專利名稱：保持內(nèi)源性促紅細胞生成素組織保護活性的長效促紅細胞生成素的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的能較好保持組織保護能力的長效促紅細胞生成素。特別的，本發(fā)明涉及經(jīng)化學修飾的長效促紅細胞生成素，所述化學修飾延長了其在血清中的半衰期但還保持了天然蛋白在體內(nèi)的組織保護功能。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明所述長效促紅細胞生成素來治療貧血及其相關(guān)疾病。最后，本發(fā)明涉及一種分析促紅細胞生成素是否具有組織保護能力的檢測方法。
背景技術(shù)：
自然生成的或內(nèi)源性的促紅細胞生成素(EPO)是一種主要由肝臟產(chǎn)生的糖蛋白激素。內(nèi)源性的EPO包含165個氨基酸，分子量(人類的)為大約30,000大約到34,000道爾頓。EPO中的糖基，其由3個N-連接和1個O-連接的寡糖鏈構(gòu)成，它占了整個蛋白質(zhì)分子量的大約40％。N-連接的寡糖鏈結(jié)合在24，38和83位的天冬酰胺的氨基氮上，而O-連接的寡糖鏈結(jié)合在126位上的絲氨酸殘基的氧原子上。EPO可能存在3種形式α、β和脫唾液酸形式(Asialo)。α和β形式具有相同的效力，生物活性，和分子量，但在糖類的組成上略有不同，而脫唾液酸形式是除去了末端唾液酸(糖類)的α或β形式。
直到最近，內(nèi)源性的EPO的主要功能是和其它生長因子一同刺激響應性骨髓紅細胞前體細胞的增殖和成熟，以及保持個體的血細胞比容(在含有紅細胞的全血中所占的百分率)。紅細胞的產(chǎn)生過程稱為紅細胞生成，它是—種被精確調(diào)控的生理機制，在不妨礙循環(huán)的情況下優(yōu)化紅細胞的數(shù)量使其滿足組織氧化的需要。例如，當紅細胞輸送的氧減少時，EPO通過刺激骨髓中前體細胞吞轉(zhuǎn)運化為成熟的紅細胞增加紅細胞的產(chǎn)生，產(chǎn)生的紅細胞隨即進入循環(huán)體系中。當循環(huán)系統(tǒng)中的紅細胞的數(shù)量超過正常組織循環(huán)需要時，循環(huán)體系中的EPO就減少。因此，當機體處于健康狀態(tài)時，血漿中EPO的濃度是非常低，僅足以刺激替代由于老化而正常損失的紅細胞。血漿EPO的正常范圍是從0.01單位/ml到0.03單位/ml。
假定個體中大多數(shù)的EPO是由腎產(chǎn)生的，腎功能的損失，例如慢性腎衰竭(CRE)，會導致EPO數(shù)量的減少并且常常會導致貧血。同樣，貧血可能由其它的慢性疾病，例如癌癥，或與這些疾病相關(guān)的治療，如化療所引起。因此，已經(jīng)證明，給紅細胞減少的個體施用重組的EPO(后面將詳細敘述到)能夠有效的恢復血細胞比容的水平，所述重組的EPO與內(nèi)源性EPO有基本上同樣的生物活性。
除了其在慢性癥狀下保持血細胞比容水平中的作用外，重組EPO已經(jīng)被用于在選擇性或預定的手術(shù)之前增加紅細胞水平，從而減少或取消輸血的需要。例如，施用重組EPO可以解除病人對通過輸血而感染病毒或病原的顧慮，或解決宗教上限制輸血的問題。
進一步的，近來的一些證據(jù)表明，EPO作為細胞因子超家族的一員，具有其它重要的治療屬性，這通過其與EPO受體(EPO-R)的相互作用來介導。例如，EPO及其受體在緩減組織損傷中起著重要的作用，因為EPO和其受體相互作用提供了改變?nèi)毖跫毎h(huán)境的補償性應答，以及調(diào)控由于代謝壓力產(chǎn)生的程序性細胞死亡。事實上，患有慢性腎衰竭和/或癌癥的病人使用EPO治療后，一般會提高康復的感覺或智力的敏銳性，這樣的效果此前被歸功于病人血細胞比容的增加。但近來，如在國際申請?zhí)朩O/02053580和美國專利公開號2002/0086818和2003/0072737中所述的，這些改進被歸功于EPO的組織保護和增強的活性。
最近的研究同樣表明，全身性施用的EPO可以通過血腦屏障，因為形成血腦屏障的毛細管也表達EPO受體。因此，這提供了從外周循環(huán)到腦部的受體介導的胞吞作用的解剖基礎。
重組EPO(epoetinα)，可以通過商業(yè)途徑獲得，如商品名為PROCRIT(來自Ortho Biotech Inc.，Raritan，NJ)，和EPOGEN(來自Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA)，已經(jīng)用于治療由晚期腎病引起的貧血，同AZT(疊氮胸苷)療法一起使用來治療感染HIV的病人，和用于抵消化療的影響。雖然重組EPO的治療作用有很多種，但至今為止重組EPO最主要的用途是緩減慢性貧血。在這一點上，在大約6到8周內(nèi)重組EPO典型的初始施用劑量是50-150單位/kg每周三次，靜脈或皮下注射給藥，以恢復病人體內(nèi)指導性的血細胞比容范圍。當病人獲得預期的血細胞比容水平，例如在約30％到約36％之間的量之后，可以在無缺鐵或并發(fā)癥的情況下通過維持EPO療法而維持所述的血細胞比容水平。雖然劑量的要求可能根據(jù)患者個體的需求而變化，但通常維持劑量可以是每周約給藥三次(如果劑量更大的話，次數(shù)可以更少)。
重組EPO的施用劑量和次數(shù)部分取決于該分子的半衰期，當分子處于體內(nèi)時可能是很有限的。例如，據(jù)報道在患有CRF的成年及兒童病人中，靜脈施用的EPOGEN以符合一級動力學的速率被清除，其循環(huán)半衰期在約4-13小時范圍內(nèi)。因此，為了達到治療效果考慮到重組EPO相對較短的半衰期，對施用劑量和效率進行調(diào)整。
另外，因為重組EPO通過靜脈或皮下注射，這常常就需要護士或醫(yī)師來給病人注射重組EPO。這給病人帶來了更多的不便，這也就成為另外一個之所以要考慮分子半衰期延長的原因。因此，增加重組EPO半衰期的研究在過去的十年中受到重視，這基于如下前提，即延長的半衰期可以減少需求的劑量，同時也提供了相同的或改進了的治療效果。
事實上，關(guān)于人類EPO最新的實驗表明，EPO中含有唾液酸的糖含量，它的循環(huán)半衰期，和體內(nèi)活性之間有著直接的關(guān)系。正如PCT公開號WO95/05465中描述的那樣，唾液酸殘基加在糖鏈的末端并阻止了肝臟對半乳糖的識別。典型地，每條N-連接的寡糖鏈含有至多4個唾液酸，每條O-連接的寡糖鏈含有至多2個唾液酸。因此，未被修飾的EPO多肽總共可以含有最多14個唾液酸。
隨著時間的推移，這些唾液酸殘基可能從蛋白質(zhì)上斷裂，從而暴露了可以被肝臟識別的半乳糖鏈。一旦肝臟識別到半乳糖鏈，蛋白質(zhì)就從血液中過濾掉了。因此，據(jù)信逐步增加每個EPO分子所含有的唾液酸，可以更好的避免半乳糖鏈的暴露，也相應的逐步增加了它的生物活性(通過檢測分離的相同分子量濃度的促紅細胞生成素提高正常老鼠的血細胞比容的能力方法)。由于未修飾的EPO僅含有14個唾液酸位點，這樣的結(jié)構(gòu)限制了EPO半衰期的延長。這導致了如下假說即工程化的含有額外寡糖鏈的EPO類似物可能具有更強的生物學活性。通過提供額外的糖基化位點，含有末端的額外的寡糖鏈可以被唾液酸殘基修飾。參見PCT公開號為WO91/05867，WO94/09257和WO01/81405的申請。
例如，修飾的EPO類似物可以至少含有一個額外的N-連接的糖鏈和/或至少—個額外的O-連接的糖鏈。特別是在WO01/81405中公開了在分子的30、51、57、69、88、89、136和/或138位點的氨基酸處增加N-連接的糖鏈。修飾過的EPO分子可以在任何位置含有1-4個額外的糖基化位點，使得EPO分子可以增加2-16個唾液酸殘基。
雖然這些增加EPO血清半衰期的努力已經(jīng)被證明是成功的并且在保持血細胞比容水平上證明是有用的，但是卻沒有注意到這些額外的糖基化位點對EPO的其它功能可能產(chǎn)生的影響。
因此，需要提供延長了血清半衰期(長效)并保持了內(nèi)源性EPO的功能的經(jīng)修飾的EPO。特別的，本領域內(nèi)需要一種長效的EPO化合物，其具有促紅細胞功能和組織保護功能，用于治療貧血和/或相關(guān)疾病的藥物組合物。另外，人們還需要用于確定一種特定的EPO對內(nèi)源性EPO的組織保護能力是否具有拮抗性的檢測方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)人類血細胞比容水平的方法，包括提供一種比重組人類促紅細胞生成素(rhuEPO)有更長血清半衰期的、具有組織保護功能的促紅細胞生成素產(chǎn)品的步驟和施用治療有效量的該促紅細胞生成素產(chǎn)品的步驟。在一個技術(shù)方案中，提供促紅細胞生成素產(chǎn)品的步驟還包含使用至少一種化學修飾在至少—個N-連接的寡糖鏈或O-連接的寡糖鏈上修飾重組EPO的步驟，這里所述的化學修飾包括氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化或它們的組合。
另外，施用治療有效量的促紅細胞生成素產(chǎn)品的步驟，可以包含施用低于rhuEPO摩爾量的該促紅細胞生成素產(chǎn)品，以達到相當?shù)难毎热荨?br> 在一個技術(shù)方案中，其血清半衰期至少比rhuEPO的血清半衰期長20％。在另一個技術(shù)方案中，其血清半衰期至少比rhuEPO的血清半衰期延40％。
本發(fā)明也涉及人造促紅細胞生成素產(chǎn)品，其包含至少一種促紅細胞生成素衍生物，其中至少一個N-連接的寡糖鏈或至少一個O-連接的寡糖鏈上有至少一種化學修飾所述化學修飾來源于氧化、硫化、磷酸化、PEG化或它們的組合，這里所述的促紅細胞生成素產(chǎn)品具有比rhuEPO更長的血清半衰期。該促紅細胞生成素產(chǎn)品最好具有組織保護功能。
在一個技術(shù)方案中，至少一種化學修飾包括至少一個N-連接的寡糖鏈或至少一個O-連接的寡糖鏈氧化以提供至少一個額外的酸性殘基。例如，至少一種化學修飾可以包括在至少一個N-連接的寡糖鏈或至少一個O-連接的寡糖鏈的硫酸化以提供負電荷增加了的EPO產(chǎn)物。在另一個技術(shù)方案中，至少一種化學修飾包括至少一個N-連接的寡糖鏈或至少—個O-連接的寡糖鏈的磷酸化以提供負電荷增加了的EPO產(chǎn)物。在另一方面。至少一種化學修飾包括在至少一個N-連接的寡糖鏈或至少一個O-連接的寡糖鏈上增加聚乙二醇鏈。
本發(fā)明涉及一種制備具有延長的血清半衰期和組織保護功能的促紅細胞生成素的方法，包括如下步驟提供至少一種促紅細胞生成素或促紅細胞生成素的衍生物；在所述至少一種內(nèi)源性或重組的促紅細胞生成素的至少一個N-連接的寡糖鏈或至少一個O-連接的寡糖鏈上進行氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其組合方式的修飾。
修飾的步驟還可以包括將至少一個N-連接的寡糖鏈或至少一個O-連接的寡糖鏈上的至少一個鄰位羥基用至少一種酸殘基進行取代。在一個實施方案中，在至少一個N-連接的寡糖鏈或至少一個O-連接的寡糖鏈上的至少一個鄰位羥基用至少一種酸殘基進行取代的步驟還可以包括用至少多種酸殘基進行取代在至少一個N-連接的寡糖鏈或至少一個O-連接的寡糖鏈上的至少多個鄰位羥基。
在另一技術(shù)方案中，修飾的步驟還包括如下的步驟提供一種有機溶劑；在溶劑中溶解促紅細胞生成素或促紅細胞生成素的衍生物以形成溶液；提供至少一種縮合劑；提供至少一種硫酸鹽供體；并且將至少一種縮合劑和至少一種硫酸鹽供體混合到上述的溶液中去。在另一個技術(shù)方案中，修飾的步驟還包括如下的步驟提供一種有機溶劑；將所述促紅細胞生成素或促細紅胞生成素衍生物溶解到所有有機溶劑中的形成溶液；提供至少一種縮合劑；提供磷酸；并且將至少一種縮合劑和至少一種磷酸混合到上述的溶液中去。
在另一個技術(shù)方案中，修飾的步驟還包括如下的步驟提供一種有機溶劑；在該有機溶劑中溶解促紅細胞生成素或促紅細胞生成素的衍生物以形成第一溶液；提供至少一種氧化劑；將至少一種氧化劑加到第一溶液中以形成第二溶液；提供至少一種聚乙二醇鏈；將至少一種聚乙二醇鏈混合到第二溶液中去。提供至少一種聚乙二醇鏈的步驟可以包括提供在鏈的末端含有至少一個伯氨基團的至少一種聚乙二醇鏈。
本發(fā)明也涉及一種治療有組織損傷危險的病人的貧血的方法，其包括如下的步驟提供一種至少一個N-連接的寡糖鏈或至少一個O-連接的寡糖鏈上具有至少一種化學修飾的促紅細胞生成素產(chǎn)品，這里所述的化學修飾包括氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其組合；施用治療有效量的該促紅細胞生成素產(chǎn)品，這里所述的促紅細胞生成素產(chǎn)品的施用摩爾量低于rhuEPO，但可以達到相當?shù)哪繕搜毎热?，這里所述的促紅細胞生成素產(chǎn)品具有組織保護功能。
在本發(fā)明的這一方面，該促紅細胞生成素產(chǎn)品優(yōu)選具有比rhuEPO的血清半衰期長的半衰期。在一個實施方案中，其血清半衰期至少比rhuEPO的血清半衰期長20％。另一方面，其血清半衰期至少比rhuEPO的血清半衰期長40％。
本發(fā)明還涉及包括如下成分的藥物組合物至少—種治療有效量的促紅細胞生成素的衍生物，其至少一個N-連接的寡糖鏈或至少一個O-連接的寡糖鏈上有至少一種化學修飾，所述化學修飾來源于氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其組合方式，這里所述的至少一種促紅細胞生成素的衍生物具有比重組紅細胞生成素更長的血清半衰期并且具有組織保護功能。在一個實施方案中，該藥物組合物還包含至少一種藥學上可接受的載體。該至少—種藥學上可接受的載體可以包含至少一種稀釋劑、佐劑、賦形劑、載體、或其組合。
在另一個實施方案中，該該藥物組合物還包含至少一種潤濕劑、乳化劑、pH緩沖劑、或其組合。在另一個實施方案中，該該藥物組合物還包含至少一種組織保護因子。


本發(fā)明進一步的特征和優(yōu)點在結(jié)合下述附圖進行的詳細描述之后將變得更清楚，有關(guān)的附圖描述如下FIG.1A是不同形式的EPO對于暴露在三甲基錫中引起的細胞死亡的保護作用有效性的比較；和FIG.1B是不同形式的EPO對于暴露在三甲基錫中引起的細胞死亡的保護作用有效性的比較。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及具有延長了的血清半衰期(長效)的EPO分子的應用，對所述EPO分子用糖鏈進行化學修飾從而得以保持內(nèi)源性EPO的功能。正如在背景技術(shù)中描述的那樣，延長EPO半衰期的努力，通常集中在給EPO分子增加額外的糖鏈以防止半乳糖鏈的暴露。但是據(jù)信，增加的糖鏈影響了EPO類似物的功能，從而使得，例如，該功能被損害以獲得較長半衰期。雖然已知的比重組EPO具有更長半衰期的EPO類似物具有紅細胞生成活性，但這些類似物沒有保留最近發(fā)現(xiàn)的EPO的其它治療功能，如，組織保護活性。
