表達(dá)豬細(xì)小病毒vp2蛋白的重組載體、重組菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組載體、重組菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus, PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，尤其是初產(chǎn)母豬在沒有免疫的條件下發(fā)病更為嚴(yán)重，以死胎、木乃伊胎、死產(chǎn)、母豬流產(chǎn)、延期發(fā)情和產(chǎn)弱仔為主要特征。1967年Cartwright首次分離出PPV后，該病毒在世界范圍內(nèi)廣泛傳播和流行。上世紀(jì)80年代我國改革開放以后，隨著規(guī)模化豬場逐漸增多，PPV在我國的感染越發(fā)嚴(yán)重，陽性檢出率達(dá)90%以上，給我國的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PPV屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬，PPV基因組編碼有3種結(jié)構(gòu)蛋:VP1、VP2和VP3，3種非結(jié)構(gòu)蛋白:NS1、NS2和NS3。其中VP2蛋白是構(gòu)成PPV病毒衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，且是最重要的免疫保護(hù)性抗原。
[0003]許多研究和臨床實踐表明疫苗免疫是控制PPV流行的一個很有效的方法。豬體免疫后，主要通過產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答來獲得抵抗PPV感染的保護(hù)力。我國用于預(yù)防PPV的疫苗主要為滅活疫苗，即將PPV在ST細(xì)胞等豬源傳代細(xì)細(xì)胞系上進(jìn)行培養(yǎng)，分離去除細(xì)胞雜質(zhì)獲得具有感染性病毒，之后用化學(xué)試劑滅活、佐劑混合制成疫苗。PPV滅活疫苗具有安全性好、不需要低溫保存等優(yōu)點。但滅活疫苗也存在著生產(chǎn)成本昂貴、生產(chǎn)耗時長、需要大量勞動力、且免疫效果不穩(wěn)定的缺點；另外，滅活的化學(xué)試劑和殘留病毒DNA可能對免疫豬體存在危險性。新型PPV亞單位疫苗獲得了廣泛的研究，VP2在體外表達(dá)后不僅具有良好的免疫原性，而且可以誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫保護(hù)性。目前用于研究豬細(xì)小病毒亞單位疫苗抗原的表達(dá)系統(tǒng)主要是桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)蛋白具有高可溶性和血凝性，能產(chǎn)生病毒樣顆粒，免疫保護(hù)效果較好，但其生產(chǎn)成本比PPV滅活疫苗高出數(shù)倍，在生產(chǎn)操作方面更為復(fù)雜，對人員素質(zhì)要求更高。通常情況下，原核表達(dá)系統(tǒng)相比較于真核系統(tǒng)，蛋白表達(dá)量高、生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)操作更為簡單，對人員素質(zhì)要求也更低，但是現(xiàn)有技術(shù)中，采用原核表達(dá)系統(tǒng)制備的VP2蛋白為不具有可溶性和血凝性的包涵體，免疫原性較差，免疫后免疫指標(biāo)不好用通用HI試驗進(jìn)行評定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組載體，將該重組載體導(dǎo)入大腸桿菌后，能夠可溶性表達(dá)VP2蛋白，該VP2蛋白具有血凝性和優(yōu)異的抗原性。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供制備豬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組菌，能夠可溶性表達(dá)VP2蛋白，該VP2蛋白具有血凝性和優(yōu)異的抗原性，可以用于制備豬細(xì)小病毒疫苗。
[0006]本發(fā)明的再一目的是提供制備豬細(xì)小病毒VP2蛋白的方法，該方法能夠高效制備VP2蛋白、生產(chǎn)成本低、操作簡單，不操作豬細(xì)小病毒具有更好的生物安全性。從實際操作性考慮，有望代替滅活疫苗制苗用抗原。
[0007]本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)。
