行分割時(shí)的向?qū)?，因此在沿著該槽?duì)牙進(jìn)行分割時(shí)，需要在位于牙齒中心的牙髓露出的位置及方向上形成。在分割時(shí)應(yīng)盡可能地露出牙髓，對(duì)于槽的形成位置及方向沒(méi)有限制，例如可例舉下述實(shí)施方式。

(例I)沿著從離體牙的齒冠至齒根的縱切線，從該離體牙的側(cè)面向中心形成槽。離體牙側(cè)面上的所述縱切線的位置，只要沿該縱切線的槽可朝向該離體牙中心進(jìn)行雕刻即可，沒(méi)有限制。(例2)沿著離體牙的齒冠部咬合面的分割線，從所述離體牙的上面向中心形成槽。此時(shí)，成為槽的分割線優(yōu)選通過(guò)咬合面的大致中心，但只要槽朝向離體牙中心進(jìn)行雕刻，所述分割線的位置就不成為問(wèn)題。希望的是上述槽盡可能長(zhǎng)、深地形成。槽的長(zhǎng)度及寬度，只要是能夠以該槽作為向?qū)нM(jìn)行分割的程度即可，根據(jù)離體牙的大小及設(shè)置槽的部位，優(yōu)選在長(zhǎng)5 10mm、寬
O.5^1. 5mm的范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。并且，槽的深度為從琺瑯質(zhì)至象牙質(zhì)的程度，優(yōu)選為向牙中心2 4_的范圍。如果槽過(guò)深，則牙髓細(xì)胞往往會(huì)破碎，因此需注意。并且，所述槽的形成，例如可以在注水條件下，使用金剛石刻刀實(shí)施。在本發(fā)明的方法中，在離體牙上按照上述方法設(shè)置槽后，沿著該槽對(duì)牙進(jìn)行分割。如果所述槽朝向牙髓所在的中心進(jìn)行適當(dāng)?shù)窨蹋瑒t離體牙沿著該槽能夠正好切成兩部分。即，通過(guò)預(yù)先在上述的工序中，添加適當(dāng)?shù)牟郏瑒t與技術(shù)及設(shè)備無(wú)關(guān)，能夠使堅(jiān)固的牙齒容易地進(jìn)行分割。對(duì)于分割離體牙的方法沒(méi)有限制，通常，將牙根梃子等插入到槽中，沿著槽壓開(kāi)，從而能夠?qū)⒀例X分為兩個(gè)部分。困難的情況下，可以將角鑿等插入到槽中，用木槌等敲打，可以分成兩部分。沿著預(yù)先設(shè)置的槽將離體牙進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆指顣r(shí)，存在于其內(nèi)部中央的牙髓會(huì)露出。此時(shí)，優(yōu)選不使器具等與露出的牙髓接觸。此外，對(duì)牙齒的分割數(shù)量也沒(méi)有限制，但對(duì)于使牙髓露出，可認(rèn)為分成兩部分已經(jīng)足夠。但是，在通過(guò)一次分割不能夠使牙髓充分露出的情況下，根據(jù)需要，需要重新從形成槽的工序再次進(jìn)行。將分割后的離體牙浸潰于細(xì)胞用培養(yǎng)基或保存液中，并保持在適合保存細(xì)胞的溫度下。通過(guò)在這種狀態(tài)下進(jìn)行運(yùn)送，能夠使存在于離體牙內(nèi)的牙髓中的，含有牙髓干細(xì)胞的牙髓細(xì)胞在48小時(shí)以內(nèi)幾乎完全維持原有的全部功能(生理活性)及其存活細(xì)胞數(shù)。適合保存細(xì)胞的低溫是指在抑制代謝活性的狀態(tài)下，使細(xì)胞能夠存活的溫度，一般為4 8°C，最優(yōu)選為4°C。
使用的培養(yǎng)基或保存液，只要是通常用于細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞保存中的即可，尤其優(yōu)選 a -MEM 培養(yǎng)基(20%FBS、100yM L(+)_ 抗壞血酸、青霉素(50u/mL)/鏈霉素(50 μ g/mL)。將這些培養(yǎng)基或保存液放入用于培養(yǎng)的帶蓋試管等中，將露出牙髓的分割離體牙浸潰到其中，并蓋上蓋子，以維持適合保存細(xì)胞的溫度(例如4°C)的狀態(tài)進(jìn)行運(yùn)送為優(yōu)選。此外，離體牙為乳牙，齒根部被吸收的情況下，培養(yǎng)基或保存液容易浸透到牙髓。因此，對(duì)于乳牙，也可以省略上述在牙齒上形成槽的工序及分割工序，僅按照上述方法將離體乳牙浸潰到細(xì)胞用培養(yǎng)基或保存液中，保持在低溫下進(jìn)行運(yùn)送。這種情況下，牙髓細(xì)胞也能夠幾乎以完整的狀態(tài)保存2Γ48小時(shí)。當(dāng)然，同樣也可以像恒牙一樣，在乳牙上形成槽及進(jìn)行分割處理。按照上述順序進(jìn)行移送的離體牙中的含牙髓干細(xì)胞的牙髓細(xì)胞(牙髓)優(yōu)選在細(xì)胞保藏機(jī)構(gòu)中，在適當(dāng)?shù)臈l件下從離體牙中取出，按照公知的細(xì)胞處理方法進(jìn)行培養(yǎng)、保存 處理后，長(zhǎng)期保存?？