例如，對應于EPO的30-47位的17個氨基酸的片斷，也被稱為O’Brien肽，已經(jīng)在體外顯示具有組織保護活性，但是在體外卻沒有促紅細胞活性。Campana，W.M.，Misasi，R.&O’Brien，J.S.，Int.J.Mol.Med.，1，235-41(1998)。因此，據(jù)信在O’Brien肽內(nèi)具有額外的糖基化位點的修飾過的EPO分子在其它體外試驗中不具備組織保護活性。另外，因為EPO分子的三維取向?qū)τ谄涔δ芷鹬匾饔?，增加的糖基化位點可能影響分子的整體功能。
因此，本發(fā)明涉及長效的EPO，其具有紅細胞生成活性、組織保護活性、胞吞轉(zhuǎn)運(transcytosis)能力中的至少一種或其組合。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的長效EPO具有組織保護活性、胞吞轉(zhuǎn)運作用中的至少一種以及紅細胞生成活性。
在一個具體的方案中，本發(fā)明所述的長效EPO具有比重組EPO長至少約20％的血清半衰期。在另一個實施方案中，本發(fā)明所述的長效EPO具有比重組EPO長至少約30％的血清半衰期。在又—個實施方案中，本發(fā)明所述的長效EPO具有比重組EPO長至少約40％的血清半衰期。
簡單的說，與天然(內(nèi)源性)EPO，優(yōu)選與天然的人類EPO相比，本發(fā)明所述的長效EPOs包括帶有通過至少一種修飾而改變的糖鏈的EPO分子。在一個實施方案中，本發(fā)明所述的長效EPOs經(jīng)過對糖鏈的多種修飾。
在一個實施方案中，把天然EPO糖鏈的鄰位(vicinyl)羥基氧化成酸性殘基以制備本發(fā)明所述的長效EPO分子。在另一個實施方案中，用更穩(wěn)定的酸性殘基取代EPO分子上的唾液酸殘基。在又一個實施方案中，對EPO糖鏈的硫化和/或磷酸化會產(chǎn)生本發(fā)明所述的長效EPO。在再一個實施方案中，可以在EPO糖鏈加上聚乙二醇以獲得本發(fā)明所述的長效EPO。前述修飾的任意組合也包括在本發(fā)明中。并且，正如前面提到的那樣，本發(fā)明還包含組合物，包括藥物組合物，其包含一種或幾種前面提到的長效EPO分子。
本發(fā)明所述的長效EPO分子預期應用于藥物組合物中，該藥物組合物可以治療貧血及相關(guān)疾病、尤其是由包括但不限于急性腎衰竭、膿血癥、HIV、化療等等疾病所引發(fā)的并發(fā)癥。
本發(fā)明也涉及治療貧血及相關(guān)疾病的方法，同時涉及一種用于治療過程的試劑盒。這里用到的術(shù)語“治療”指藥物治療和預防或防護的措施，其目的是為了防止或減緩(減少)靶向的病理狀況或失調(diào)。那些需要治療的對象包括已經(jīng)患有該失調(diào)(disorder)的對象，以及那些易感該失調(diào)的對象，或那些有待于對該失調(diào)進行預防的對象。本發(fā)明包括該長效EPO可用于慢性給藥、急性治療、和/或間斷性給藥。為了本文的目的，“慢性給藥”是指相對于急性給藥模式而言以連續(xù)的模式給藥，以利于長期保持起始治療效果(活性)，“間斷性給藥”不是無間斷地連續(xù)進行的，而是循環(huán)進行的。
本發(fā)明所述的長效EPO，和其用途，可以應用于任何哺乳動物。在這里，術(shù)語“哺乳動物”是指任何分類在哺乳類的動物，包括人類、馴服的和圈養(yǎng)的動物，和動物園的、比賽用的、或?qū)櫸?，如狗、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔子等。優(yōu)選的哺乳動物是人。本發(fā)明所述的長效EPO的給藥包括但不限于，口服、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、局部、腔內(nèi)、吸入或非腸胃給藥，后者包括靜脈、動脈、皮下、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、黏膜下層、皮內(nèi)，及其組合方式。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述的長效EPO的應用，其作為其它分子進入體內(nèi)具有EPO受體的區(qū)域的載體。例如，因為一些分子具有低的血腦屏障穿透能力，將這些分子與本發(fā)明所述的長效EPOs分子連接，就為這些分子進入腦部提供了一個安全有效的轉(zhuǎn)運體系。并且，隨后將詳細討論，因為身體的其它區(qū)域表達EPO受體，如視網(wǎng)膜、心臟、和肺，本發(fā)明所述的長效EPO可以為對于在這些區(qū)域穿透力低的分子擔當起轉(zhuǎn)運體系的角色。
進一步，本發(fā)明涉及確定特定的EPO是否保持了內(nèi)源性EPO的功能的檢測方法。例如，本發(fā)明所述的檢測可以確定修飾過的EPO是否具有組織保護活性，也就是內(nèi)源性EPO的激動劑。在這里，術(shù)語“激動劑”用于其最寬的含義，包括那些模擬天然EPO生物活性的分子。用同樣的方式，術(shù)語“拮抗劑”最廣義上講包括那些部分或全部阻斷、抑制、或中和天然EPO活性的分子。在一個實施方案中，在體外分析中檢測特殊EPO的存在，如P19細胞和/或老鼠運動神經(jīng)元分析。在另—個實施方案中，本發(fā)明所述的檢測包括評價特殊EPO在體內(nèi)的活性，使用各種不同的分析方法如大鼠定點局部缺血、大鼠視網(wǎng)膜缺血、脊椎損傷、和荷包牡丹堿發(fā)作模型。
功能正如在背景技術(shù)部分描述的那樣，為了增加EPO半衰期的各種嘗試已經(jīng)成功，因為其得到了具有較長半衰期和保持促紅細胞生成活性的EPO類似物。并且，正如描述的那樣，具有較長半衰期的EPO類似物主要包括在其氨基酸序列上增加額外糖鏈的EPO分子。但是可以預見到，增加的糖鏈可能影響EPO的其它治療活性，如組織保護功能和分子胞吞轉(zhuǎn)運作用。不受任何特別的理論的局限，基于O’Brien肽對組織保護功能的重要性，在O’Brien肽上增加糖鏈，可能影響其功能。另外，增加的糖鏈，不論是在O’Brien肽內(nèi)或之外，據(jù)信都會影響到分子的三維取向。例如，在分子的三維構(gòu)型中，增加的糖鏈可能阻斷分子中對其功能來說必不可少的區(qū)域。進一步的，據(jù)信糖基化的方法(或增加糖鏈)可能也會影響到糖蛋白的功能。
組織保護能力為了評價增加的糖鏈影響糖蛋白功能的可能性，本發(fā)明人研究了各種形式的具有5個N-連接糖鏈(相比于重組EPO的3-個N-連接的糖鏈)的EPO類似物。具體說來，本發(fā)明人使用了EPO類似物，所述類似物在32位氨基酸處有額外的糖基化位點，其導致了比重組EPO(epoetinα)延長了約3倍的半衰期。
雖然該EPO類似物在全身注射后在腦脊髓液中出現(xiàn)(圖1A)，但在隨后的體外P19檢測(圖1B)中驚奇的發(fā)現(xiàn)沒有組織保護活性。這種組織保護活性的缺失是意外的。另外，如果這些病人有需要組織保護能力的其它病況的話，組織保護活性的缺失可能會在治療貧血病人時引起并發(fā)癥。例如，如果這些沒有組織保護活性的EPO類似物與有組織保護活性的內(nèi)源性EPO競爭那些引發(fā)組織保護應答的受體，由損傷產(chǎn)生的受傷程度可能會由于這樣的EPO的作用而實際上被加重。事實上，如果遭受中風的病人施用這樣的EPO類似物，相比較于沒有使用EPO類似物治療的個體來說，由中風引起的梗塞體積實際上可能會更大。
不受束縛于任何特殊的理論，這些發(fā)現(xiàn)揭示了至少一種額外的EPO受體類型功能性地存在于神經(jīng)組織中，其發(fā)出的信號不同于紅細胞前體所發(fā)出的信號，存在某種EPO類似物可能拮抗內(nèi)源性EPO與這種形式的受體結(jié)合的能力的危險。內(nèi)源性EPO和這些EPO類似物的明顯不同的生物活性揭示了受體是通過相應于EPO分子不同結(jié)構(gòu)域的功能差異EPO受體產(chǎn)生信號的。事實上，雖然已經(jīng)報道EPO受體基因蛋白質(zhì)序列與紅細胞前體所表達的相同，但在體外，神經(jīng)型EPO受體的結(jié)合親和力大大低于前紅細胞的EPO受體。參見，例如Masuda，S.，等，J Biol Chem，268，11208-16(1993)?？赡埽@些不同是由輔助蛋白引起的，并且可能表明其中所用到的信號傳導途徑不同于紅細胞成熟過程中活化的途徑。有趣的是，這種親和力上的不同不會被EPO的完全去糖基化所修飾，如果在正常的非糖基化的EPO的AB環(huán)域出現(xiàn)神經(jīng)活性結(jié)合的話，這就并非是一個意外的結(jié)果。此外，由星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的EPO(可能是與其他細胞例如神經(jīng)元所產(chǎn)生的相同的產(chǎn)物)也比由腎所產(chǎn)生的要小。Masuda，S.，J.Bio Chem，269，19488-93(1994)。這種差異似乎是由糖基化程序的差異引起的。脫唾液酸的天然配體與這些已知受體蛋白的親和力是否有差異尚未確定，但是明顯是有關(guān)系的。
除了存在EPO受體修飾的輔助蛋白，EPO受體是一個復雜的基團，存在多種改變形式，包括截短的可溶受體。Yamaji，R.，等，Eur J Biochem，239，494-500；Yamaji，R.，等，Bichim Biophys Acta，1403，169-78(1998)；Barron，C.，等，Gene，147，263-8(1994)；Chin，K.，等，Brain Res Mol Brain Res，81，29-42(2000)；Fujita，M.，等，Lukemia，11Suppl 3，444-5(1997)；Westenfelder，C.，Biddle，D.L.Baranowski，R &.L.，KidInternat.，55，808-820(1999).是否任何這樣的形式都促進EPO的神經(jīng)活性仍然還沒被確定。
進一步，如在背景技術(shù)中討論的那樣，O’Brien肽在體外表現(xiàn)出組織保護活性，但在體外卻沒有促紅細胞生成活性。事實上，對在O’Brien肽內(nèi)包含加入的糖鏈的EPO類似物進行的分析表明該EPO類似物缺失組織保護功能。這一結(jié)果暗示對O’Brien肽的某種修飾，如增加糖鏈，影響了蛋白的功能。O’Brien肽修飾的EPO類似物可能扮演著對位于體內(nèi)的內(nèi)源性EPO的拮抗劑的作用，因為其部分的或全部的阻斷內(nèi)源性EPO結(jié)合EPO受體的能力。因此，這樣的EPO類似物的使用有著導致由損傷引起的受傷程度增加的危險。因此，在其它體外的檢測，例如大鼠運動神經(jīng)元檢測，以及體內(nèi)檢測例如大鼠定點局部缺血檢測，荷包牡丹堿發(fā)作檢測，大鼠視網(wǎng)膜局部缺血檢測，和脊髓損傷檢測中，據(jù)信在O’Brien肽上修飾過的EPO類似物將會缺失組織保護能力。
使用上述的相同EPO類似物，也就是具有5個N-連接的糖鏈的EPO類似物(相比于重組EPO的3個N-連接的糖鏈)，發(fā)明人研究了該類似物穿過血腦屏障的能力。在全身注射后(圖1A和1B)，EPO類似物出現(xiàn)在腦脊液中。不受任何特殊理論的限制，據(jù)信該EPO類似物可以穿過完整血腦屏障，因為形成血腦屏障的毛細血管也表達EPO受體，并且為從外周循環(huán)到腦部的由受體介導的胞吞轉(zhuǎn)運作用提供了解剖學的基礎。這樣，其它全身施用的EPO類似物據(jù)信也能夠穿過血腦屏障，以及其它具有表達EPO受體的毛細血管的屏障。
總的說來，因為現(xiàn)有技術(shù)中的EPO類似物在犧牲內(nèi)源性EPO的至少某些功能的情況下保持促紅細胞生成的活性，本領域需要一種長效的EPO，其能夠保持內(nèi)源性EPO已知的全部功能。具有優(yōu)勢的，本發(fā)明所述的長效EPO不僅增加了相對于重組EPO較長的血清半衰期，而且保持了內(nèi)源性EPO的全部功能，即組織保護功能和胞吞轉(zhuǎn)運能力。下面的部分中提供了用于獲得此類有益蛋白質(zhì)的多種修飾EPO的方法。
天然EPO的修飾本發(fā)明所述的長效EPO可以用各種方法來制備?？偟恼f來，長效EPO可以通過化學修飾連接在EPO上的糖鏈來獲得。這里，術(shù)語“糖鏈”是指存在于內(nèi)源性EPO上的N-連接和O-連接的寡糖鏈，存在于EPO類似物上的增加的N-連接和O-連接的寡糖鏈，和連接在EPO上的任何其他糖鏈，尤其是糖鏈(Sugar chains)。
在—個技術(shù)方案中，內(nèi)源性或重組EPO被修飾以阻止對內(nèi)源性EPO的組織保護能力的任何干擾。另外，根據(jù)本發(fā)明，考慮了對EPO類似物進行修飾以提供額外的糖基化位點，其并不位于O’Brien肽，即30-47位的氨基酸序列附近。這里，術(shù)語“EPO類似物”是指被修飾的EPO分子，其具有至少1個增加的的N-連接的糖鏈和/或至少1個增加的O-連接的糖鏈。在一個實施方案中，用于修飾的EPO類似物在O’Brien肽的5個氨基酸內(nèi)不含有任何增加的糖基化位點。在另一個實施方案中，該EPO類似物在O’Brien肽的3個氨基酸內(nèi)不含有任何增加的糖基化位點。在又—個實施方案中，該EPO類似物在O’Brien肽內(nèi)不含有任何增加的糖基化位點，EPO類似物也可以用于如本發(fā)明所述的修飾，前提是應在三維空間上考慮該類似物并且確認增加的糖鏈沒有阻礙到O’Brien肽或降低了組織保護能力。另一方面，考慮了將EPO類似物用于本發(fā)明的修飾，前提是糖基化方法不會抑制該肽的組織保護功能。在又一個方面，按照本發(fā)明提供的修飾方法修飾的EPO類似物，在O’Brien肽有—個糖鏈(或更少)。例如，內(nèi)源性EPO在38位氨基酸處有一個糖鏈，并且在O’Brien肽內(nèi)的額外的糖鏈已被證明抑制該蛋白的組織保護功能。因此，在O’Brien肽上有—個或沒有糖鏈的EPO類似物可以用于修飾。在一個實施方案中，結(jié)合在38位氨基酸處的糖鏈可以重新連接到該肽的其它位置。
根據(jù)本發(fā)明所述的修飾方法的非限制性實例包括(1)通過鄰位羥基的氧化作用在糖鏈上提供額外的酸性殘基；(2)用更穩(wěn)定的殘基取代唾液酸殘基；(3)通過硫酸化和/或磷酸化增加促紅細胞生成素的負電荷；和/或(4)用更復雜的分子終止糖鏈。因此，對EPO糖鏈的修飾可以包括氧化、硫酸化、磷酸化、和/或PEG化以及其它的步驟，它們將在后面詳細的描述，并且在實施例1中進一步的舉例說明。
糖鏈的氧化和唾液酸殘基的取代化學修飾的本發(fā)明所述的長效EPO可以包括在EPO的糖鏈(糖)上氧化以提供額外的酸性殘基。一方面，可以用更穩(wěn)定的酸性殘基取代唾液酸殘基。這種類型的修飾相對于內(nèi)源性EPO而言導致了分子半衰期的增加，這是因為肝臟篩選半乳糖鏈并將相關(guān)蛋白從循環(huán)系統(tǒng)中除去，而此時半乳糖鏈被保護起來使之不被檢測到。在EPO糖鏈上更顯著的修飾導致本發(fā)明所述的長效EPOs的血清半衰期更多的延長。例如，當更多的鄰位羥基被酸取代后，導致了血清半衰期更多的延長。