[0008]表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組載體，是將豬細(xì)小病毒VP2蛋白編碼基因插入原核表達(dá)載體pEASY-blunt El后得到。
[0009]在本發(fā)明中，所述豬細(xì)小病毒VP2蛋白編碼基因來源于豬細(xì)小病毒PPV-JS株。
[0010]本發(fā)明還提供表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組菌，是將所述重組載體導(dǎo)入大腸桿菌后獲得。
[0011]所述大腸桿菌為BL-21。
[0012]本發(fā)明還提供所述重組菌在制備豬細(xì)小病毒VP2蛋白方面的應(yīng)用。
[0013]在本發(fā)明中，所述應(yīng)用包括誘導(dǎo)所述重組菌表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的步驟。
[0014]優(yōu)選的技術(shù)方案在，在重組菌培養(yǎng)物0D600達(dá)到0.4-0.6時，采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白。
[0015]優(yōu)選的技術(shù)方案中，IPTG添加至重組菌培養(yǎng)物中的終濃度為0.05-0.2mM。
[0016]本發(fā)明表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組載體，導(dǎo)入大腸桿菌后，能夠可溶性表達(dá)VP2蛋白，該VP2蛋白具有血凝性和優(yōu)異的抗原性，有望應(yīng)用于制備豬細(xì)小病毒疫苗。采用本發(fā)明重組菌能夠高效制備豬細(xì)小病毒VP2蛋白，生產(chǎn)成本低、操作簡單、不操作豬細(xì)小病毒具有更好的生物安全性。
【附圖說明】
[0017]圖1顯示了 VP2蛋白編碼基因的擴(kuò)增結(jié)果，其中泳道M為DL 2 000 Marker，其余泳道為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0018]圖2顯示了重組質(zhì)粒P-PPV-VP2的雙酶切鑒定結(jié)果，其中泳道M為DL 2 000Marker，泳道I為陽性重組質(zhì)粒p_PPV_VP2。
[0019]圖3顯示了 VP2蛋白在BL-21-VP2和對照菌BL-21-p中的表達(dá)情況。Marker:Thermo Scientific PageRuler 預(yù)染Ladder ；1:對照菌BL_21_p裂解液上清；2:BL_21_VP2裂解液上清；3:對照菌BL-21-p裂解液沉淀；4:BL-21-VP2裂解液沉淀。
[0020]
圖4是各樣品血凝性檢測結(jié)果，每行左邊顯示了孔的編號，每行樣品從左往右濃度依次降低。
[0021]圖5顯示了 0D600為0.4、0.5和0.6時誘導(dǎo)后，菌體裂解液上清的血凝性檢測結(jié)果，其中最左邊的標(biāo)記表明每行樣品誘導(dǎo)前的0D600值，右邊給出每行樣品的血凝效價。
[0022]圖6.采用PPV-JS或BL-21-VP2的4單位抗原檢測待檢血清的HI抗體效價結(jié)果，其中左邊的文字指出每行檢測的血清，右邊的文字指出孔的編號。
【具體實施方式】
[0023]實施例1構(gòu)建表達(dá)VP2蛋白的重組菌一構(gòu)建重組表達(dá)載體
1.引物設(shè)計
參照PPV- NADL2株基因序列(KF049424.1)，應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計引物PPV-VP2-kpn i和PPV-VP2_bamh i，用于擴(kuò)增豬細(xì)小病毒PPV-JS株(縮寫為PPV-JS株，公開于CN102965345A，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號為CGMCCN0.6605) VP2蛋白編碼基因全部序列。
[0024]PPV-VP2-kpn i 的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)如下:ggtaccATGAGTGMMTGTGGMCMG，PPV-VP2-bamh i 的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)如下:ggatccCTAGTATMTTTTCTTGGTAT，由上海英駿生物有限公司合成。其中PPV-VP2-kpn i攜帶Kpn I酶切位點，PPV-VP2_bamh i攜帶Bamh I酶切位點。
