煙草花葉病毒衣殼蛋白突變體制備二維納米結(jié)構(gòu)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及納米生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草花葉病毒衣殼蛋白突變體，尤 其涉及應(yīng)用該煙草花葉病毒衣殼蛋白突變體制備二維納米結(jié)構(gòu)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)由二十多種氨基酸組成，結(jié)構(gòu)豐富多樣。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蛋白結(jié)構(gòu)就有球、 桿、層和多面體等。送些結(jié)構(gòu)為制備各種納米材料提供理想的模板。病毒衣殼蛋白是其中 一類重要代表，已作為一種結(jié)構(gòu)精確定義的有機納米材料被廣泛應(yīng)用于納米技術(shù)領(lǐng)域。首 先，病毒具有尺寸優(yōu)勢，絕大多數(shù)的病毒大小集中在lOnm~lOOnm之間，正好符合納米材料 尺寸要求。其次，同種病毒顆粒形貌均一，單分散性好。第H，病毒往往僅由核酸和蛋白質(zhì) 外殼組成，其蛋白衣殼可作為納米容器進行藥物運載或作為微型反應(yīng)器。不同的病毒其蛋 白質(zhì)外殼往往不同，結(jié)構(gòu)上的差異提供了更多的模板選擇。
[0003]結(jié)合基因克隆技術(shù)，可方便實現(xiàn)對病毒蛋白特定位點進行改造或修飾，如引進功 能基團、插入或敲除特定氨基酸或多膚，從而獲得具備理想功能的蛋白模板。
[0004]生物礦化是指生物體通過生物大分子的調(diào)控生產(chǎn)無機礦物的過程。即在一定的物 理化學(xué)條件下，通過生物大分子的功能基團和無機離子在界面處的相互作用，從分子水平 上控制無機礦物相的結(jié)晶、生長，從而使生物礦化具有特殊的分級結(jié)構(gòu)和組裝方式。W病毒 衣殼蛋白為模板礦化無機納米材料是近年來納米生物技術(shù)發(fā)展的重要組成部分，但目前取 得成就主要集于在W球狀病毒模板合成功能納米顆粒。
[0005] 二維納米結(jié)構(gòu)，特別是超細二維納米結(jié)構(gòu)，往往具有優(yōu)良的理化性質(zhì)。利用現(xiàn)有技 術(shù)中的病毒蛋白模板形成二維納米結(jié)構(gòu)往往合成步驟復(fù)雜、反應(yīng)條件不夠溫和，且形成的 二維納米結(jié)構(gòu)生物相容性較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提出應(yīng)用一種煙草花葉病毒衣殼蛋 白突變體組裝形成病毒顆粒模板制備二維納米結(jié)構(gòu)的方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中二維納米結(jié)構(gòu) 合成步驟復(fù)雜、反應(yīng)條件不夠溫和，且形成的二維納米結(jié)構(gòu)生物相容性較差的技術(shù)問題。
[0007] 本發(fā)明應(yīng)用了一種煙草花葉病毒衣殼蛋白突變體，所述突變體序列由SEQID No. 1所示的氨基酸序列經(jīng)點突變得到，所述點突變?yōu)椋旱?03位突變?yōu)榘朊摪彼帷?br>[0008] 優(yōu)選地，所述煙草花葉病毒衣殼蛋白突變體序列為SEQIDNo. 2所示的氨基酸序 列。
[0009] 另外，本發(fā)明還提供了上述煙草花葉病毒衣殼蛋白突變體的編碼基因。
[0010] 優(yōu)選地,所述編碼基因序列為SEQIDNo. 3所不。
[0011] 本發(fā)明提供了一種基于管狀病毒顆粒的二維納米結(jié)構(gòu)的制備方法，應(yīng)用上述突變 體構(gòu)建納米結(jié)構(gòu)，該方法包括如下步驟：
[0012] S1、在煙草花葉病毒的衣殼蛋白中引入半脫氨酸：
[0013]將煙草花葉病毒的衣殼蛋白單體氨基酸序列第103位突變?yōu)榘朊摪彼幔瑯?gòu)建載 體，并在生物體中實現(xiàn)表達，經(jīng)陰離子層析柱純化，獲得改造后的病毒衣殼蛋白單體；
[0014]S2、管狀病毒顆粒模板的生成：
[0015] 將步驟S1所得改造后的病毒衣殼蛋白單體置于磯酸鹽緩沖液中進行透析，隨后 進行藏糖連續(xù)密度梯度離必，再將離必后所收集沉淀置于磯酸鹽緩沖液中進行透析，最后 進行超濾濃縮得到管狀病毒顆粒模板；
[0016]S3、管狀病毒二維納米結(jié)構(gòu)生成：
[0017] 將步驟S2所得管狀病毒顆粒模板、貴金屬離子溶液進行混合，再加入第一還原劑 進行混合，W形成管狀病毒內(nèi)核；繼續(xù)分多次加入貴金屬離子和第二還原劑進行混合，W形 成管狀病毒二維納米結(jié)構(gòu)；
[0018] 其中，貴金屬離子選自金離子、鉛離子或笛離子中的一種。
[0019] 優(yōu)選地，步驟S1具體為：將煙草花葉病毒的衣殼蛋白單體氨基酸序列第103位突 變?yōu)榘朊摪彼幔瑯?gòu)建載體，將載體表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL2UDE3)感受態(tài)細胞，在LB培養(yǎng) 基中培養(yǎng)細菌并誘導(dǎo)表達重組蛋白，其后依次經(jīng)離必、破碎、硫酸倭分級沉淀和柱層析分離 純化，獲得改造后的病毒衣殼蛋白。
[0020] 優(yōu)選地，步驟S1包括如下步驟：
