在高溫下具有活性的hiv-1型o組的逆轉(zhuǎn)錄酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明為生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明設(shè)及逆轉(zhuǎn)錄酶，該逆轉(zhuǎn)錄酶在細(xì)菌中 表達(dá)并純化，并且具有在多個位置發(fā)生修飾的人類免疫缺陷病毒-1型0組化IV-1)的逆轉(zhuǎn) 錄酶的氨基酸序列。運(yùn)些聚合酶在升高的溫度（高于60°c)下比未突變的酶具有更高的活 性。此外，它們在超過70°C的溫度下還保持DNA合成。運(yùn)些酶的復(fù)制保真度與未突變的逆 轉(zhuǎn)錄酶不具有顯著的差異。
【背景技術(shù)】
[0002] 在逆轉(zhuǎn)錄病毒中，逆轉(zhuǎn)錄酶（RT)為負(fù)責(zé)復(fù)制病毒基因組的酶。RT將單鏈RNA基因 組轉(zhuǎn)化成能夠整合至宿主細(xì)胞基因組中的雙鏈DNA中[在LeGrice.JBiol化em，2012; 287:40850-40857中綜述]。正是運(yùn)種聚合酶可W使用RNA或DM作為模板來合成DM。此 夕F，RT還具有核酸內(nèi)切酶活性（核糖核酸酶H)，運(yùn)種活性使得RT能夠在RNA依賴的DNA合 成過程中降解RNA模板。 陽00引逆轉(zhuǎn)錄病毒RT為用于由信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)得到互補(bǔ)DNA(cDNA)的 有用的酶，當(dāng)通過傳統(tǒng)技術(shù)（例如PCR)擴(kuò)增互補(bǔ)DNA時，其可W用于檢測基因在有機(jī)體或 組織中的表達(dá)。RT的效率在許多生物技術(shù)的應(yīng)用中是重要的。例如用于mRNA的檢測，通過 實(shí)時PCR的定量，使用"微陣列"的基因表達(dá)的研究W及使用大規(guī)模測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組研究 中。但是，RNA中存在二級結(jié)構(gòu)可W降低運(yùn)些技術(shù)的有效性。在升高的溫度下能夠合成DNA 的RT得到利用可W用于改良擴(kuò)增過程中的產(chǎn)率。
[0004] 由方法學(xué)的觀點(diǎn)來看，在商業(yè)上擴(kuò)增反應(yīng)中最常用的RT為禽成髓細(xì)胞性白血病 病毒（AMV)、Moloney鼠白血病病毒（MLV) (Cot6andRoth.VirusRes2008 ;1：34:186-202) 的那些，W及人類免疫缺陷病毒1型化IV-1)的RT的變體（在化ziandHersc化orn. VirusRes2008;134:203-220中綜述）。AMV和MLVRT是RT-PCR檢測中最常用的，但是 AMV的RT在42°C至52°C的溫度范圍內(nèi)具有更好的熱穩(wěn)定性（Gerardetal.NucleicAcids Res. 2002;30:3118-3129)。存在MLVRT的變體，例如AffinityScript(Agilent)或Super ScriptIII(Invitrogen)，它們是市場上出售的在較高的溫度下具有活性的酶（Areziand Hogrefe.NucleicAcidsRes. 2009;37:473-481)。 陽〇化]使用HIV-IRT(分類屬于Μ組度亞型））進(jìn)行的研究證明運(yùn)些酶比MLVRT具 有更高的活性和熱穩(wěn)定性，但是它們被由系統(tǒng)發(fā)生不同且分類屬于0組的HIV-1衍生 得到的"野生型"RT變體超越（Aivarczetal.JMolBiol2009;392:872-884;patent W02010130864 (Al))。在用于微管蛋白信使RNA表達(dá)中的RT-PCR檢測中，MLVRT在超過52°C 的溫度下不能擴(kuò)增，但是0組或B亞型的"野生型"RT在高達(dá)64°C的溫度下是具有活性的， 而且是唯一的首先在 66-68°C下擴(kuò)增的（A!、arezetal.JMolBiol2009;392:872-884)。 HIV-IRT為由2個亞基組成的異源二聚體，其中一個亞基為560個氨基酸（稱為p66)而 另一個亞基為440個氨基酸（稱為p51)。p51的序列與p66的氨基酸1-440的序列一致。 HIV-1 0組RT表征為當(dāng)與B亞型的"野生型"原型比較時，顯示出大約20%的氨基酸序列 的差異（Q姐妨瓶如Μ泌euetal.Virology1997 ;236:364-373)。ο組的多種RT表征為比 "野生型"RT具有更高的復(fù)制保真度，例如突變V75I，K65R和K65R/V75I的載體。運(yùn)些RT 在升高的溫度下具有與"野生型"RT所示的相似的熱穩(wěn)定性和催化效率度arrioluengoet al.BiochemJ2011;436:599-607;專利W02012080541(A1))。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明設(shè)及由人類免疫缺陷病毒1型0組化iv-1)分離得到的并且在一個或多個 位置處修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶，該逆轉(zhuǎn)錄酶比原始的酶具有更高的熱穩(wěn)定性，從而保持了復(fù)制保 真度；W及本發(fā)明設(shè)及所述的逆轉(zhuǎn)錄酶用于實(shí)施核酸模板的逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增或測序的用途。