盡管本領域的普通技術(shù)人員知道幾種合適的用于改變促紅細胞生成素的半乳糖單元的方法，一種合適的方法包括(1)將具有鄰位羥基的糖分子用高碘酸鹽氧化成醛；和(2)將醛氧化成酸。適合將糖鏈氧化成醛的試劑對于本領域內(nèi)普通技術(shù)人員來說是熟知的，包括但不限于，高碘酸鹽，如高碘酸鈉，和糖氧化酶，如半乳糖酶。另外，技術(shù)人員知道合適的試劑來轉(zhuǎn)化醛，如定量本尼迪特試劑(Kuantitative Benedict Solution)(可以從Fisher購得)。另一方面，糖分子可以被高碘酸鈉氧化，進一步用定量本尼迪特試劑(Fisher)處理將醛轉(zhuǎn)化成酸。
另一方面，EPO異構(gòu)體，其具有約0-13個唾液酸殘基，或EPO類似物，其至少一條糖鏈缺失唾液酸殘基，被半乳糖酶氧化。脫唾液酸形式的EPO可以用于本發(fā)明的這一方面，即末端糖基(唾液酸)去除的α或β形式的EPO。優(yōu)選的使用脫唾液酸的促紅細胞生成素。一旦EPO被氧化，使用其他的氧化劑如定量本尼迪特試劑將醛轉(zhuǎn)化成酸。
再一方面，四氧化釕可以用來生成糖鏈上的酸。由于這些修飾中涉及半乳糖鏈，即使在轉(zhuǎn)換中涉及的酸從EPO分子中被除去，該分子應該仍然能夠躲避肝臟的清除，因為肝臟所篩查的成分半乳糖鏈將不會被暴露。
增加負電荷本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明所述的長效EPO可以通過在EPO分子上添加硫酸鹽和/或磷酸鹽來制備，它將會增加分子的負電荷，從而增加分子的半衰期。也就是說，EPO分子的負電荷可以通過硫酸化來增加，其涉及了從硫酸鹽供體包括蛋白質(zhì)，糖脂，葡糖胺聚糖和類固醇來轉(zhuǎn)移磺基。并且，還可以通過將磷酸基團引入到糖中來增加負電荷。
一種合適的用于硫酸化胰島素的方法描述在S.Pongor等，Preparation ofHigh-Potency，Non-aggregating Insulins Using a Novel Sulfation Procedure，Diabetes，Vol.32，No.12，December 1983。例如，胰島素的硫酸化可以在有機溶劑中，如二甲基甲酰胺(DMF)，在縮合劑存在的情況下，如N，N’-二環(huán)己基二亞胺(DCC)，和硫酸鹽供體進行。硫酸化的程度可以通過改變縮合劑的量來控制在8倍范圍內(nèi)。盡管傳統(tǒng)制備的硫酸化的胰島素導致其喪失了胰島素的主要生物活性，使用Ponger程序制備的硫酸化胰島素的生物活性在未被修飾胰島素的78％到87％之間。
類似的步驟用于EPO，本領域的普通技術(shù)人員可以控制硫酸化的量從而控制化學修飾的EPO的血清半衰期。例如，可以通過將EPO或EPO類似物溶解在至少一種水溶性碳二亞胺優(yōu)選為DCC之中，溫度約為4℃，而將硫酸加入到蛋白質(zhì)中，從而增加EPO的負電荷。DCC是優(yōu)選的硫酸鹽供體，本領域的技術(shù)人員易知其它的用于本發(fā)明合適的硫酸鹽供體。
相似的步驟可用于控制EPO的磷酸化，使用磷酸(H3PO4)作為磷酸供體。還有，雖然優(yōu)選磷酸，但技術(shù)人員能夠容易的選擇其它的磷酸供體來對EPO磷酸化。
糖鏈末端使用PEGs終止EPO的糖鏈也可以通過增加至少一種聚乙二醇(PEG)來修飾，其具有悠久的安全的臨床歷史，分子式如下 PEG也可以是甲氧基化PEG(mPEG)，具有如下的分子式 在一個實施方案中，PEG是氨基PEG，優(yōu)選在甲基化PEG的末端具有伯氨基團(mPEG-NH2)。末端具有伯氨基團的PEG鏈是非常有用的功能化多聚物。mPEG-NH2氨基端的基團比一般PEGs的羥基更傾向于發(fā)生?；磻⑶宜鼈円踩菀装l(fā)生氨基還原反應(reductive amination reactions)。在另一個實施方案中，PEG是親電子活化的PEG，如mPEG-琥珀酸丙酯(mPEG-SPA)或mPEG-琥珀酸丁酯(mPEG-SBA)，它們都可以從Nektar Therapeutics ofBirmingham，Alabama公司購得。在又一個實施方案中，PEG是甲氧基化的PEG—酰肼。
另一方面，可以通過高碘酸鹽(上述討論的)的氧化作用，隨后使用氰基硼氫化物和氨基PEG來增加至少一個PEG。例如，溶液中的EPO首先用高碘酸鹽氧化，如高碘酸鈉，在室溫下反應預先設定的一段時間，在糖鏈上產(chǎn)生醛。—種合適的高碘酸鹽是間高碘酸鈉，可以從Sigma公司購得。高碘酸鹽然后被緩沖交換去除，與此同時，EPO的N-連接的寡糖鏈上的氧化的唾液酸基團可在氰基硼氫化物存在的情況下至少與—個氨基PEG接觸?？捎玫倪m合的PEG包括但不限于，甲氧基化PEG-酰肼，其可以從Nektar Therapeutics ofBirmingham，Alabama公司購得。
另一方面，在用半乳糖酶氧化后，可以通過將PEG基團連接到末端的半乳糖殘基來增加至少一個PEG。例如，緩沖液中的脫唾液酸形式的EPO(暴露了末端的半乳糖殘基)首先與半乳糖氧化酶(從Sigma公司購得)接觸以在糖鏈中產(chǎn)生醛。然后通過緩沖交換去除緩沖液，同時，在有氰基硼氫化物存在的情況下將氧化的半乳糖殘基與至少一種氨基PEG接觸。
上面所述的方法并不是限制性的，其它的方法也可以用于制備本發(fā)明的化合物。例如，技術(shù)人員可以認識到可以將這些化學修飾用于制造其它EPO衍生物的長效形式如在國際公開號WO/02053580和美國專利公開號2002/0086816和2003/0072737中公開的組織保護細胞因子，在此整體引入本發(fā)明作為參考。
制備EPO分子各種宿主表達載體系統(tǒng)可以用于生產(chǎn)本發(fā)明所述的長效EPO和EPO相關(guān)分子。此類宿主表達載體代表了一類載體(vehicle)，通過這些載體，感興趣的長效EPO得以生產(chǎn)出來并隨后被純化；也代表了一類細胞，當所述細胞被適當?shù)暮塑账峋幋a序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時，可以原位表達經(jīng)修飾的促紅細胞生成素基因產(chǎn)物。這些包括但不限于，細菌，昆蟲，植物，哺乳動物宿主系統(tǒng)，例如但不限于，用含有編碼長效EPO產(chǎn)物的序列的重組病毒表達載體(如棒狀病毒)感染的昆蟲細胞體系；用含有編碼促紅細胞生成素相關(guān)分子的序列的重組質(zhì)粒表達載體(如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化或重組病毒表達載體(如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)轉(zhuǎn)染的植物細胞系統(tǒng)；或哺乳動物細胞體系，包括人類細胞體系，如HT1080，COS，CHO，BHK，293，3T3，其中含有重組表達構(gòu)建體，所述構(gòu)建體中含有來源于哺乳動物細胞基因組的啟動子，如金屬硫蛋白啟動子，或來源于哺乳動物病毒的啟動子，如腺病毒晚期啟動子，牛痘病毒7.5K啟動子。
另外，選擇的宿主細胞株可以調(diào)控插入序列的表達，或以期望的特有方式修飾和加工基因產(chǎn)物。蛋白產(chǎn)物的這樣的修飾和加工，對于蛋白的功能而言可能是非常重要的。本領域的技術(shù)人員知道不同的宿主細胞具有特定的蛋白和基因產(chǎn)物翻譯后加工和修飾的機制?？梢赃x擇合適的細胞系或宿主體系以保證對表達的外源蛋白進行正確的加工和修飾。在這一點上，具有用于初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的正確加工，基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細胞機制的真核宿主細胞可以使用。這樣的哺乳動物宿主細胞包括人類宿主細胞，其包括但不限于HT1080，CHO，VERO，BHK，HeLa，COS，MDCK，293，3T3，和WI38。
為了長期、高產(chǎn)量的產(chǎn)生重組蛋白，優(yōu)選穩(wěn)定的表達體系。例如，可以工程化穩(wěn)定表達重組的組織保護細胞因子相關(guān)分子的基因產(chǎn)物的細胞系。不使用含有病毒復制起點的表達載體，宿主細胞可以用被合適的表達調(diào)控元件所控制，如啟動子，增強子，序列，轉(zhuǎn)錄終止子，多聚腺苷酸位點等的DNA，以及選擇性標記轉(zhuǎn)化。引入外源DNA之后，工程化的細胞可以在營養(yǎng)豐富的的培養(yǎng)基中生長1到2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的選擇性標記使之具有選擇抗性，并且允許將質(zhì)粒穩(wěn)定的整合到細胞的染色體中，并生長成點(foci)，其隨后可被克隆被擴增到細胞系中。這種方法可有利地被用于工程化表達EPO突變蛋白相關(guān)分子的基因產(chǎn)物的細胞系。這樣的工程化細胞系在篩選和評價那些影響EPO相關(guān)分子基因產(chǎn)物的內(nèi)源性活性的化合物中可能是特別有用的。
或者，細胞系或微生物中內(nèi)源性EPO突變蛋白基因的表達特征可以通過在穩(wěn)定細胞系或克隆微生物基因組中插入異源DNA調(diào)控單元以至于插入的調(diào)控單元有效的連接在內(nèi)源性促紅細胞生成素突變蛋白的基因上而被修飾。例如，內(nèi)源性EPO突變蛋白基因其通常是“轉(zhuǎn)錄沉默的”，即通常不表達EPO基因，或在細胞系中表達的水平非常低，其可以通過在所述細胞系或微生物中插入能夠促進基因產(chǎn)物表達的調(diào)控序列?；蛘?，可以通過插入能在多種細胞類型中起作用的混合調(diào)控單元來激活轉(zhuǎn)錄沉默的內(nèi)源性EPO基因。
異源調(diào)控單元可以插入到穩(wěn)定的細胞系或克隆微生物中，使之能夠有效的連接到內(nèi)源性促紅細胞生成素蛋白的基因上，使用的技術(shù)，如靶向同源重組，對本領域技術(shù)人員來說是熟知的，并且在法國專利號2646438，美國專利號4,215,051和5,578,461，和國際公開號WO93/09222和WO91/06667中有描述，其公開的內(nèi)容在此整體引入。
藥物組合物本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明所述的長效EPO的藥物組合物。因為本發(fā)明所述的長效EPOs有利的具有促紅細胞生成活性以及組織保護能力和胞吞轉(zhuǎn)運能力，預期它們可以治療同時也有各種組織損傷的危險如中風和心急梗塞的個體的貧血及相關(guān)疾病。另外，預期本發(fā)明所述的長效EPOs可用于治療同時也經(jīng)歷了精神系統(tǒng)惡化如老年性癡呆、帕金森等疾病的個體的貧血和相關(guān)疾病。進一步的，本發(fā)明所述的長效EPOs可以用來治療遭受了由正常老化過程產(chǎn)生的病況(如導致跌倒的平衡問題、容易挫傷等)的個體的貧血。還有，本發(fā)明涉及本發(fā)明所述的長效EPOs作為其它分子載體的應用，其中所述分子難于穿透具有EPO受體的毛細血管的屏障。
例如，前述任何的長效EPOs可以被包含在本發(fā)明所述的藥物組合物中。另外，各種形式的EPO類似物可以被包含在本發(fā)明所述的藥物組合物中，并與至少一種組織保護性細胞因子混合，后者將在后面詳細的討論。
本發(fā)明所述的藥物組合物含有治療有效量的經(jīng)修飾的EPO，優(yōu)選為以純化的形式存在。制劑應當與給藥模式相適應。制成便于施用的形式。換句話說，本發(fā)明所述的藥物組合物包含一定量的本發(fā)明所述的經(jīng)修飾的EPO，從而使得在使用了正確的劑量和策略的情況下，其靶向的病況可以被治療。并且，后面將詳細討論，藥物組合應當以非毒性劑量施用。
本發(fā)明所述的藥物組合物可以含有治療有效量的長效EPO化合物和合適量的藥學上可接受的載體，以便提供能夠正確向病人給藥的形式。在一個具體實施方式
中，術(shù)語“藥學上可接受的”是指經(jīng)聯(lián)邦或州政府的管理機構(gòu)批準或列在美國藥典或其它公認的用于哺乳動物，尤其是人的外國藥典上的。術(shù)語“載體”是指與治療劑一同施用的稀釋劑，佐劑，賦形劑或藥載體。這樣的藥物載體可以是無菌液體，如水和油的鹽溶液，包括石油，動物，植物或合成的來源的，如花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等。當藥物組合物靜脈施用時，鹽溶液是優(yōu)選的載體。鹽溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可以作為液體載體，特別是作為注射用溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，凝膠，麥芽，大米，面粉，白堊，硅膠，硬脂酸鈉，單硬脂酸甘油，滑石，氯化鈉，干粉脫脂牛奶，甘油，丙二醇，水，乙醇等。
本發(fā)明所述的藥物組合物也可以含有少量的潤滑劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可以制成溶液，懸浮液，乳化液，片劑，丸劑，膠囊，粉劑，緩釋劑等形式。
本發(fā)明所述的組合物可以制成中性或鹽的形式。藥學上可接受的鹽包括那些與自由氨基形成的鹽，如來源于鹽酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等的鹽，以及那些與自由羧基生成的鹽，如那些來源于鈉，鉀，銨，鈣，氫氧化鐵，異丙基胺，三乙基胺，2-乙胺乙醇，組氨酸，普魯卡因等的鹽。
含有長效EPO的組合物如前所述，任何本發(fā)明所述的長效EPO可用于藥物組合物中。在—個實施方案中，由鄰位羥基氧化而產(chǎn)生的長效EPO包含在本發(fā)明所述的藥物組合物中。在另一個實施方案中，本發(fā)明所述的藥物組合物包含至少一種長效EPO，其是用更穩(wěn)定的殘基取代唾液酸殘基產(chǎn)生的。在又一個實施方案中，包含在藥物組合物中的長效EPO是通過硫酸化和/或磷酸化增加EPO的負電荷而得到的。在再一個實施方案中，包含在本發(fā)明所述的藥物組合物中的長效EPO是通過用更復雜的分子如PEG鏈終止糖鏈而產(chǎn)生的，。
另外，本發(fā)明涉及用本發(fā)明所述任何方法產(chǎn)生的長效EPOs的混合物在本發(fā)明所述的藥物組合物中的用途。例如，本發(fā)明所述的藥物組合物可以包含至少一種用更穩(wěn)定的殘基取代唾液酸而形成的長效EPO，和至少一種通過硫酸化和/或磷酸化增加EPO的負電荷而形成的長效EPO。