[0025]2.PPV-JS株基因組DNA的提取
(1)取PPV-JS株病毒樣品450μ I加入50 μ 1、濃度為10%的SDS溶液，加入3 μ I蛋白酶K ;
(2)在56°C水浴中震蕩條件下孵育30min;
(3)加入500μ I的TRIS-酚，混勻，5分鐘后，在4°C、10000-12000r/min條件下離心10分鐘；
(4)取上清，加入1:1(V/V)混合的TRIS-酚和氯仿混合物500 μ 1，作用5分鐘后10000-12000r/min 離心 10 分鐘；
(6)取上清，加入500μ I的氯仿，作用5分鐘，10000-12000r/min離心10分鐘；
(7)取上清，加上清體積2倍的無水乙醇和10%(體積百分濃度)的醋酸鈉水溶液；
(8)將步驟(7)所得混合物置于_20°C下30分鐘以上；
(9)取_20°C下放置的樣品在4°C、10000r/min離心10分鐘；
(10)棄上清，在沉淀中加入75%(體積百分濃度)的乙醇水溶液，在4°C、6500r/min離心5分鐘，棄去上清；重復(fù)2遍；
(11)吸干或者晾干乙醇；
(12)加入30μ I的ddH20溶解，得到PPV-JS株基因組DNA，置于_20°C下保存。
[0026]3.VP2蛋白編碼基因的擴(kuò)增和純化回收
(I)將反應(yīng)體系設(shè)定為50 yL體系:0.5 μ L PrimerSTAR高保真酶，10 μ L 5XPSBuffer, 4 μ L dNTPs，引物 PPV_VP2_kpn i 和 PPV-VP2_bamh i各 I yL(20 ymol/L),2 yLPPV-JS 株基因組 DNA, 28.5 μ L ddH20。
[0027](2)反應(yīng)條件:98°C 2min ；98°C 15s，60°C 30 s，72 °C 2min，30 個循環(huán)；72°C5min。產(chǎn)物在4°C保存。
[0028](3)采用1%瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增的基因片段，以DL 2 000 Marker作為對照。結(jié)果如圖1所示，在大約1.7kb處出現(xiàn)特異性的VP2蛋白編碼基因條帶。采用OMEGA DNA凝膠回收試劑盒回收VP2蛋白編碼基因。具體操作見說明書。
[0029]豬細(xì)小病毒PPV-JS株VP2蛋白編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0030]PCR過程中用到的試劑購自TAKARA。
[0031]4.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
(I)將VP2蛋白編碼基因插入pEASY-blunt El原核表達(dá)載體(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，構(gòu)建重組質(zhì)粒P-PPV-VP2。連接體系為5yL體系:2yL VP2蛋白編碼基因膠回收產(chǎn)物，I μ L pEASY-blunt El 載體，2 μ L ddH20。24°C連接 20min。
[0032](2)將連接產(chǎn)物加入到100 μ L的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，之后42°C熱休克90 S，冰浴5 min。加入ImL LB培養(yǎng)基，37°C搖床上180 rpm培養(yǎng)I h，取出后1000g離心I min，棄800 μ L上清，留200 μ L上清重懸菌體，全部涂布具有氨芐(Amp)抗性的LB平板上，37 °C培養(yǎng)過夜。
[0033](3)隨機(jī)挑取上述LB平板上的單菌落，接種于具有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C過夜培養(yǎng)。
[0034]5.質(zhì)粒的提取
采用鼎國質(zhì)粒小量提取試劑盒提取本實施例步驟4中挑選到的重組菌內(nèi)的質(zhì)粒，具體操作步驟見試劑盒說明書。
[0035]6.重組質(zhì)粒的鑒定
10 μ L 雙酶切鑒定體系:0.5 yL BamH I，0.5 μ L Kpn I，I μ L 1XK Buffer, 4 μ L質(zhì)粒，4yL ddH20，37°C酶切I h。酶切產(chǎn)物的電泳圖如圖2所示，質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Kpn I酶切鑒定正確，為陽性重組質(zhì)粒，命名為P-PPV-VP2。將重組質(zhì)粒P-PPV-VP2送英駿公司測序，測序正確。
[0036]二構(gòu)建重組菌
1.重組質(zhì)粒