梢栽诒匾獣r(shí)取出保存的牙髓細(xì)胞，用于再生醫(yī)療等?；蛘咭部梢詫?duì)保存的細(xì)胞施以iPS化等技術(shù)，用于醫(yī)療或研究。實(shí)施例下面，表示本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。首先，表示根據(jù)本發(fā)明方法的離體牙(乳牙、恒牙)移送(保存)例?！匆扑?保存)例〉乳牙按照牙科的方法拔掉沒(méi)有齲齒，且形成2/3以上后繼恒牙齒根的搖動(dòng)的乳牙或者有未達(dá)琺瑯質(zhì)僅限于象牙質(zhì)的齲齒且形成2/3以上后繼恒牙齒根的非搖動(dòng)的乳牙。拔掉后放入充滿a -MEM培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中，在低溫(4°C)下冷藏，包括運(yùn)送時(shí)間保存24小時(shí)。恒牙按照牙科的方法拔掉沒(méi)有齲齒，未處理牙髓的阻生牙、多生牙或方便拔掉的牙。拔掉后，使用金剛石刻刀在牙齒的側(cè)面中央位置，從齒冠上端至根尖添加槽，槽的深度至象牙質(zhì)。然后，沿著槽使用牙根梃子將牙縱切為兩部分，使牙髓露出。將分割后的牙放入充滿a -MEM培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中，在4°C下冷藏，包括運(yùn)送時(shí)間保存24小時(shí)。將進(jìn)行了上述移送(保存)例的乳牙及恒牙的牙髓細(xì)胞按照下述順序進(jìn)行培養(yǎng)、保存，并對(duì)其功能的保持進(jìn)行了研究。<培養(yǎng)方法>I.牙髓的采集將上述移送(保存)例的離體牙(從拔牙開(kāi)始24小時(shí))在滅菌皿中拍攝照片。然后，使用鑷子和鉆孔器，取出牙髓。對(duì)取出牙髓的牙拍攝照片，用福爾馬林固定。回收牙髓，以IOOXg 4°C 20sec進(jìn)行離心后，去除上清液，加入IOmL的沖洗用PBS，對(duì)其再次離心，反復(fù)進(jìn)行3次這種沖洗工序。去除上清液，加入2mL的酶解用培養(yǎng)基，在37°C下處理I小時(shí)(30分鐘混合一次)，將其在2000rpm (4°C)下離心5分鐘。去除上清液，加入5mL的a -MEM培養(yǎng)基，在2000rpm (4°C )下離心5分鐘。然后，去除上清液，加入5mL的a-MEM培養(yǎng)基，對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，將獲得的牙髓細(xì)胞接種至T-25燒瓶中。并且，上述酶解用培養(yǎng)基為7. 5mL的a -MEM培養(yǎng)基(a -MEM :395mL、FCS IOOmL,200mM 的抗壞血酸:250 μ L、PS 5mL 的混合液)，2· 5mL 的 DispaseII (2. 4U/mL、Roche 公司生產(chǎn))，以及30mg的膠原酶(和光純藥公司生產(chǎn))的混合液。2.牙髓細(xì)胞培養(yǎng)在上述工序后，2天更換一次培養(yǎng)基，融合后進(jìn)行下一步的繼代操作。并且，在接種I天后及繼代前拍攝細(xì)胞照片。3.繼代使用PBS (—)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行2次沖洗后，加入ImL O. 05%的胰蛋白酶/EDTA進(jìn)行再次沖洗，在37°C下進(jìn)行5分鐘孵育(incubater)。然后，加入5mL新的a -EME培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮后,在IOOOrpm (4°C)下離心5分鐘。去除上清液，懸浮于新的培養(yǎng)基中，接種到IOcm的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行培養(yǎng)(繼代第2代)。并且，采集IOmL將繼代第2代培養(yǎng)了 3天以上的培養(yǎng)基，并在_20°C下保存，將保存的液體作為病毒檢查的檢體。通過(guò)重復(fù)上述操作，按照同樣的方法獲得繼代第3代 第10代。4.原種的制備各繼代的原種按照下述方法制備。在上述繼代操作后,對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù),在IOOOrpm (4°C )下離心5分鐘。然后，去除上清液，加入細(xì)胞庫(kù)II (Cell Banker II)進(jìn)行懸浮，使每瓶中的細(xì)胞數(shù)為I X IO6細(xì)胞/mL以上。將其分別注入到小瓶中，每瓶注入lmL，將小瓶放入到生物冷凍容器(ΒΙ0FREEZING VESSEL)中，在_80°C下放置2天后，移入到液氮中。