轉(zhuǎn)運體系如前所述，本發(fā)明所述的長效EPOs有利地能夠跨越具有EPO受體的毛細血管的屏障。因此，本發(fā)明的在另一個實施方案中是轉(zhuǎn)運體系，其使用本發(fā)明所述的長效EPOs作為一些分子的載體，這些分子進入體內(nèi)含有EPO受體的靶向區(qū)域的屏障穿透能力較低。這樣的轉(zhuǎn)運體系優(yōu)先有利地提供了一種新的安全的跨越完整屏障的轉(zhuǎn)運方法。
在一個實施方案中，轉(zhuǎn)運系統(tǒng)包括本發(fā)明所述的長效EPOs和至少一種腦部穿透能力較低的分子，提供了一種新的安全的穿越完整血腦屏障的轉(zhuǎn)運方法。即，本發(fā)明所述的長效EPOs讓那些腦部穿透能力低的分子扮演了分子“特洛伊木馬”的角色，從而增強了腦部攝取小分子或大分子的診斷劑或治療分子的能力。
事實上，在治療人類腦部腫瘤中的一個重要問題來源于需要將治療劑傳送到腦部的特定區(qū)域，將其分布在腦部腫瘤其中并且靶向作用于腦部腫瘤。在其它情況下可能在診斷和治療中有效的分子，或是不能以足夠量穿過腦部緊鄰腫瘤的血腦屏障(BBB)，或是不能以足夠量穿過血瘤屏障(BTB)。因此，需要新的傳送策略，其專門針對腦部并且能穿過脈管系統(tǒng)。例如，用于診斷或治療的抗體分子，由于它們的大小而不能以足夠量穿過BTB。因此，本發(fā)明所述的長效EPOs可以作為載體，使這些分子穿越BBB或BTB。一個可與本發(fā)明所述長效EPOs—起使用的分子的例子是反義寡核苷酸，其典型的用于抑制致癌基因信號或?qū)δX部基因的體內(nèi)表達進行成像。另外，本發(fā)明所述的長效EPOs可以包含在各種基因治療劑中(病毒的或非病毒的制劑)，這些治療劑通常太大以致于在沒有輔助的情況下不能穿過BTB。
進一步的，本發(fā)明所述的長效EPOs可以用作各種化療劑的載體介導的轉(zhuǎn)運者。因為表達在BBB和BTB上的藥物活性流出(efflux)轉(zhuǎn)運者活躍地將化療劑從腦部流回到血內(nèi)，這些試劑在腦部的分布可能被抑制或阻止。部分地由于這些原因，大部分傳統(tǒng)的用來治療位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)外的癌癥的化療分子對于腦部腫瘤的治療不起作用。因此，使用本發(fā)明所述的長效EPO作為這些化療劑的載體，不僅在把試劑傳送到腦部方面是有用的，而且還可用于將試劑保持在腦部用于治療。在另一個實施方案中，該長效EPO可以與藥物一起使用，所述藥物抑制活性流出轉(zhuǎn)運者，以進一步的確保吸收這些通常從腦部回流到血液的化療劑。
另外，本發(fā)明也包括修飾過的EPO作為一些分子的載體的應用，這些分子在體內(nèi)表達EPO受體的其它區(qū)域具有低的穿透性。此類細胞的非限制性的例子包括視網(wǎng)膜、肌肉、心臟、肺、肝、腎、小腸、腎上腺皮質(zhì)、腎上腺髓質(zhì)、內(nèi)皮毛細血管、睪丸、卵巢、胰腺、骨、皮膚和子宮內(nèi)膜細胞。特別的，應答細胞包括但不限于，神經(jīng)元細胞；視網(wǎng)膜細胞光受體細胞(視桿細胞和視錐細胞)；神經(jīng)結(jié)，雙極細胞，水平細胞，無長突細胞和Müeller細胞；肌肉細胞；心臟細胞心肌細胞，搏起點細胞，竇房結(jié)細胞，結(jié)細胞，和交織組織(心房結(jié)與his束)細胞；肺細胞；肝臟細胞肝細胞，星型細胞，和Kupffer細胞；腎臟細胞腎小球，腎上皮細胞，和管狀間質(zhì)細胞；小腸細胞杯形細胞，腸腺(腺窩)和腸內(nèi)分泌細胞；腎上腺皮質(zhì)細胞腎小球細胞，束狀細胞，和網(wǎng)狀細胞；腎上腺髓質(zhì)細胞嗜鉻細胞；毛細血管細胞外膜細胞；睪丸細胞Leydig細胞，Sertoli細胞，和精子細胞及其前體細胞；卵巢細胞Graffian囊和原始卵泡細胞；胰腺細胞Langerhans胰島細胞，α-細胞，β-細胞，γ-細胞，和F-細胞；骨細胞骨原細胞，破骨細胞，和造骨細胞；皮膚細胞；子宮內(nèi)膜細胞內(nèi)膜基質(zhì)和內(nèi)膜細胞；和存在于上述器官中的干細胞和內(nèi)皮細胞。
混合了EPO類似物和組織保護細胞因子的組合物如前所述，本發(fā)明所屬的藥物組合物可以包含具有至少一個增加的N-連接的糖鏈和/或至少一個O-連接的糖鏈的EPO類似物(表現(xiàn)出延長的血清半衰期但缺失組織保護活性)與至少一種組織保護細胞因子的混合。例如，具有至少2個增加的N-連接的糖鏈的EPO類似物，其中一條糖鏈位于O’Brien肽上，與組織保護細胞因子一起，可以形成本發(fā)明所述的組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明所述的藥物組合物可以包含至少一種組織保護細胞因子和至少一種含有額外糖鏈的EPO，其中通過在三維空間中考慮該類似物，已知所述糖鏈阻斷了O’Brien肽。在又一個實施方案中，本發(fā)明所述的藥物組合物包含至少—種組織保護細胞因子和至少—種EPO類似物，所述EPO類似物由于采用了向蛋白質(zhì)中增加額外糖鏈的方法而導致其不具有組織保護功能。
具有重新定位的糖基化位點的EPO類似物預期可以用在本發(fā)明所述的藥物組合物中。不受限于任何特別的理論，據(jù)信如果在38位氨基酸處天然生成的糖基化位點被重定位于EPO類似物30-47位氨基酸片斷之外的其它位點，那么EPO類似物的組織保護能力相比于在38位具有糖基化位點的EPO類似物將會增強。因此，本發(fā)明所述的藥物組合物可以包含將38位氨基酸處的糖基化位點重定位在分子其它位點的EPO類似物。重定位的糖基化位點可能發(fā)生在51，57，69，88，89，136或138位上，如在PCT公開號WO01/81405中指出的那樣。在一個實施方案中，O’Brien肽含有1個或更少的糖鏈。在另一個實施方案中，O’Brien肽含有2個或更多的糖鏈。
用于本發(fā)明這方面的合適的組織保護細胞因子優(yōu)選那些缺失對骨髓的作用但保持內(nèi)源性組織保護作用的細胞因子，但是任何具有組織保護能力的細胞因子也可以用于本發(fā)明。例如，合適的組織保護細胞因子包含由胍化作用，脒化作用，氨基甲?；?甲氨?；?作用，苦味酸化作用，酰化作用(乙?；蜱牾；?，硝化作用，或其組合方式進行化學修飾而生成的EPOs。另外，至少一個精氨酸，賴氨酸，酪氨酸，色氨酸，半胱氨酸殘基或羥基基團被修飾的EPO分子預期也可用作根據(jù)本發(fā)明該方面的組織保護細胞因子。
還有，另外用于本發(fā)明的另外的組織保護細胞因子可以通過有限的蛋白水解、去除氨基和/或以分子生物學技術(shù)引入突變?nèi)〈彼?、賴氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基而獲得，所述分子生物學技術(shù)在Satake等，1990，Biochim.Biophs.Acta 1038125-9中公開，在此整體引入。例如，合適的組織保護細胞因子包括至少一個或多個突變的EPO，所述EPO在C7S，R10I，V11S，L12A，E13A，R14A，R14B，R14E，R14Q，Y15A，Y15F，Y15I，K20A，K20E，E21A，C29S，C29Y，C33S，C33Y，P42N，T44I，K45A，K45D，V46A，N47A，F(xiàn)48A，F(xiàn)48I，Y49A，Y49S，W51F，W51N，Q59N，E62T，L67S，L70A，D96R，S100R，S100E，S100A，S100T，G101A，G101I，L102A，R103A，S104A，S104I，L105A，T106A，T106I，T107A，T107L，L108K，L108A，S126A，F(xiàn)142I，R143A，S146A，N147K，N147A，F(xiàn)148Y，L149A，R150A，G151A，K152A，L153A，L155A，C160S，16A，C7A，B13A，N24K，A30N，H32T，N38K，N83K，P42A，D43A，K52A，K97A，K116A，T132A，1133A，T134A，K140A，P148A，R150B，G151A，K152W，K154A，G158A，C161A，和/或R162A上有點突變。上面所提到的修飾的實例在共同未決的美國專利公開號2003/0104998，2002/00861816和2003/0072737中進行了描述，在此全文引入作為參考。在本文使用的突變蛋白命名法中，被改變的氨基酸采用如下方式描述首先是天然氨基酸的單字母代碼，緊跟的是它在EPO分子中的位置，隨后是替換氨基酸的單字母代碼。例如，S100E是指在人類EPO分子中，將100位處的絲氨酸替換為谷氨酸。
在另一個實施方案中，組織保護細胞因子可以包含一個或多個上述點突變，前提是所述點突變不包括I6A，C7A，K20A，P42A，D43A，K45D，K45A，F(xiàn)48A，Y49A，K52A，K49A，S100B，R103A，K116A，T132A，I133A，K140A，N147K，N147A，R150A，R150E，G151A，K152A，K154A，G158A，C161A或R162A.
在又一個實施方案中，組織保護細胞因子可以包含點突變的組合，如K45D/S100E，A30N/H32T，K45D/R150E，R103E/L108S，K140A/K52A，K140A/K52A/K45A，K97A/K152A，K97A/K152A/K45A，K97A/K152A/K45A/K52A，K97A/K152A/K45A/K52A/K140A，K97A/K152AA/K45A/K52A/K140A/K154A，N24K/N38K/N83K，和N24K/Y15A。在再一個實施方案中，組織保護細胞因子不包括任一上述組合。在另一個實施方案中，組織保護細胞因子可以包含上述點突變的任何一種，前提是所述點突變不包括任何下述突變組合N24K/N38K/N83K和/或A30N/H32T。
某些修飾或修飾組合可以影響突變蛋白與其受體如EPO受體或第二受體結(jié)合能力的靈活性。此類修飾或修飾組合的例子包括但不限于，K152W，R14A/Y15A，I6A，C7A，D43A，P42A，F(xiàn)48A，Y49A，T132A，I133A，T134A，N147A，P148A，R150A，G151A，G158A，C161A，和R162A。對人類生長激素有害的相關(guān)突變對本領域的技術(shù)人員來說是熟知的。因此，在一個實施方案中，組織保護細胞因子不包含那些可能影響突變蛋白與其受體結(jié)合能力的靈活性的一種或多種修飾或修飾組合。對這樣的組織保護細胞因子的進一步的討論包含在共同未決的專利申請?zhí)枮椤?，律師案卷號?0165-022-999，申請日為2003年7月1日，名稱為“Recombinant Tissue Protective Cytokines andEncoding Nucleic Acid Thereof for Protection，Restoration，and Enhancement ofResponsive Cells，Tissues，and Organs”的美國專利申請，其全部公開的內(nèi)容引入這里作為參考。
最后，具有組織保護能力的任何細胞因子超家族都可以使用，只要其不影響長效EPO的促紅細胞生成活性或血清半衰期。實例包括但不限于，白介素-3(IL-3)，白介素-5(IL-5)，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)，色素上皮衍生因子(PEDF)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。
本發(fā)明的在另一個方面中，本發(fā)明所述的藥物組合物包含具有至少一個增加的N-連接的糖鏈和/或至少一個增加的O-連接的糖鏈的EPO類似物(具有延長的血清半衰期但缺乏組織保護活性)與至少一種具有組織保護功能的小分子的混合。合適的小分子包括但不限于，類固醇(例如拉扎堿類和糖皮質(zhì)激素)，抗氧化劑(例如輔酶Q10，α硫辛酸，和NADH)，抗分解酶(anticatabolic enzyme)(例如谷胱甘肽過氧化物酶，超氧化物歧化酶，過氧化氫酶，合成催化凈化劑，和模仿劑)，吲哚衍生物(例如吲哚胺，咔唑，和咔啉)，硝酸中和劑，腺苷/腺苷激動劑，植物化學劑(黃烷類)，草藥提取物(銀杏和姜黃)，維生素(維生素A，E和C)，氧化酶電子受體抑制劑(例如氧雜蒽氧化酶電子受體抑制劑)，礦物(例如銅，鋅，和鎂)，NSAIDS(例如乙酰水楊酸，甲氧萘丙酸，和異丁苯丙酸)，和它們的組合。另外，本發(fā)明所述的藥物組合物含有EPO類似物、組織保護細胞因子、和具有組織保護活性的小分子。
存在于本發(fā)明所述的藥物組合物中的組織保護細胞因子和/或小分子的量優(yōu)選足夠保持或超過由內(nèi)源性EPO在神經(jīng)或其它應答細胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的活性。在一個實施方案中，組織保護細胞因子和/或小分子的量足以增強個體的組織保護能力，這是通過保護，維持，或增強促紅細胞生成應答細胞的存活力和功能實現(xiàn)的。例如，本發(fā)明該方面中所述的藥物組合物優(yōu)選含有有效、非毒性量的組織保護細胞因子，例如約1ng或更多。在一個實施方案中，存在于本發(fā)明所述的藥物組合物中的組織保護細胞因子的量大約是5mg或更少。在另一個實施方案中，存在于本發(fā)明所述的藥物組合物中組織保護細胞因子的量大約是500ng到5mg。在又一個實施方案中，藥物組合物含有約1μg到5mg的組織保護細胞因子，優(yōu)選含有約500μg到5mg。在另一個實施方案中，存在于本發(fā)明所述的藥物組合物中的組織保護細胞因子的量更大，約為1mg到5mg。本領域的技術(shù)人員熟知，給病人施用的藥物組合物的劑量取決于以下因素，但不限于，病人的身體狀況和服藥的頻率。關(guān)于服藥的劑量將在后面詳細的討論。
治療和給藥方法前面提到的長效EPOs和含有長效EPOs的藥物組合物，預期可以用于貧血、涉及貧血或貧血癥狀的人類疾病、或?qū)е仑氀募膊』蛑委煼椒ǖ闹委熜曰蝾A防性處理。通常，在不危害病人從其它組織損傷中康復的能力的情況下，本發(fā)明所述的長效EPOs可以允許頻率更低的給藥或使用更少劑量的促紅細胞生成素來治療上述的疾病。
本發(fā)明預期該長效EPOs可以用于全身或慢性施用，急性治療和/或間斷性施用。在一個實施方案中，本發(fā)明所述的藥物組合物可以慢性的施用以保護或增強靶細胞、組織或器官。在另一個實施方案中，本發(fā)明所述的藥物組合物可以急性的施用，即在損傷期間的單一治療。在另一個實施方案中，本發(fā)明所述的藥物組合物可以循環(huán)的方式施用。