[0021]a、將載體表達質(zhì)粒用氯化巧法轉(zhuǎn)入E.coliBL2UDE3)感受態(tài)細胞，涂平板至少 1化后，挑取單克隆接入LB培養(yǎng)基中，加入抗生素，于37°C恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，其后按照1 % 接種量轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，加入抗生素，于37Γ恒溫振蕩培養(yǎng)，并加入誘導(dǎo)劑，在3(TC繼續(xù) 誘導(dǎo)培養(yǎng)，離必收集菌體，其中，所述抗生素包括氨予青霉素，所述誘導(dǎo)劑包括異丙基硫代 半乳糖巧；
[0022] b.將收集到的菌體重懸于裂解緩沖液中進行超聲破碎，于4°C離必，取離必后所 得上清液依次進行硫酸倭分級沉淀和陰離子層析，獲得改造后的病毒衣殼蛋白。
[0023] 優(yōu)選地，步驟S2具體為；將步驟S1所得改造后的病毒衣殼蛋白置于磯酸鹽緩沖液 中進行透析，至少5天，隨后進行藏糖連續(xù)密度梯度離必，再將離必后所收集沉淀置于磯酸 鹽緩沖液中進行透析并通過SDS-PAGE進行定量，最后通過30KD超濾離必管濃縮至0. 8mg/ mU獲得管狀病毒顆粒模板。
[0024] 優(yōu)選地，步驟S3中貴金屬離子選自氯金酸、氯鉛酸或氯笛酸中的一種。
[00巧]優(yōu)選地，步驟S3中所述第一還原劑為測氨化鋼，所述第二還原劑為維生素C或二 甲基胺測焼。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果包括；本發(fā)明通過基因修飾形成的煙草花葉 病毒衣殼蛋白突變體在原來的衣殼蛋白中引入半脫氨酸，在亞基間形成二硫鍵，改變了衣 殼蛋白原本脆弱的非共價鍵自組裝體系，該突變體的體外自組裝能力大大提高，該突變體 能夠形成穩(wěn)定的管狀病毒顆粒模板；本發(fā)明的基于管狀病毒顆粒的二維納米結(jié)構(gòu)的制備方 法，采用上述突變體或者包含該突變體的重組蛋白形成管狀病毒顆粒模板，實現(xiàn)了基于管 狀病毒顆粒模板的礦化制備二維納米結(jié)構(gòu)，該制備方法步驟簡單，反應(yīng)條件溫和，所制備 出的二維納米結(jié)構(gòu)具有良好的生物相容性，表面易于修飾。
【附圖說明】
[0027] 圖1是本發(fā)明實施例2的管狀病毒顆粒模板的電鏡圖；
[0028] 圖2是本發(fā)明實施例3的二維納米結(jié)構(gòu)的電鏡圖，
[0029] 其中，圖2中a表示在管狀病毒內(nèi)核繼續(xù)分多次加入貴金屬離子和第二還原劑進 行混合W形成管狀病毒二維納米結(jié)構(gòu)過程中貴金屬離子和第二還原劑的加入次數(shù)為7所 形成二維納米結(jié)構(gòu)的電鏡圖，b、C、d的加入次數(shù)分別為10、14和24 ;
[0030] 圖3是本發(fā)明實施例4的二維納米結(jié)構(gòu)的電鏡圖，
[0031] 其中，圖3中a是電鏡圖的局部圖，b是局部放大圖；
[0032] 圖4是本發(fā)明實施例5的二維納米結(jié)構(gòu)的電鏡圖；
[0033] 圖5是本發(fā)明實施例6的二維納米結(jié)構(gòu)的電鏡圖。
【具體實施方式】
[0034] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0035] 除非另有定義，本發(fā)明使用的所有科技術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的相 同含義。關(guān)于本領(lǐng)域的定義及術(shù)語，專業(yè)人員可參考化rrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel)。氨基酸殘基的縮寫是本領(lǐng)域中所用的指代20個常用k氨基酸之一的 標準3字母和/或1字母代碼。
[0036] 盡管本發(fā)明的廣義范圍所示的數(shù)值本來就必然含有一定的誤差，其是由它們各自 測量中存在的標準偏差所致。另外，本發(fā)明公開的所有范圍應(yīng)理解為涵蓋其中包含的任何 和所有子范圍。例如記載的"1至10"的范圍應(yīng)理解為包含最小值1和最大值10之間（包 含端點）的任何和所有子范圍；也就是說，所有W最小值1或更大起始的子范圍，例如1至 6. 1，W及W最大值10或更小終止的子范圍，例如5. 5至10。另外，任何稱為"并入本文"的 參考文獻應(yīng)理解為W其整體并入。
[0037]另外應(yīng)注意，如本說明書中所使用的，單數(shù)形式包括其所指對象的復(fù)數(shù)形式，除非 清楚且明確的限于一個所指對象。術(shù)語"或"可與術(shù)語"和/或"互換使用，除非上下文另 有清楚指明。
[003引成熟的煙草花葉病毒（TMV)的衣殼蛋白是由大約2130個具有相同氨基酸序列的 蛋白質(zhì)單體通過自我組裝的方式組成的，其為非共價鍵自組裝體系，其納米管狀的幾何外 形、高活性的內(nèi)外表面可被作為一種構(gòu)筑低維材料的模板，其中，每個單體由158個氨基酸 組成（如SEQIDNo.1所示），對上述單體進行修飾改造，在其氨基酸序列中引入半脫氨酸， 得到改造后的單體，本發(fā)明所提及的TMV衣殼蛋白突變體即為上述改造后的單體，每個改 造后的單體之間可通過二硫鍵結(jié)合，有助于提高體外自組裝能力，多個改造后的單體（TMV 衣殼蛋白突變體）自組裝形成的改造后的TMV衣殼蛋白比野生型TMV衣