將由上述方法培養(yǎng)的繼代第3代、第7代、第10代的牙髓細(xì)胞按照下述方法進(jìn)行試驗(yàn)?！粗谱髟鲋城€〉將在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS (—)清洗2次后，加入ImLO. 05%胰蛋白酶/IOmMEDTA，洗凈。然后，在37°C下進(jìn)行5分鐘孵育，確認(rèn)細(xì)胞已從培養(yǎng)皿中剝離后，加入培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮。將細(xì)胞懸浮液在IOOOrpm (4°C )下離心5分鐘，去除上清液后，再次加入培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮，在IOOOrpm (4°C )下離心5分鐘。然后，將細(xì)胞懸浮于新的培養(yǎng)基中，對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。將5. 4 X IO5數(shù)量的細(xì)胞懸浮于9. 5mL培養(yǎng)基中，在24孔板的12個(gè)孔中以500 μ L/孔分別注入。然后，在各孔中分別加入500 μ L培養(yǎng)基，使其為ImL/孔。將其在37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24小時(shí)對(duì)2個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)直到細(xì)胞增殖達(dá)到穩(wěn)定期為止，從而得到圖I所示的增殖曲線。圖I中的(A)為乳牙、(B)為恒牙的牙髓細(xì)胞的增殖曲線。所述乳牙、恒牙均是通過(guò)上述移送(保存)例獲得的。牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)是根據(jù)上述培養(yǎng)方法進(jìn)行的。如圖I所示，使用的恒牙、乳牙中的任意牙髓細(xì)胞，直至第10代為止均維持了幾乎同等的增殖能力，與一般的牙髓細(xì)胞(拔牙后立即進(jìn)行培養(yǎng))的增殖曲線相比沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異
堂
巾O并且，對(duì)沒(méi)有進(jìn)行本發(fā)明的移送方法，而僅是在拔牙后浸入保存液中進(jìn)行24小時(shí)以內(nèi)上述培養(yǎng)的牙也進(jìn)行了同樣的試驗(yàn)，對(duì)于恒牙的增殖能力大幅度降低，每增加一次繼代次數(shù)，其降低程度變得顯著。并且，根據(jù)本發(fā)明，能夠在維持含干細(xì)胞的牙髓細(xì)胞的增殖能力的狀態(tài)下，對(duì)離體牙進(jìn)行移送?！磯A性磷酸酶(ALP)染色〉將在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS (—)清洗2次后，進(jìn)一步加入ImL O. 05%胰蛋白酶/IOmM EDTA，洗凈。然后，在37°C下進(jìn)行5分鐘孵育，確認(rèn)細(xì)胞已從培養(yǎng)皿中剝離后，力口入培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮。將細(xì)胞懸浮液在IOOOrpm (4°C )下離心5分鐘，去除上清液，然后再次加入培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮，在IOOOrpm (4°C )下離心5分鐘。
然后，對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，在6孔板中以I X IO5細(xì)胞/孔進(jìn)行接種，培養(yǎng)I夜。培養(yǎng)后，將細(xì)胞用PBS清洗I次，用2mL 4%的PFA固定3分鐘，用PBS清洗2次。然后，加入 ImL 的檢測(cè)緩沖液(IM Tris-HCl (pH 9. 5) :50mL、3M NaCl : 16. 67mL、IM MgCl 25mL、B, W :408. 33mL的混合溶液)，放置2分鐘。吸出檢測(cè)緩沖液，加入500 μ L顯色液(檢測(cè)緩沖液5mL、NBT : 16. 5 μ L、BCIP 16 μ L)，避光放置2小時(shí)后，用蒸餾水清洗5分鐘孔中的細(xì)胞。在各個(gè)孔中加入700 μ L的4% PFA/PBS，在室溫下孵育10分鐘。然后，去除4% PFA/PBS，用PBS (一)沖洗3次。接著，在各個(gè)孔中加入3滴IMMU-M0UNT，蓋上蓋玻片，在室溫下保存。