該組合物的施用可以是非腸胃的，例如，通過靜脈注射，腹腔注射，動脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮內(nèi)，或皮下施用；通過吸入；跨粘膜，例如，口服，鼻腔，直腸，陰道內(nèi)，舌下，粘膜下層，和經(jīng)皮；或其組合方式施用。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的藥物組合物的施用方式是非腸胃的。這樣的施用方式的劑量約為0.01pg到約5mg，優(yōu)選約1pg到約5mg。在另—個實施方案中，劑量約為500pg到約5mg。在又—個實施方案中，劑量約為500ng到約5mg。在再一個實施方案中，劑量約為1μg到約5mg。例如，劑量可以為約500μg到約5mg。在另一個實施方案中，劑量可以是約1mg到約5mg。
適用于非腸胃給藥的本發(fā)明所述的藥物組合物含有水性或非水性無菌注射溶液或懸浮液，其可以包含抗氧化劑，緩沖劑，細菌抑制劑和溶質(zhì)，所述溶質(zhì)使該組合物基本與受試體的血液等滲。在本發(fā)明的這方面，該藥物組合物也可以含有水、乙醇、多羥基化合物、甘油、植物油、及其混合物。適用于非腸胃給藥的藥物組合物可以存在于單位劑量或多劑量的容器中，例如，密封的安瓿和小瓶，并且可以凍干(冷凍干燥)保存，在這種情況下只需在馬上就要使用之前加入無菌液體載體，例如注射用的無菌鹽溶液。臨時用注射液和懸浮液可以配制成無菌粉末，顆粒和片劑。在一個實施方案中，含有本發(fā)明所述的長效EPOs注射液的自動注射器，可以用在救護車、應急室和戰(zhàn)場的情況下緊急使用。
在一個實施方案中，本發(fā)明所述的組合物可以根據(jù)常規(guī)的步驟制成適合給人靜脈施用的藥物組合物。例如，該藥物組合物可以作成無菌等滲水性緩沖溶液。如果需要，該藥物組合物也可以含有增溶劑和/或局部麻醉劑如利多卡因，用于減輕注射位點處產(chǎn)生的疼痛。所述成分可以單獨或混合在一起以單位劑量形式提供，如以凍干粉或無水濃縮物的形式存在于密封的容器內(nèi)，如標有活性成分用量的安瓿或小藥囊。當通過灌輸?shù)男问绞┯帽景l(fā)明所述的藥物組合物時，含有無菌藥物級的水或鹽水溶液的輸液瓶可以用來分散藥物。并且，當以注射的形式施用本發(fā)明所述的藥物組合物時，在施用前可以用含有無菌鹽溶液的安瓿來混合各成分。
適用于口服的藥物組合物可以以如下形式提供膠囊或片劑；粉劑或顆粒劑；溶液、糖漿或懸浮液(含水或不含水的液體)；可食用的泡沫(foams或whips)；乳化劑；或其組合?？诜苿┛梢园亓堪俜直燃s10％到約95％的活性成分。在一個實施方案中，口服制劑中活性成分的重量百分比是約20％到約80％。在另一個實施方案中，口服制劑中活性成分的重量百分比是約25％到約75％。
片劑或硬質(zhì)明膠膠囊可以含有乳糖、淀粉及其衍生物、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂、硬脂酸及其鹽。軟質(zhì)明膠膠囊含有蔬菜油、蠟、脂肪、半固體、液體多元醇、或其混合物。溶液和糖漿含有水、多元醇、糖、或其混合物。
此外，用于口服的活性劑可以用推遲活性劑在胃腸道內(nèi)崩解和/或吸收的材料進行包衣或混合。例如，用單硬脂酸甘油、雙硬脂酸甘油、或其組合與活性劑混合或進行包衣。因此，活性劑的持續(xù)釋放可以維持很多個小時，如果需要，可以阻止活性劑在胃內(nèi)的降解?？诜乃幬锝M合物可以根據(jù)特殊的pH或酶條件進行配制，以助于在胃腸道的特定部位釋放活性劑。
適合于經(jīng)皮給藥的藥物組合物可以以不連續(xù)片(discrete patch)的方式提供，其可保持與受試者表皮緊密接觸較長時間。另外，適合于局部給藥的藥物組合物可以以如下形式提供油膏劑、乳膏劑、懸浮劑、洗劑、粉劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑、油劑、滴眼劑、糖錠、軟錠劑、和漱口劑及其組合。當局部給藥用于皮膚、口腔、眼睛、或其它的外部組織時，優(yōu)選使用局部油膏劑或乳膏劑。并且，當存在于油膏劑中時，活性成分，即長效EPO，可以與蠟或易與水混溶的油膏基質(zhì)一起使用?；蛘?，使用水包油或油包水的基質(zhì)將活性成分制備為乳膏劑。當局部給藥采用滴眼劑形式時，本發(fā)明所述的藥物組合物優(yōu)選含有溶解或懸浮在合適的載體例如水性溶劑中的活性劑。
適用于鼻腔和肺部給藥的藥物組合物可以含有固體載體，如粉末(優(yōu)選顆粒大小在約20到約500微米內(nèi)的)。粉末可以通過從靠近鼻子的含有粉末的容器中快速吸入鼻腔的方式來施用。在另一個實施方案中，本發(fā)明所述的用于鼻腔施用的藥物組合物含有液體載體，如噴鼻劑或滴鼻劑。優(yōu)選在鼻腔內(nèi)直接施用本發(fā)明所述的藥物組合物。
直接的肺部吸入可以通過伸入到咽喉的口腔插管和其它的特殊設計的裝置深吸來完成，所述裝置包括但不限于，壓力氣霧器、噴霧器、或噴灑器，其可經(jīng)專門設計以提供預定量的活性成分。優(yōu)選，藥物組合物通過直接深吸入咽喉的方式施用。
適合于直腸給藥的藥物組合物可以以栓劑或灌腸劑的形式提供。在一個實施方案中，本發(fā)明所述的栓劑含有重量百分比為約0.5％到10％的活性成分。在另一個實施方案中，該栓劑含有重量百分比為約1％到約8％的活性成分。在另一個實施方案中，該栓劑含有的活性成分重量百分比為約2％到約6％。在本發(fā)明的這一方面，本發(fā)明所述的藥物組合物可以含有常用的粘合劑和載體，如甘油三酸脂。
適于陰道給藥的藥物組合物可以以如下形式提供陰道栓劑、棉塞劑、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑。
本發(fā)明所述的藥物組合物也可以以使用灌輸液、器官注射或局部給藥的方式來施用。在這些實施方式中，該藥物組合物優(yōu)選的含有約0.01pM到約30pM，優(yōu)選是約15pM到約30nM的本發(fā)明所述的長效EPO。在一個實施方案中，灌輸溶液是University of Wisconsin(UW)溶液(具有約7.4到約7.5的pH和約320mOSm/l的摩爾滲透壓濃度)，它含有約1U/ml到約25U/ml的EPO；5％的羥乙基淀粉(優(yōu)選具有分子量約從200,000到約300,000并且基本上不含乙二醇、2-氯乙醇、氯化鈉、和丙酮)，25mM KH2PO4、3mM谷胱甘肽；5mM腺苷；10mM葡萄糖；10mM HEPES緩沖液；5mM葡萄糖酸鎂；1.5mM CaCl2；105mM葡萄糖酸鈉；200,000單位的青霉素；40單位的胰島素；16mg的地塞米松；和12mg的酚紅。UW溶液在美國專利號4,798,824中有詳細的描述，在此全文引入作為參考。在另一個實施方案中，UW溶液可以含有約0.01pg/ml到約400ng/ml，優(yōu)選40ng/ml到約300ng/ml的重組組織保護細胞因子。
向需要治療的區(qū)域局部施用本發(fā)明所述的藥物組合物可能是令人期待的。這樣的給藥方式可以通過如下方式來實現(xiàn)在手術(shù)中局部灌輸；局部應用，如手術(shù)后與傷口敷料一起應用；通過注射；通過導管；通過栓劑；或通過植入的方式，所述的植入方式可以用帶孔的、無孔的、或膠質(zhì)材料，包括膜，如硅膠膜，或纖維。
另外，如前所述的關(guān)于經(jīng)皮施用的方式，本發(fā)明所述的長效EPO可以由控釋體系來輸送。例如，使用靜脈灌輸、植入滲透泵、經(jīng)皮膜片、脂質(zhì)體、或其它的方式施用該肽。在—個實施方案中，可以使用泵，如在Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321574中描述的。在另—個實施方案中，可以使用載體輸送該化合物，特別是脂質(zhì)體，如在國際公開號WO91/04014和美國專利號4,704,355中描述的那樣，在此將其整體引入?yún)⒖?。在另一個實施方案中，聚合物材料可以用于制備控釋體系，如那些在Howard等，1989，J.Neurosurg.71105中描述的材料。
這樣的控釋體系可以置于靠近治療目標的地方，即靶細胞、組織或器官，因此只需要全身劑量的一部分。參見，例如，Goodson，Medical Applications ofContolled Release，vol.2，pp.115-138，1984?？捎糜诒景l(fā)明的其它控釋體系在Langer，Science 2491527-1533，1990的綜述里有描述。
劑量基于本領域普通技術(shù)人員公知常識，本領域普通技術(shù)人員可以選擇適用于上述施用方法的優(yōu)選的有效和非毒性劑量。這些因素的實例包括長效EPO的特殊形式；該EPO的藥物動力學參數(shù)，如生物利用度、新陳代謝、半衰期等(已提供給技術(shù)人員)；有待治療的情況或疾?。辉谄胀▊€體中所取得的療效；病人的體重；給藥方法；給藥頻率，即慢性的、急性的、間斷的給藥；伴隨藥物；和其它已知的影響所施用的藥劑的有效性的因素。這樣，精確的劑量應當根據(jù)專業(yè)人員的判斷和特定病人的情況來確定。
例如，Physicians Desk Reference(PDR)表明了，依據(jù)使用EPO治療的病人群體，考慮不同的血細胞比容水平以避免毒性。Physicians Desk Reference，54thEd.，519-525和2125-2131(2000)。事實上，對患有CRF的病人，PDR推薦施用的EPO劑量是達到非毒性目標血細胞比容30％到36％。相反，對于進行化療的癌癥病人，PDR教導將劑量調(diào)節(jié)到不同的血細胞比容水平，也就是如果血細胞比容水平超過40％。PDR表明，專業(yè)人員在使用EPO治療期間監(jiān)控病人的血細胞比容，并且如果病人的血細胞比容達到或超過預定范圍的上限，則調(diào)整劑量和/或停止治療以避免毒性。因而，熟練的專業(yè)人員，根據(jù)本發(fā)明的教導，應該能夠使EPO的施用劑量足以達到治療的效果而又避免了任何的毒性并發(fā)癥。
在—個實施方案中，本發(fā)明所述的長效EPO以劑量為每次約0.1μg/kg體重到約100μg/kg體重慢性或全身的施用。例如，在治療接受化療的癌癥病人時，以約1μg/kg體重到約5μg/kg體重的劑量每周施用一次。在另—個實施方案中，該長效EPO的劑量是每次約5μg/kg體重到約50μg/kg體重。在又一個實施方案中，該長效EPO的劑量是約10μg/kg體重到約30μg/kg體重。在再一個實施方案中，該長效EPO的施用量約為1μg/kg體重或更少。例如，在每周給藥一次治療CRF患者的貧血時，約0.45μg/kg體重到約0.75μg/kg體重的長效EPO可能是有效的。
有效的劑量優(yōu)選足以獲得大于約10,000mU/ml(80ng/ml)的長效EPO的血清水平。在一個實施方案中，有效劑量能夠獲得約15,000mU/ml(120ng/ml)或更高的長效EPO的血清水平。在另一個實施方案中，有效劑量能夠獲得約20,000mU/ml(160ng/ml)的長效EPO的血清水平。最好在施用后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小時或其組合時進行檢測。本領域的普通技術(shù)人員認為需要時，可以重復施用的劑量。例如，只要臨床需要，每天都可以重復給藥，或經(jīng)過一個適當?shù)拈g歇后重復給藥，如每1到12周，優(yōu)選每1到3周。
由于本發(fā)明所述的長效EPOs具有延長的半衰期，因此它們在體內(nèi)的活性也會增加。例如，當哺乳動物的病體進行癌癥的全身性化療治療時，包括放療，在治療期間施用本發(fā)明所述的長效EPO藥物組合物可以減少貧血相關(guān)的癥狀，其施用的頻率和劑量都少于現(xiàn)有的重組EPO組合物。
并且，如前所述，當本發(fā)明所述的藥物組合物含有本發(fā)明所述的長效EPO或EPO類似物與組織保護細胞因子的混合形式時，該組合物可以用于治療同時還有組織損傷危險的患者的貧血及相關(guān)疾病。例如，患有貧血同時也是心臟病高危的病人，可以用本發(fā)明所述的組合物代替現(xiàn)有的EPO類似物來治療，以避免因治療而增加損害的風險。
治療試劑盒本發(fā)明同時也提供了一種藥物試劑包或盒，其含有用本發(fā)明所述的藥物組合物的—種或多種成分填充的一個或多個容器。在一個實施方案中，有效量的長效EPO和藥學上可接受的載體可被包裝在單劑量瓶或其它容器中。
當本發(fā)明所述的藥物組合物用于非腸胃給藥時，例如，可在凍干的條件下保藏該組合物。因此，試劑盒可以包括凍干組合物、無菌液體載體、和用于注射的注射器。在一個實施方案中，該試劑盒包括含有足夠用于幾次治療的凍干材料的安瓿，以便施用者可以稱出特定量的材料并且加入特定量的載體用于每次治療。在另一個實施方案中，試劑盒包括多個安瓿，每個安瓿中都含有特定量的凍干材料，以及多個容器，每個容器中都含有特定量的載體，以便施用者只需將一個安瓿和一個載體容器的內(nèi)容物混合用于每次治療，而不用測定或稱量。在另一個實施方案中，該試劑盒包括自動注射器，其含有本發(fā)明所述的EPO的注射用溶液。在另一個實施方案中，該試劑盒包括至少一個含有凍干組合物的安瓿、至少一個含有載體溶液的容器、至少一個含有局部麻醉劑的容器、和至少—個注射器(或類似物)。安瓿和容器優(yōu)選是密封的。
當以灌輸?shù)姆绞绞┯帽景l(fā)明所述的藥物組合物時，該試劑盒優(yōu)選包括至少一個含有該藥物組合物的安瓿和至少一個含有無菌藥物級的水或鹽溶液的輸液瓶。
本發(fā)明所述的試劑盒也可以包括至少一個口腔插管或適用于直接肺部吸入的特別裝置如壓力氣霧器、噴霧器、或噴灑器。在本發(fā)明的這一方面，該試劑盒可以包括用于直接肺部吸入的裝置，其含有該藥物組合物，或該裝置和至少一個含有本發(fā)明所述長效EPO的水或油溶液的安瓿。
當本發(fā)明所述的長效EPO藥物組合物適合于口服、經(jīng)皮、直腸、陰道、或鼻腔給藥時，該試劑盒優(yōu)選包括至少一個含有活性成分的安瓿和至少一種給藥輔助物。給藥輔助物的例子包括但不限于，稱量勺(用于口服)、無菌清潔墊(用于經(jīng)皮給藥)、和鼻腔吸氣器(用于鼻腔給藥)。這樣的試劑盒可以含有單劑量的長效EPO(急性治療)或多劑量的長效EPO(慢性治療)。
另外，該試劑盒可以配備有一種或多種類型的溶液。例如，本發(fā)明所述的長效EPO藥物組合物可以被制備在白蛋白溶液和聚山梨醇酯溶液中。如果試劑盒含有聚山梨醇酯溶液，“不含白蛋白”的字樣優(yōu)選出現(xiàn)在容器的標簽上和試劑盒的主面板上。
另外，該試劑盒還包括管理藥物或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機構(gòu)所規(guī)定的形式的聲明，該聲明反映了上述機構(gòu)已經(jīng)批準用于人體的生產(chǎn)、使用或銷售。