圖2中的(A)為乳牙、(B)為恒牙的牙髓細(xì)胞的染色質(zhì)象。所述乳牙、恒牙，均是通過(guò)上述移送(保存)例獲得的。牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)是根據(jù)上述方法進(jìn)行的。堿性磷酸酶(ALP)用作成骨細(xì)胞的標(biāo)記，已知表示骨形成的細(xì)胞被染成紫色(ALP陽(yáng)性細(xì)胞)。如圖2所示，使用的恒牙、乳牙中的任意牙髓細(xì)胞均確認(rèn)為ALP陽(yáng)性細(xì)胞。雖然可看出ALP陽(yáng)性細(xì)胞隨著繼代數(shù)的增加而減少，但通過(guò)繼代，細(xì)胞的總數(shù)本身增加。因此,能夠想到這些牙髓細(xì)胞在整形外科疾病(骨折等骨修復(fù)等)方面非常有用。并且，該結(jié)果不遜色于通過(guò)其它途徑得到的通常的牙髓細(xì)胞(拔牙后立即進(jìn)行培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞)所帶來(lái)的效果O并且，對(duì)沒(méi)有進(jìn)行本發(fā)明的移送方法，而僅是在拔牙后浸入保存液中進(jìn)行24小時(shí)以內(nèi)上述培養(yǎng)的牙也進(jìn)行了同樣的試驗(yàn)，對(duì)于恒牙，可知ALP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞的總數(shù)明顯少于圖2 (B)。因此，根據(jù)本發(fā)明，能夠在維持含干細(xì)胞的牙髓細(xì)胞的增殖能力的狀態(tài)下，對(duì)離體牙進(jìn)行移送?！醇?xì)胞老化的測(cè)定(SA-β-gal染色)>將在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS (—)清洗2次后，進(jìn)一步加入ImL O. 05%胰蛋白酶/IOmM EDTA，洗凈。然后，在37°C下進(jìn)行5分鐘孵育，確認(rèn)細(xì)胞已從培養(yǎng)皿中剝離后，力口入培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮。將細(xì)胞懸浮液在IOOOrpm (4°C )下離心5分鐘，去除上清液，然后再次加入培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮，在IOOOrpm (4°C )下離心5分鐘。然后，將細(xì)胞懸浮于新的培養(yǎng)基中，對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，在6孔板中以I X IO5細(xì)胞/孔進(jìn)行接種后，在37°C，5%C02下孵育24小時(shí)。
除去培養(yǎng)基，用PBS (—)沖洗，在各孔中加入700 μ L的4%PFA/PBS，在RT下孵育10分鐘。然后，去除4% PFA/PBS、，用PBS (一)沖洗3次。在各孔中加入700μ L的SA-β-gal溶液，在室溫下孵育I夜，在顯微鏡下對(duì)染色的細(xì)胞進(jìn)行檢查后攝影。除去SA-β-gal溶液，用PBS (—)進(jìn)行2次沖洗后，在各孔中加入700 μ L的4%的PFA/PBS，在室溫下孵育10分鐘。然后，去除4%PFA/PBS，用PBS沖洗3次。接著，在各孔中加入3滴IMMU-M0UNT，蓋上蓋玻片，在室溫下保存。圖3中的(A)為乳牙、(B)為恒牙的牙髓細(xì)胞的SA-β-gal染色質(zhì)象。所述乳牙、恒牙均是通過(guò)上述移送(保存)例獲得的，牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)是根據(jù)上述方法進(jìn)行的。、
SA-β-gal用作細(xì)胞的老化標(biāo)記，已知停止細(xì)胞分裂的老化細(xì)胞被染成藍(lán)色(SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞)。如圖3所示，使用的恒牙、乳牙中任意的牙髓細(xì)胞均不被認(rèn)為是SA-β -gal陽(yáng)性細(xì)胞，即使重復(fù)繼代，該結(jié)果也沒(méi)有變化。由此能夠想到在這些牙髓細(xì)胞中由繼代帶來(lái)的增殖能力的變化很小，能夠進(jìn)行穩(wěn)定的培養(yǎng)，非常有用。并且，該結(jié)果不遜色于通過(guò)其它途徑得到的通常的牙髓細(xì)胞(拔牙后立即進(jìn)行培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞)所帶來(lái)的效果。