EPO檢測試驗本發(fā)明也涉及用于確定本發(fā)明所述的長效EPOs以及用在本發(fā)明所述的幾種藥物組合物中的EPO類似物的促紅細胞生成能力和組織保護能力的檢測方法。例如，長效EPOs的促紅細胞生成活性可以使用TF-1分析來檢測，這將在實施例2中更詳細的描述。EPO化合物的組織保護活性可以使用體外和體內(nèi)分析來檢測，這將在后面更詳細的討論。另外，預期本發(fā)明也包括不僅能用于確定特定的EPO化合物是否具有組織保護活性，而且也能用于確定該EPO化合物是否作為內(nèi)源性EPO的拮抗物的檢測方法。
本發(fā)明所述的檢測方法優(yōu)選設計成在短時間內(nèi)使用最少量的EPO混合物來完成。還有，這里提供的檢測方法是非限制的，因為本領域的普通技術(shù)人員能夠理解到其它的用于檢測EPO化合物的促紅細胞生成活性和組織保護活性的方法。
促紅細胞生成活性檢測特定EPO化合物的促紅細胞生成特性，即控制血細胞比容水平的能力，可以通過多種檢測方法確定。在—個實施方案中，TF1細胞系可以用于確定EPO化合物是否具有促紅細胞生成活性。該細胞可以被沉淀、沖洗、和重懸在濃度為1毫升105個細胞的培養(yǎng)液中，添加有一定濃度的重組EPO和感興趣的EPO化合物。個別培養(yǎng)物可以被維持24小時，同時使用formazan反應物(CellTiter；Promega，Madison，WI)來測定細胞的數(shù)目。
感興趣的EPO化合物的活性可以首先通過使用雌性BALA/c小鼠，觀察其對血紅蛋白濃度的影響來進行體內(nèi)評價。給動物皮下施用500U/kg-bw的EPO、感興趣的EPO化合物、或等體積的載體，每周三次給藥總共三周(足以觀察到紅細胞生成反應的時間間隔)。如果EPO化合物提高了小鼠的血清血紅蛋白的濃度，就確定它具有促紅細胞生成活性。
對活性的進一步評價可以使用TF1紅白血病細胞而體外獲得。如果TF1細胞的相對數(shù)目超過了對照組，那么感興趣的EPO化合物就具有促紅細胞生成活性。另外，本領域的普通技術(shù)人員知道其它檢測促紅細胞生成活性的檢測方法也可以使用。例如，歐洲藥典記載了至少兩種用于檢測EPO化合物的促紅細胞生成活性的方法，其包括組織缺氧小鼠試驗及網(wǎng)狀細胞試驗。
基于EPO受體的組織保護能力檢測在—個實施方案中，本發(fā)明所述的組織保護能力檢測是基于EPO的組織保護性受體。一旦分離了組織保護性受體的序列，就可以使用各種檢測方法來確定特定EPO化合物的組織保護能力。正如本領域內(nèi)的普通技術(shù)人員己知的那樣，所用的檢測的類型主要取決于EPO化合物的重量。
例如，檢測方法可以是競爭性檢測或三明治檢測或空間位阻檢測。競爭性檢測依賴于示蹤劑類似物與檢測樣本分析物競爭性的結(jié)合有限個位于結(jié)合配體上的結(jié)合位點。這里，術(shù)語“分析物”是指有待于檢測其組織保護活性的感興趣的EPO化合物。術(shù)語“結(jié)合配體”是指結(jié)合分析物(特別是EPO受體)的任何蛋白?！笆聚檮笔侵副粯擞涍^的試劑，例如標記的分析物類似物、固定的分析物類似物、標記過的結(jié)合配體、固定的結(jié)合配體和空間偶聯(lián)物。這里的示蹤劑可以具有任何不影響分析物與其結(jié)合配體的結(jié)合的可被檢測到的功能。非限制的例子包括可被直接檢測到的部分(moiety)，如熒光染料、化學發(fā)光劑、和放射性標記物，以及必須被反應或衍生化才能被檢測到的部分，如酶。合適的示蹤劑可以是放射性同位素P32、C14、I125、H3、I131、及其混合物；熒光團，如稀土螯合物、熒光素、熒光素衍生物、若丹明、若丹明衍生物、丹磺酰氯、傘形酮螢光素酶(螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶(美國專利號4,737,456))、熒光素、2，3-dihydrophthalazinediones、辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、與利用過氧化氫氧化染料前體如HRP、乳過氧化物酶、微過氧化物酶和其混合物偶聯(lián)的雜環(huán)氧化酶(尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記物；噬菌體標記；穩(wěn)定的游離自由基；和其組合。在一個實施方案中，示蹤劑為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶中的至少一種。
本領域技術(shù)人員知道將示蹤劑與蛋白或多肽偶聯(lián)的方法。例如，偶聯(lián)劑如二醛、碳二亞胺、二順丁烯二酰亞胺、二咪唑、二重氮化對二氨基聯(lián)苯等可以用于與上面提到的熒光劑、化學發(fā)光劑、和酶標記來進行標記，其中一些已在美國專利號3,940,475和3,645,090中描述，在此全文引入作為參考。
在三明治檢測方法中，需要進行反應物的固定，也就是將結(jié)合配體與游離在溶液中的任何分析物分離，其可以通過在檢測步驟之前沉淀結(jié)合配體或分析物類似物來完成，如同通過共價偶聯(lián)，如戊二醛交聯(lián)吸附到不溶于水的基質(zhì)或表面(美國專利號3,720,760)，或在檢測步驟之后，通過如免疫沉淀法將配體或類似物固定。
因此，在競爭性反應之前或之后可以將結(jié)合配體沉淀出來(insolubilize)，并且與結(jié)合配體相結(jié)合的示蹤劑或分析物從沒有結(jié)合的示蹤劑和分析物中分離出來。分離可以使用傾析(這里結(jié)合配體是提前沉淀的)或離心(這里結(jié)合配體是在競爭性反應后沉淀的)。試樣分析物的量反比于由標記物質(zhì)的量所測定出來的結(jié)合示蹤劑的量。可以繪制已知量分析物的劑量反應曲線，并與試驗結(jié)果相比較，以定量確定試樣中分析物的量。當使用酶作為示蹤劑時，檢測方法通常是指ELISA系統(tǒng)。
在連續(xù)三明治檢測中，例如，被固定的結(jié)合配體用于吸附試驗樣品分析物，沖洗去除試驗樣品，結(jié)合的分析物用于吸附標記過的結(jié)合配體，然后將殘留的示蹤劑與結(jié)合的物質(zhì)分離。結(jié)合示蹤劑的量正比于試驗樣品的分析物。在“同時”三明治檢測中，加入標記過的結(jié)合配體之前，不需要分離試驗樣品。
競爭性和三明治檢測方法使用相分離步驟作為檢測方法的必要部分，但空間位阻檢測方法在單個反應混合物中進行。另一種競爭性檢測方法，稱為“同源”檢測，其不需要相分離。在這樣的檢測方法中，制備和使用酶與分析物的偶聯(lián)物，從而使得當抗分析物連接到分析物上時，抗分析物的存在影響了該酶的活性。用雙功能的有機橋?qū)⒔M織保護受體與酶如過氧化物酶偶聯(lián)。對與EPO一起使用的偶聯(lián)物進行選擇，從而使得EPO的結(jié)合抑制或增強了標記酶的活性。這種類型的檢測方法通常被稱為EMIT。
空間偶聯(lián)物用于同源檢測的空間位阻方法中。這些偶聯(lián)物可以通過在小分析物上共價連接一個小分子量的半抗原來合成，從而使得抗半抗原抗體基本不能與抗分析物同時結(jié)合到偶聯(lián)物上。存在于試驗樣品中的分析物將結(jié)合抗分析物，從而允許抗半抗原結(jié)合到偶聯(lián)物上，導致了偶聯(lián)半抗原的特性改變，例如，當半抗原是熒光團時，熒光性發(fā)生變化。
關(guān)于組織保護能力的檢測的更多信息描述于共同未決的美國專利申請?zhí)枮?0/188,905，申請日為2002年7月3日的專利以及申請序列號為60/456,891，申請日為2002年4月25日的專利申請，在此全文引入作為參考。
功能檢測在缺失組織保護受體序列的情況下，EPO的組織保護功能可以由體內(nèi)和體外的功能檢測來確定。優(yōu)選地，本領域的普通技術(shù)人員進行單獨的體外或體內(nèi)檢測就可以確定EPO化合物的組織保護活性，但在某些情況下需要兩者都進行以確?；衔镌隗w內(nèi)和體外都表現(xiàn)出相同的組織保護活性。
實踐中，本領域的普通技術(shù)人員能夠使用本發(fā)明公開的檢測方法的組合來確定具有至少一個增加的N-連接的糖鏈和/或至少一個增加的O-連接的糖鏈的EPO類似物是否具有組織保護活性。首先，體外實驗如P19細胞和大鼠運動神經(jīng)元檢測可以用于確定感興趣的EPO是否具有組織保護活性。然后，體內(nèi)的檢測如大鼠定點局部缺血模型、荷包牡丹堿抽搐模型、或脊髓損傷模型能夠用于驗證體外試驗的結(jié)果。
本發(fā)明的體外模型包含但不限于，那些用來確定上述過糖基化的促紅細胞生成素組織保護活性的缺失的模型P19細胞檢測、大鼠運動神經(jīng)元檢測、和cDNA微列陣，其將在后面和實施例2中更加詳細的討論。這些例子是非限制性的，因為本領域的技術(shù)人員已知道其它的適合體外檢測的模型，用于確定EPO化合物的組織保護活性?？偟恼f來，如果與對照相比，EPO化合物保持或增強了細胞的存活力，則EPO化合物將被認為是有組織保護活性的。如果與對照相比，該促紅細胞生成素嚴重影響了檢測中細胞的存活力，則其將被認為是拮抗性的。
A.基于P19細胞系的體外檢測在一個實施方案中，體外組織保護活性的檢測是基于P19細胞系的。例如，P19細胞可以在添加了2mM L-谷胱苷肽、100U/ml的青霉素G、100μg/ml的硫酸化鏈霉素(Gibco)和10％的胎牛血清(Hyclone Laboratories)的DMEM中保持不分化，其中含有1.2g/l NaHCO310mM的hepes緩沖液。除了以5μg/ml的胰島素、100μg/ml的轉(zhuǎn)移劑(transferring)、20nM的黃體酮、100μM的腐胺和30nM的Na2SeO3(Sigma)來代替胎牛血清以外，不含血清的培養(yǎng)液中可以含有上述培養(yǎng)液同樣的成分。
將與50％的融合劑(confluency)反應的細胞用重組EPO和/或感興趣的EPO化合物處理過夜，用胰蛋白酶解離，在不含血清的培養(yǎng)液中沖洗并且置于25cm2的組織培養(yǎng)瓶中，達到在不含血清的培養(yǎng)液中(或含有預處理添加物)的最終密度為104細胞/cm2。細胞的存活力通過臺盼藍排斥反應來檢測。
正如本領域技術(shù)人員所熟知的，在未分化的神經(jīng)元樣P19細胞中去除血清后，加入重組EPO可以阻止細胞的死亡。例如，如果使用的濃度為0.1U/ml到100U/ml，重組EPO挽救了至多50％的神經(jīng)元樣細胞使之免于死亡。因此，想要確定感興趣的EPO化合物具有組織保護活性，其必須相比于對照組挽救更多的P19細胞使之免于死亡，優(yōu)選必須挽救約25％到約50％的細胞，最優(yōu)選為約40％到約50％的細胞。
B.體外大鼠運動神經(jīng)元分析在另一個實施方案中，大鼠運動神經(jīng)元分析用于體外檢測感興趣的EPO化合物的組織保護活性。例如，初級運動神經(jīng)元可以從15天大的Sprauge Dawley大鼠的胚胎的脊髓中獲得并使用免疫淘選純化。細胞優(yōu)選以低密度(20000細胞/cm2)接種在24mm孔板的蓋玻片上，所述24mm孔板用聚-DL-鳥氨酸(orinthine)和N-三甲基賴氨酸內(nèi)鹽預先包被，并且含有完全培養(yǎng)液(Neurobasal、B27(2％)、0.5mM L-谷氨酰胺、2％的馬血清、25μM 2-巰基乙醇、25μM谷氨酸、1％的青霉素和鏈霉素，1ng/ml的BDNF)。經(jīng)過一段時間后，優(yōu)選約6天，EPO(10U/ml)和感興趣的EPO化合物(10U/ml)或賦形劑可以加到培養(yǎng)液中(最好優(yōu)選是在檢測存活的神經(jīng)元細胞密度前約5天)。然后去除培養(yǎng)液，細胞與含有4％多聚甲醛的PBS混合40分鐘，用0.2％的Triton X-100滲透，用含10％的小牛血清的PBS封閉，與抗非磷酸化的神經(jīng)絲(SMI-32；19000)的抗體溫育過夜，并利用二氨基聯(lián)苯胺通過抗生物素蛋白-生物素方法來顯影。運動神經(jīng)元的存活力可以通過SMI-32陽性細胞的計數(shù)來進行形態(tài)上的評價。
運動神經(jīng)元的混合初級培養(yǎng)物在維持培養(yǎng)條件下特征性地經(jīng)歷程序性死亡。已經(jīng)表明，在檢測細胞數(shù)目的5天前向培養(yǎng)液中添加重組EPO(10U/ml)，在第5天明顯的增加了初級運動神經(jīng)元的數(shù)目。因此，被認為具有組織保護活性，與對照組相比，感興趣的EPO化合物優(yōu)選至少挽救了相同數(shù)目的運動神經(jīng)元。在一個實施方案中，在維持培養(yǎng)條件下，如果與對照組相比感興趣的EPO化合物挽救了更多的運動神經(jīng)元，那么就認為其具有組織保護活性。
C.基于cDNA微列陣的體外檢測另一種檢測感興趣的EPO化合物的組織保護活性的方法是cDNA微列陣。這種檢測方法可以用于確定EPO和感興趣的EPO化合物對P19細胞的基因表達的影響是否不同。從未分化的P19細胞中分離的mRNA可以顯示出不同的基因調(diào)控模式，這是由小鼠1200cDNA微列陣確定的，其取決于暴露至EPOs的程度。例如，在P19細胞中1,200基因的表達可以通過使用來自Clontech(Atlasmouse1.2)的尼龍膜列陣來檢測。細胞(107/樣品)可以用鹽水、重組EPO、感興趣的EPO化合物(1mU/ml)、或其混合物處理過夜。然后溶解細胞用于提取RNA或用3小時去除血清(總是存在在預處理時加入的同樣的細胞因子)。通過柱層析進行標準總RNA提取之后，使用柱上DNase處理層析柱，可以將polyA+RNA純化出來。隨后在[P32]-ATP存在的情況下構(gòu)建探針。該標記的探針，優(yōu)選具有兩千萬個計數(shù)或更多，可以在68℃的條件下雜交到cDNA尼龍膜上。沖洗該膜并曝光到x光膠片上。放射性信號的強度可以用PhosphorImager來檢測并用Atlas Image 2.0計算機程序(Clontech)來分析。
本發(fā)明的體內(nèi)檢測包括但不限于，用于評價EPO化合物的組織保護活性的檢測方法，如定點局部缺血模型和海馬(intra-hippoeampal)內(nèi)荷包牡丹堿模型。另外，用于評價組織保護活性的體內(nèi)模型包括脊髓損傷檢測。進一步的，公開在國際公開號WO/02053580和美國專利公開號2002/0086816和2003/0072737中的各種檢測方法都可以用于本發(fā)明。
D.基于局部缺血模型的體內(nèi)分析在一個實施方案中，這種用于檢測特定EPO化合物的組織保護能力的分析方法是基于局部缺血模型。例如，雄性Sprague-Dawley大鼠(～250g)可以用于三血管局部缺血模型。簡而言之，使用戊巴比妥(60mg/kg-bw)麻醉大鼠并且使用水浴保持37℃的核心溫度。用兩條縫合線結(jié)扎右側(cè)頸動脈并切斷?？拷已劭舻暮砜资沟弥胁磕X血管可見，這樣可以麻醉鼻腔血管的末端。為了在固定的MCA傷口周圍產(chǎn)生半影，用鉗子牽引另—側(cè)的頸動脈使其閉塞1小時。在可逆的頸動脈閉合發(fā)作時，可以施用鹽水，重組EPO(5000U/kg-bw)或感興趣的EPO化合物(5000U/kg-bw)。
24小時后，取下腦部，使用腦部手術(shù)裝置(Harvard Apparatus)從整個腦部切下連續(xù)的1-mm厚的部分。每一部分然后在含有2％的氯化三苯基四唑的154mM的NaCl中37℃孵化30分鐘。受傷的體積可以用計算機圖像分析系統(tǒng)(MCID，Imaging Reseach，St.Catharines，Ontario，Canada)來測定。在這樣的檢測中，如果感興趣的EPO化合物與重組EPO相比，對改善由于大鼠MCA局部缺血造成的梗塞體積的程度相同或更好，那么就認為其具有神經(jīng)保護活性。
E.基于海馬內(nèi)的荷包牡丹堿抽搐模型的體內(nèi)檢測在另一個實施方案中，EPO化合物的組織保護能力可以通過體內(nèi)的海馬內(nèi)的荷包牡丹堿實驗來檢測。例如，雄性Sprangue-Dawley大鼠(250～280g)被關(guān)在恒定溫度(23℃)和相對濕度(60％)的條件下，施用充分的食物和水，提供固定的12小時的晝/夜循環(huán)。在立體定位引導下手術(shù)給大鼠植入套管和電極，按照Vezzani，A.，等，J.Neurosci，19，5054-65(1999)中所述。簡要的，使用Equithesin(1％的戊巴比妥/4％的水合三氯乙醛；3ml/kg i.p.)麻醉大鼠。兩個螺旋的電極位于頂骨皮層的兩邊，還放入位于鼻竇下的接地線。雙極鎳鎘鐵合金線絕緣電極(60μm)然后可被植入到背面海馬(隔膜電極)的腦回的兩側(cè)，并且可植入位于硬腦膜頂部單側(cè)的套管(22-規(guī)格)用于海馬內(nèi)和腦室內(nèi)灌輸藥物。植入電極的基于前囪的位置坐標應當是(mm)前-后-3.5；兩邊2.4和3硬腦膜下，使用壓尺設置在-2.5.Paxinos，G.& Waston，C.，The Rat Brain in StereotaxicCoordinates，Academic Press，New York(1986)。電極可以與多孔插座連接(MarchElectronics，NY)和，連接在注射容器上，用丙烯酸牙齒粘合劑保護頭骨。
該實驗優(yōu)選在動物手術(shù)后的3到7天動物完全康復時進行。然后給動物腹腔施用重組EPO或感興趣的EPO化合物(都是5000U/kg-bw)或載體，在誘導荷包牡丹堿發(fā)作之前24小時給藥一次，誘導前30分鐘時再給藥一次。記錄EEG和腦內(nèi)藥物注射的步驟已經(jīng)描述在Vezzani，A.，等，J.Pharmacol Exp Ther，239，256-63(1986)。簡要的，在開始EEG記錄(4道EEG多種波動描寫器，型號BP8，Battaglia Rangoni，Bologna，Italy)前，動物可以放養(yǎng)在Plexiglass籠子中(25×25×60)最少10分鐘。約15到約30分鐘后，用0.8nmol/0.5μl的荷包牡丹堿甲碘化物灌輸后，進行持續(xù)120分鐘的EEG記錄。所有的注射都是用伸到套管下方3mm的針頭(28-規(guī)格)施用于非麻醉大鼠。
可通過EEG分析來檢測抽搐，此前已經(jīng)表明其可以提供對藥物的抗驚厥活性的靈敏檢測。Vezzani，A.，等，J.Pharmacol Exp Ther，239，256-63(1986)。出于該檢測的目的，抽搐由全部4項記錄信息(leads of recordings)中同時發(fā)生的至少兩項下述改變組成高頻和/或多峰值復合(multispike complex)和/或高電壓同步峰值(high voltage synchronized spike)或波浪型活動?？捎^察到同步峰值與抽搐相混合。選擇用于定量抽搐的參數(shù)優(yōu)選是第一次抽搐(抽搐發(fā)作)的潛伏時間，癲癇反應總共消耗的時間(通過將發(fā)作事件的持續(xù)時間加在—起而確定；抽搐持續(xù)時間)，和在EEG記錄期間(抽搐反應)的峰值反應。
使用EEG反應作為讀數(shù)的海馬內(nèi)荷包牡丹堿抽搐模型已經(jīng)被證明是藥物的抗抽搐能力的靈敏和特異性的預報手段。Vezzani，A.，等，J.Pharmacol ExpTher，239，256-63(1986)。因此，要想被認為具有組織保護活性，感興趣的EPO化合物應該相比于重組EPO而言相同程度或更大程度地減少了抽搐的頻率和嚴重程度。
F.基于急性可逆青光眼大鼠模型的體內(nèi)檢測在本發(fā)明的另一種體內(nèi)檢測中，急性可逆青光眼大鼠模型可以用于感興趣的特定EPO化合物的組織保護能力的檢測。例如，因為視網(wǎng)膜細胞對局部缺血非常敏感，因此許多這樣的細胞在局部缺血脅迫下30分鐘后就會死亡。因此，為了檢測外周施用的感興趣的EPO化合物是否顯示足以保護對局部缺血敏感的細胞的組織保護活性，可以使用急性、可逆青光眼大鼠模型，其描述參見Rosenbaum等，Vis.Res.373443-51，1997。特別的，可以注射鹽水到成年雄性大鼠的眼部前腔，并使其壓力超過體動脈血壓并維持60分鐘。然后在誘導出局部缺血之前24小時給大鼠腹腔內(nèi)施用鹽水和5000U EPO/kg體重，并且作為每日劑量連續(xù)施用額外的3天。
治療后1周可以用視網(wǎng)膜電流描記器可以檢測適應了黑暗的大鼠，以確定感興趣的EPO化合物是否具有組織保護活性。如果該EPO具有組織保護活性，相那么比于用鹽水治療的大鼠，在視網(wǎng)膜電流描記中應該有很好的活性保留。
G.心肌梗塞檢測心肌梗塞檢測也可以應用于本發(fā)明，其用來檢測EPO化合物在整體上或特別在心臟內(nèi)是否具有組織保護活性。例如，在麻醉大鼠并準備進行冠狀動脈結(jié)扎前24小時可以給成年雄性大鼠施用5000U/kg體重的EPO。在程序開始時可以施用額外劑量的EPO，同時結(jié)扎左邊的主冠狀動脈30分鐘然后松開。在處理后每天施用同樣劑量的EPO 1周，同時檢測大鼠的心臟功能。接受了空白注射(鹽水)的大鼠將顯示出左邊末端心臟舒張壓的大幅度增加，預示了擴大的、僵硬的心臟，僅次于心肌梗塞，而對施用了感興趣的EPO化合物的動物而言，如果該EPO有組織保護活性的話，那么該動物應當相比于空白對照組表現(xiàn)出未損傷的心臟功能(顯著性差異在P＜0.01水平)。
H.脊髓損傷檢測脊髓損傷檢測也可以用于本發(fā)明來評價特定的感興趣EPO化合物的組織保護活性。特別的，可將大鼠脊髓壓縮液用于本發(fā)明。優(yōu)選使用體重約為180g到約300g的Wistar大鼠(雌性)。手術(shù)前，動物優(yōu)選在手術(shù)前絕食12小時，人性化監(jiān)禁，并腹腔內(nèi)注射戊硫代巴比妥鈉(40mg/kg-bw)進行麻醉。皮膚滲透(0.25％的布比卡因)之后，在解剖用顯微鏡的輔助下，通過2cm的切口進行完全單水平(T-3)椎板切除術(shù)。創(chuàng)傷性脊髓損傷是由硬腦膜外的臨時動脈瘤夾子通過施加在脊髓上0.6牛頓(65克)的閉合力1分鐘而誘導的。取下夾子后，縫合皮膚的切口，大鼠從麻醉中完全蘇醒，再放回到籠子中。使用至少每天兩次的膀胱觸診來監(jiān)控大鼠直到恢復自發(fā)性的排空。
對照組的動物在縫合切口后迅速的立即施用通常的鹽水(通過靜脈注射)。其余的動物靜脈施用16毫克/kg-bw的感興趣的EPO化合物。然后使用運動比率值(locomotor rating scale)來評價大鼠的運動神經(jīng)學功能。在這種數(shù)值里，動物的得分范圍從0(沒有觀察到后肢運動)到21(正常的步態(tài))。由不了解動物所受治療的同一個檢驗人員在損傷后1小時、12小時、12小時、48小時、72小時、和1周，分別測定大鼠的功能缺失。如果感興趣的EPO化合物具有組織保護活性，施用了該EPO的大鼠應當比注射鹽水的大鼠更快更好的從損傷中痊愈。
I.兔脊髓局部缺血檢測在另一個實施方案中，將兔脊髓局部缺血檢測用于組織保護能力的檢測。例如，新西蘭白兔(36，8-12月大，雄性)重1.5kg-2.5kg可以用于該檢測中。動物禁食12小時并人性化的管理。麻醉誘導是通過3％的三氟溴氯乙烷，其分散在100％的氧氣中，并維持于0.5-1.5％的三氟溴氯乙烷，其分散在50％的氧氣和50％的空氣混合氣體中。將靜脈注射用導管(22-規(guī)格)插入左耳靜脈。在手術(shù)過程中以每小時4ml/kg體重(bw)的速度灌輸Ringers乳酸鹽溶液。手術(shù)前，靜脈注射10ml/kg-bw的頭孢唑林(Cefazoline)以預防感染。動物被放置成右邊臥姿，用聚乙烯吡酮碘處理皮膚，使用布比卡因(0.25％)滲透，并在平行于脊骨的第12節(jié)處開一側(cè)面的皮膚切口。在切開皮膚和皮下胸腰筋膜后，取出最長腰肌和腰髂肋肌。通過左邊腹膜后方法暴露腹部動脈，移動到左邊的腎動脈下方一點。一根PE-60管從左側(cè)腎動脈遠端繞住動脈，并且兩端都穿過一個大一點的橡膠管。通過拉動PE管，非外傷性的結(jié)扎腹部動脈20分鐘。
在腹部動脈結(jié)扎以靜脈丸劑形式施用肝素(400IU)。結(jié)扎20分鐘后，去除橡膠管和導管，縫合切口并監(jiān)護動物直到痊愈，同時對動物順序進行神經(jīng)學功能的檢測。在解開腹部動脈結(jié)扎后立即給對照組動物靜脈注射通常的鹽水。在重新灌注后立即給另一組動物靜脈注射6.5μg/kg-bw的感興趣的EPO化合物(每組的n＝6)。
由不了解動物所受治療的檢測者在重新灌注后1小時、24小時、和48小時根據(jù)Drummond和Moore的標準進行運動功能評價。每只動物得分為0到4，按如下標準打分0＝下肢麻痹，沒有明顯的后肢運動能力；1＝低的后肢運動能力，僅有微弱的抗重力運動；2＝中度的后肢運動能力并具有較強的抗重力能力但沒有從身體下面伸腿的能力；3＝很好的運動能力并具有從身體下面伸腿和跳躍的能力，但不是正常的；4＝正常的運動能力。在對下肢麻痹的動物進行每天兩次的人工膀胱排空。
如果感興趣的EPO化合物具有組織保護活性，那么施用了該EPO的動物應該相比用鹽水注射的動物應該更快更好的從損傷中痊愈。
如前所述，好幾種組織具有EPO受體，從而，可能對EPO的組織保護能力有所應答。因此，根據(jù)感興趣的EPO化合物的預期臨床用途，技術(shù)人員能夠認識到也可以進行涉及這些另外的應答細胞的類似體外檢測，或進行涉及到相應器官的體內(nèi)檢測。例如，基于血清去除的體外檢測可以利用心肌、視網(wǎng)膜、和Leydig細胞以類似于上述用于P19檢測的方法來進行。
體內(nèi)檢測也可以直接用于具體的器官。例如，為了評價EPO對于視網(wǎng)膜細胞的影響，本領域內(nèi)普通的技術(shù)人員可以進行上述的視網(wǎng)膜局部缺血檢測。另外，為了評價EPO類似物對于心肌細胞的影響，本領域內(nèi)普通的技術(shù)人員可以容易地改變上述的心機梗塞檢測。本領域的普通技術(shù)人員能夠選擇合適的檢測方法或模型用于評價特定的EPO對促紅細胞生成應答細胞、組織或器官是否具有組織保護活性。
實施例下面所述的實施例僅僅用于解釋本發(fā)明的優(yōu)選實施例，不能解釋為限制本發(fā)明，本發(fā)明的范圍是由附加的權(quán)利要求所限定的。
實施例1化學修飾的EPOA.糖鏈的氧化EPO的糖鏈部分可以使用下述的步驟轉(zhuǎn)化成酸。EPO和足以提供氧化所需量(高碘酸鈉的量越大，氧化程度越高)的高碘酸鈉可以被置于100mM乙酸鈉緩沖液中。然后該溶液冰浴20分鐘并使用蒸餾水透析。然后從透析管中取出產(chǎn)物并收集到一個干凈的試管里(產(chǎn)物I)。
定量本尼迪特溶液(18g的硫酸銅，100g的碳酸鈉(無水)，200g的檸檬酸鉀，125g的硫氰酸鉀，25g的氰亞鐵酸鉀)可以用蒸餾水溶解，最終體積為1升。然后在定量本尼迪特溶液(Quantitative Benedict Solution)中加入幾滴甲基藍。
產(chǎn)物I隨后可以被加到該定量本尼迪特溶液中直到溶液的顏色變得澄清，這表明溶液已完全氧化。然后可以將該溶液去鹽并用離心過濾裝置(UltrafreeCentrifugal Filter Unit)濃縮。然后該樣品(產(chǎn)物II)可以再進一步用蒸餾水透析。
B.用葡萄糖氧化酶對脫唾液酸形式的EPO進行氧化50到500μg的脫唾液酸形式EPO，10μl 1U/μl的葡萄糖氧化酶，和100μl 10mM的磷酸鈉緩沖液可以在15ml的圓錐形離心管中混合(總體積為110μl)。然后該混合物可以在37℃下溫育2小時，同時可用蒸餾水充分透析。然后可以從透析管中取出產(chǎn)物并收集到一個干凈的試管里(產(chǎn)物III)。
定量本尼迪特溶液(上述的)可以用蒸餾水溶解到最終體積為1升。然后可以在定量本尼迪特溶液加入幾滴甲基藍。
然后產(chǎn)物III可以加到該定量本尼迪特溶液中，直到溶液的顏色變得澄清，表明溶液已完全氧化。然后將該溶液去鹽并用離心過濾裝置(Ultrafree CentrifugalFilter Unit)濃縮。然后該樣品(產(chǎn)物IV)可以再進一步用蒸餾水充分透析。
C.EPO的硫酸化EPO可以溶解在4℃的N，N-二甲基甲酰胺(DMF-SA)中。然后加入溶解在DMF中的N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，將溶液在4℃的條件下震蕩4小時。可加入碎冰并用10N的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.5?？梢哉{(diào)整溶液的體積并在HN-S2型離心管(DAMONIEC，Needham Hts.，Massachusettes)中以1000xg離心15分鐘。然后可以將上清液充分透析。更多的有關(guān)硫酸化的描述參見S.Pongor等，Preparation of High-Potency，Non-aggregating Insulins Using a NovelSulfation Procedure，Diabetes，Vol.32，No.12，December 1983，在此全文引入作為參考。
D.將PEG鏈連接到EPO上可以通過將PEG鏈連接到氧化的糖鏈上來修飾EPO，如上述在A中獲得的(產(chǎn)物I)。修飾的程度可以通過調(diào)節(jié)氧化作用中高碘酸鹽的濃度來調(diào)控。
制備PEG-EPO偶聯(lián)產(chǎn)物時可以首先用1mM-10mM的間高碘酸鈉(Sigma)室溫下氧化EPO(2-4mg/ml在50mM乙酸鈉中)30分鐘。然后在100mM，pH5.4的乙酸鈉中通過緩沖交換除去磷酸緩沖液。
各種分子量的甲氧基-PEG-酰肼(Nektar Therapeutics)隨后可以以5到100倍的摩爾過量(多聚物蛋白質(zhì))加入。然后可以通過加入15mM的氰化硼氫化鈉(Sigma)，在4℃反應過夜減少中間酰肼連接。獲得的偶聯(lián)物然后可以用本領域熟知的技術(shù)分餾/純化。
E.連接PEG鏈到脫唾液酸的EPO脫唾液酸形式的EPO可以通過在用半乳糖氧化酶氧化后，將PEG鏈連接到新生成的末端半乳糖殘基上而進行修飾，如那些在上述B中獲得的產(chǎn)物(產(chǎn)物III)。