并且，對(duì)沒(méi)有進(jìn)行本發(fā)明的移送方法，而僅是在拔牙后浸入保存液中進(jìn)行24小時(shí)以內(nèi)上述培養(yǎng)的牙也進(jìn)行了同樣的試驗(yàn)，對(duì)于恒牙，已確認(rèn)為SA-β -gal陽(yáng)性細(xì)胞。因此，根據(jù)本發(fā)明，能夠在維持含干細(xì)胞的牙髓細(xì)胞的增殖能力的狀態(tài)下，對(duì)離體牙進(jìn)行移送。〈染色體分析〉取根據(jù)上述移送(保存)例的源自女性恒牙及男性乳牙的人類牙髓細(xì)胞各I例，按照上述培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，分析其染色體數(shù)。對(duì)分別50個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的染色體數(shù)進(jìn)行分析，分析結(jié)果如表I及表2所示。具體的分析方法如下。將經(jīng)過(guò)10代繼代的牙髓細(xì)胞制成染色體標(biāo)本，進(jìn)行姬姆薩染色，確定染色體數(shù)量后，將該標(biāo)本通過(guò)Quinacrine-Hoechst染色進(jìn)行顯帶。基于標(biāo)準(zhǔn)核型對(duì)染色體進(jìn)行分類，并進(jìn)行核型分析。表I
權(quán)利要求
1.一種用于培養(yǎng)及保存牙髓細(xì)胞的離體牙的移送方法，其特征在于，其包括下列工序: 在離體牙的表面添加直線形的槽； 沿著槽分割所述離體牙，使牙髓露出； 將所述離體牙浸入培養(yǎng)基，以維持在適合細(xì)胞保存的溫度的狀態(tài)進(jìn)行運(yùn)送。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于培養(yǎng)及保存牙髓細(xì)胞的離體牙的移送方法，其特征在于，所述直線形的槽是沿著從離體牙的齒冠至齒根的縱切線，從該離體牙的側(cè)面向中心形成槽。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于培養(yǎng)及保存牙髓細(xì)胞的離體牙的移送方法，其特征在于，所述直線形的槽是沿著離體牙的齒冠部咬合面的分割線，從該離體牙的上面向中心形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的用于培養(yǎng)及保存牙髓細(xì)胞的離體牙的移送方法，其特征在于，所述運(yùn)送所需時(shí)間為48小時(shí)以內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的用于培養(yǎng)及保存牙髓細(xì)胞的離體牙的移送方法，其特征在于，所述離體牙為恒牙，其為牙髓未經(jīng)處理的阻生牙、多生牙或方便拔掉的牙。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的用于培養(yǎng)及保存牙髓細(xì)胞的離體牙的移送方法，其特征在于，所述直線形的槽的長(zhǎng)度為5 10mm、寬度為O. 5^1. 5mm、深度為2 4mm。
7.一種用于培養(yǎng)及保存牙髓細(xì)胞的離體牙的移送方法，其特征在于，包括將形成2/3以上后繼恒牙齒根的離體乳牙浸入培養(yǎng)基內(nèi)，以維持在適合細(xì)胞保存的溫度的狀態(tài)進(jìn)行運(yùn)送的工序。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于培養(yǎng)及保存牙髓細(xì)胞的離體牙的移送方法，其特征在于，所述運(yùn)送所需時(shí)間為48小時(shí)以內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種不損傷牙髓細(xì)胞在活體內(nèi)的功能，移送用于培養(yǎng)及保存牙髓細(xì)胞的離體牙的方法。本發(fā)明的牙髓細(xì)胞的采集方法包括下列工序在離體牙的表面添加直線形的槽；沿著槽分割所述離體牙，使牙髓露出；將所述離體牙浸入培養(yǎng)基，以維持在適合細(xì)胞保存的溫度的狀態(tài)下進(jìn)行運(yùn)送。
文檔編號(hào)A61L27/00GK102725398SQ20108005731
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2010年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者大久保亮, 大友宏一, 齋藤一郎 申請(qǐng)人:學(xué)校法人總持學(xué)園鶴見(jiàn)大學(xué), 株式會(huì)社再生醫(yī)療推進(jìn)機(jī)構(gòu)