重組人類EPO(rhuEPO)可以根據(jù)制造商手冊用唾液酸酶(Prozyme，Inc)進行去唾液酸化?；瘜W修飾優(yōu)選是通過將反應產(chǎn)物進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳上來確定。染色的產(chǎn)物帶應該表明修飾的EPO具有約31kDa的表觀分子量，而未修飾的EPO具有約34kDa的分子量。保留在EPO中的唾液酸優(yōu)選少于0.1mol/mol EPO。
獲得脫唾液酸形式的EPO后，新暴露的EPO(2-4mg/ml，在10mM的磷酸鈉緩沖液中)的半乳糖殘基可以用每毫升EPO溶液100單位的半乳糖氧化酶(Sigma)(溶于PBS中)進行氧化。反應混和物然后在37℃溫育2小時。
然后在pH5.4的100mM乙酸鈉中通過緩沖交換去除磷酸緩沖液。然后將各種分子量的甲基化-PEG-酰肼(Nektar Therapeutics)以5到100倍的摩爾過量(多聚物蛋白質(zhì))加入。然后優(yōu)選通過加入15mM的氰化硼氫化鈉(Sigma)進一步減少中間酰肼連接，在4℃反應過夜。然后可以用本領域熟知的技術(shù)分餾/純化獲得的偶聯(lián)物。
F.連接PEG鏈到脫唾液酸的EPO脫唾液酸形式的EPO可以通過在用半乳糖氧化酶氧化后，將PEG鏈連接到新生成的末端半乳糖殘基上而進行修飾，如那些在上述B中獲得的產(chǎn)物(產(chǎn)物III)。
RhuEPO(1mg)可以用唾液酸苷酶(Seikagaku Corporation of Japan，將1U的凍干粉溶解在100μL的75mM NaPO4(pH6.5)中)以1mgEPO比0.05單位唾液酸苷酶(5μL)的比例進行去唾液酸化。然后在混合物中添加5個單位(5μL)的半乳糖氧化酶(450μL溶解在75mMNaPO4(pH6.5)(Sigma)中)。
然后通過緩沖交換在pH5.4的100mM乙酸鈉中去除磷酸緩沖液。然后向混合物中加入PEG-NH2(750分子量，Nektar Therapeutics)和15mM的氰化硼氫化鈉(Sigma)然后在4℃反應過夜。優(yōu)選地，PEG-NH2加入量為250倍的摩爾過量(多聚物蛋白質(zhì))(80mg的PEG-NH2)。然后用本領域熟知的技術(shù)分餾/純化獲得的偶聯(lián)物。
實施例2.功能檢測A.促紅細胞生成檢測一種特定的EPO化合物的促紅細胞生成能力，即調(diào)控血細胞比容水平的能力，通過如下的檢測方法確定。
TF1是—種完全依賴于生長因子(包括EPO)的人類紅細胞白血病細胞。Kitamura，等，Blood 73，375-80。TF1細胞系從ACTT獲得并且用含有2mM L-谷氨酰胺，10mM Hepes，1mM丙酮酸鈉，4.5g/L葡萄糖，1.5g/L重碳酸鈉，5ng/mlGM-CSF，和10％胎牛血清的RPMI 1640一直保存到實驗時。從活性生長期獲得的TF1細胞被沉淀下來，用培養(yǎng)液單獨沖洗三次，并以1ml培養(yǎng)液中含有105個細胞的濃度重懸浮，其中可以有或沒有GM-CSF，并且添加有特定濃度的EPO或具有至少一個增加的N-連接的糖鏈和/或至少一個增加的O-連接的糖鏈的EPO類似物。各培養(yǎng)物保持24小時，使用formazan反應物(CellTiter；Promega，WI)根據(jù)制造商手冊來確定細胞的數(shù)目。
EPO化合物的活性通過觀察它對雌性BALB/c小鼠血紅蛋白濃度的影響而首先進行體內(nèi)評價。給動物皮下施用500U/kg-bw的EPO，感興趣的EPO化合物，或等體積的載體，1周3次總共3周(足以觀察到促紅細胞生成反應的時間間隔)。如果EPO化合物提高了小鼠的血清血紅蛋白的濃度，那么就認為其具有促紅細胞生成活性。進—步的活性檢測通過在體外使用TF1紅細胞白血病細胞而獲得。研究確認如果相對TF1細胞數(shù)的增加超過了對照組，那么就認為EPO具有促紅細胞生成活性。
本領域的普通技術(shù)人員知道其它的檢測方法，如組織缺氧小鼠檢測方法和網(wǎng)狀細胞檢測方法(歐洲藥典)，也適用于本發(fā)明以確定促紅細胞生成活性。
B.組織保護活性檢測具有至少—個增加的N-連接的糖鏈和/或至少一個增加的O-連接的糖鏈的EPO類似物的組織保護功能通過如下的方法來檢測。
由18天大的大鼠胚胎的海馬體構(gòu)建神經(jīng)元培養(yǎng)物。從腦膜中取出并分離腦部，分離出海馬體。然后細胞分散在2.5％的胰蛋白酶溶液中，在37℃下溫育5分鐘，然后滴定。細胞懸浮液用不含血清的、含有1％B-27的補充液(Gibco，Rockville，MD，USA)的神經(jīng)基質(zhì)(neurobasal)培養(yǎng)液稀釋，并以每片蓋玻片80,000個細胞密度放置在覆蓋有多聚鳥苷酸的蓋玻片上。細胞然后用EPO過夜預處理，然后暴露在5μM TMT中24小時，有或沒有1)EPO，2)具有至少一個增加的N-連接的糖鏈和/或至少—個增加的O-連接的糖鏈的EPO類似物，或3)脫唾液酸形式的EPO。然后在體外使用介于10到14天的培養(yǎng)物。
可以通過溴化3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-聯(lián)苯四唑(MTT)檢測來測定細胞的存活力。Denziot，F(xiàn)，and Lang，R.1986.Rapid Colormetric Assay forCell Growth and Survial.Modifications to the tetrazolium dye procedure givingimproved reliability.J Immunol Methods 89271-277。簡言之，將MTT四唑鹽溶解在不含血清的培養(yǎng)液中，至最終濃度為0.75mg/ml并在處理結(jié)束時加入到細胞中，在37℃下3小時。然后去除培養(yǎng)液并用1N HCl∶異丙醇(1∶24)提取formazan。在微量培養(yǎng)板讀數(shù)器上讀取560nm處的吸收值。
如在附圖1A中描述的那樣，具有至少一個增加的N-連接的糖鏈和/或至少—個增加的O-連接的糖鏈的EPO類似物不具有組織保護功能。
這里描述和要求保護的發(fā)明的范圍不被本文所公開的具體實施方案所限制，因為這些具體實施方案僅用于解釋本發(fā)明的幾個方面。任何等價的實施方案也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實上，除了那些在這里描述的發(fā)明以外，本發(fā)明的各種修飾對本領域的普通技術(shù)人員來說，在閱讀了前面的描述之后將是顯而易見的。這樣的修飾也落在了所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。在此引用的所有文獻為各種目的全文引入作為參考。
權(quán)利要求
1.調(diào)節(jié)人類血細胞比容水平的方法，包括以下的步驟提供比rhuEPO具有更長血清半衰期并包含組織保護功能的促紅細胞生成素產(chǎn)品；和施用治療有效量的該促紅細胞生成素產(chǎn)品。
2.權(quán)利要求1所述的方法，所述提供促紅細胞生成素產(chǎn)品的步驟還包括以下的步驟用至少一種化學修飾在rhuEPO的至少一條N-連接的寡糖鏈或O-連接的寡糖鏈上修飾，其中，所述的化學修飾包括氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其組合。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述施用治療有效量的該促紅細胞生成素產(chǎn)品的步驟包括以低于rhuEPO的摩爾量施用該促紅細胞生成素產(chǎn)品以獲得相當?shù)哪繕搜毎热荨?br> 4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的血清半衰期比rhuEPO的血清半衰期至少長約20％。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的血清半衰期比rhuEPO的血清半衰期至少長約40％。
6.人工促紅細胞生成素產(chǎn)品包括至少一種促紅細胞生成素衍生物，其中至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈具有至少一種化學修飾，所述化學修飾來源于氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其混合，并且其中所述促紅細胞生成素產(chǎn)品的血清半衰期比rhnEPO長。
7.權(quán)利要求6所述的促紅細胞生成素產(chǎn)品，其中，所述的促紅細胞生成素產(chǎn)品具有組織保護功能。
8.權(quán)利要求6所述的促紅細胞生成素產(chǎn)品，所述的至少一種化學修飾包括至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈的氧化以提供至少一個增加的酸殘基。
9.權(quán)利要求6所述的促紅細胞生成素產(chǎn)品，所述的至少一種化學修飾包括至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈的硫酸化以在該促紅細胞生成素產(chǎn)品上提供增加的負電荷。
10.權(quán)利要求6所述的促紅細胞生成素產(chǎn)品，所述的至少一種化學修飾包括至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈的磷酸化以在該促紅細胞生成素產(chǎn)品上提供增加的負電荷。
11.權(quán)利要求6所述的促紅細胞生成素產(chǎn)品，所述的至少一種化學修飾包括在至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈上增加至少一條聚乙二醇鏈。
12.制備具有延長的血清半衰期和組織保護活性的促紅細胞生成素產(chǎn)品的方法，包括以下的步驟提供至少一種促紅細胞生成素或促紅細胞生成素衍生物；和在至少一種內(nèi)源性或重組促紅細胞生成素的至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈上通過氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其組合進行修飾。
13.權(quán)利要求12所述的方法，所述的修飾步驟還包括用至少一個酸殘基取代至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈上的至少一個鄰位羥基的步驟。
14.權(quán)利要求13所述的方法，所述的用至少一種酸殘基取代至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈上的至少一個鄰位羥基的步驟還包括用多個酸殘基取代至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈上的多個鄰位羥基。
15.權(quán)利要求12所述的方法，所述的修飾步驟還包括以下的步驟提供一種有機溶劑；在該有機溶劑中溶解該促紅細胞生成素或促紅細胞生成素衍生物以形成溶液；提供至少一種縮合劑；提供至少一種硫酸鹽供體；和將所述的至少一種縮合劑和至少一種硫酸鹽供體混合到溶液中。
16.權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述的修飾步驟還包括以下的步驟提供一種有機溶劑；在該有機溶劑中溶解該促紅細胞生成素或促紅細胞生成素衍生物以形成溶液；提供至少一種縮合劑；提供磷酸；和將所述的至少一種縮合劑和至少一種磷酸混合到上述溶液中。
17.權(quán)利要求12所述的方法，所述的修飾步驟還包括以下的步驟提供一種有機溶劑；在該有機溶劑中溶解促紅細胞生成素或促紅細胞生成素衍生物以形成第一溶液；提供至少一種氧化劑；在該第一溶液中加入該至少一種氧化劑以形成第二溶液；提供至少一種聚乙二醇鏈；和將所述至少一種聚乙二醇鏈混合到第二溶液中。
18.權(quán)利要求17所述的方法，所述的提供至少一種聚乙二醇鏈的步驟包括提供鏈的末端具有至少一個伯氨基團的至少一種聚乙二醇鏈。
19.治療處于組織損傷危險中的病人貧血的方法，包括如下的步驟提供在至少一條N-連接的寡糖鏈或O-連接的寡糖鏈上有至少一種化學修飾的促紅細胞生成素產(chǎn)品，其中所述的化學修飾包括氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其組合；施用治療有效量的所述促紅細胞生成素產(chǎn)品，其中所述的促紅細胞生成素產(chǎn)品施用的摩爾量低于rhuEPO，以獲得相當?shù)哪繕搜毎热荩渲兴龅拇偌t細胞生成素產(chǎn)品具有細胞保護功能。
20.權(quán)利要求19所述的方法，所述的促紅細胞生成素產(chǎn)品具有比rhuEPO長的血清半衰期。
21.權(quán)利要求20所述的方法，所述的血清半衰期比rhuEPO的血清半衰期至少長約20％。
22.權(quán)利要求21所述的方法，所述的血清半衰期比rhuEPO的血清半衰期至少長約40％。
23.一種藥物組合物包含治療有效量的至少一種促紅細胞生成素衍生物，在其至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈上具有至少一種化學修飾，所述化學修飾來源于氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其組合，所述的至少一種促紅細胞生成素衍生物具有比重組促紅細胞生成素更長的血清半衰期并具有組織保護功能。
24.權(quán)利要求23所述的藥物組合物，還包含至少一種藥學上可接受的載體。
25.權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其中所述的至少一種藥學上可接受的載體包含至少一種稀釋劑、佐劑、賦形劑、載體、或其混合。
26.權(quán)利要求23所述的藥物組合物，還包含至少一種潤濕劑、乳化劑、pH緩沖劑或其組合。
27.權(quán)利要求23所述的藥物組合物，還包含至少一種組織保護細胞因子。
全文摘要
一種通過施用含有化學修飾的長效促紅細胞生成素的藥物組合物增加個體血細胞比容同時保持了內(nèi)源性組織保護活性的方法。同時也公開了一種新的化學修飾的長效促紅細胞生成素，制備該化學修飾的長效促紅細胞生成素的方法，和含有該化學修飾的長效促紅細胞生成素的組合物。
文檔編號C07K1/10GK1729015SQ03824915
公開日2006年2月1日 申請日期2003年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月9日
發(fā)明者A·切拉米, J·斯馬特, M·布賴恩斯, C·切拉米 申請人:沃倫藥品公司, 肯尼思·S·沃倫研究院