[0008] 本發(fā)明的第一個目的設(shè)及多膚，該多膚編碼了由HIV-1 0組分離得到的具有RT活 性的蛋白質(zhì)；在高溫下具有較高的穩(wěn)定性；在超過75°C的溫度下具有比WT酶更高的活性， 從而保持了復(fù)制保真度；W及表征為W下氨基酸序列，其與親代序列SEQIDNO1具有至少 50%-致性并且在其氨基酸序列中在W下的位置處包含多種改變（例如取代、刪除和/或 插入）：
[0009] -與所述的親代序列的位置358同源的位置，其使用氨基酸精氨酸（時替代原始氨 基酸賴氨酸化）（突變K358R);
[0010] -與所述的親代序列的位置359同源的位置，其使用氨基酸甘氨酸（G)替代原始氨 基酸丙氨酸（A)(突變A359G);
[0011] -與所述的親代序列的位置360同源的位置，其使用氨基酸丙氨酸（A)替代原始氨 基酸絲氨酸（S)(突變S360A)。
[0012] 此外，還描述了其他逆轉(zhuǎn)錄酶變體，其包含另外變化成組合K358R/A359G/ S360A(通常全部改變），改良了WTRT的熱穩(wěn)定性，W及在升高的溫度下使用RNA作為模板 合成DNA的能力。運(yùn)些氨基酸變化和插入屬于（例如但未限定本發(fā)明的范圍）W下幾組：
[0013] a)在與SEQIDNO1的位置69同源的位置處，通過插入2個氨基酸絲氨酸和甘氨 酸（SSG)來替代氨基酸蘇氨酸燈）（突變T69SSG);
[0014] b)在與SEQIDNO1的位置355同源的位置處，通過氨基酸丙氨酸（A)替代氨基 酸蘇氨酸燈）（突變T355A);
[0015] C)在與SEQIDNO1的位置357同源的位置處，通過氨基酸蛋氨酸（M)替代氨基 酸谷氨酷胺怕）（突變Q357M);
[0016] d)在與SEQIDNO1的位置478同源的位置處，通過氨基酸谷氨酷胺佩替代氨 基酸谷氨酸巧）（E478曲。
[0017] 作為本發(fā)明的具體目的，本發(fā)明包括多種HIV-1 0組逆轉(zhuǎn)錄酶的變體，該變體被 用作起點(diǎn)并具有上文所述的突變，并且其中具體的多膚序列相當(dāng)于SEQIDNO3,SEQID NO5,沈QIDNO7和沈QIDNO9 及它們相應(yīng)的核巧酸序列（SEQIDNO4,沈QIDNO 6,沈QIDNO8,沈QIDNO10)。
[0018] 本發(fā)明的另一個目的為載體，其包含編碼本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的多核巧酸。
[0019] 本發(fā)明的另一個目的是包含多核巧酸的細(xì)胞，其中所述的多核巧酸編碼本發(fā)明的 逆轉(zhuǎn)錄酶。優(yōu)選地，所述的細(xì)胞為細(xì)菌，還要更優(yōu)選地，為大腸桿菌巧scherichiacoli)。
[0020] 本發(fā)明的另一個目的是獲得本發(fā)明的多膚的方法，該方法包括W下步驟： 陽021] 1)將本發(fā)明的載體引入至合適的宿主細(xì)胞（本發(fā)明的宿主細(xì)胞）中；
[0022] 2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；W及
[0023] 3)純化具有RT活性的本發(fā)明的多膚。
[0024] 本發(fā)明的另一個目的設(shè)及本發(fā)明的多核巧酸用于獲得具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的本發(fā) 明的多膚的用途。
[00巧]本發(fā)明的另一個目的設(shè)及本發(fā)明的宿主細(xì)胞用于獲得本發(fā)明的多膚的用途。
[00%] 本發(fā)明的另一個目的是本發(fā)明的多膚在核酸的逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和測序方法中的用 途。其中所述的核酸優(yōu)選為mRNA。
[0027] 本發(fā)明的另一個目的設(shè)及包含用于實(shí)施本發(fā)明所述的各種方法的必需成分的試 劑盒，并且該試劑盒優(yōu)選地包含： 陽0測 a)本發(fā)明的RT;W及
[0029] b)列表中的至少一種成分，包括：
[0030]U緩沖液； 陽03UU)引物； 陽03引 iii)DNA依賴的DNA聚合酶擬及 陽〇3引iv)核巧酸。
[0034] 附圖簡述
[00對圖1.通過RT-PCR擴(kuò)增RNA片段，其中所述的片段編碼由小鼠肝臟的總RNA得到的 肌動蛋白（大約500至950個堿基對）。使用W下所示的酶來進(jìn)行擴(kuò)增：(A)HIV-1 0組"野生 型"的RT(RT0_WT*)(孔 7)，W及突變體K358R/A359G/S360A(RT0_3M*)(孔 1)，T355A/Q357M/ K358R/A359G/S360A(RT0_5M*)(孔 2)，K65R/K358R/A359G/S360A(孔 3)，K65R/V75I/K358R/ A359G/S360A(孔 4)，K358R/A359G/S360A/E478Q(RT0_E478Q_3M*)(孔 5)和K65R/K358R/ A359G/S360A/E478Q(孔 6);度)HIV-1 0 組RT的突變體：K358R/A359G/S360A(RT0_3M*)(孔 1)，T69SSG/K358R/A359G/S360A(RT0_T69SSG_3M*)(孔 2)，V148I/K358R/A359G/S360A(孔 3)和F61A/K358R/A359G/S360A(孔4)。所示的溫度是指DNA復(fù)制合成反應(yīng)?？譵和C分 別示出低分子量標(biāo)記（使用化ndIII消化的地i29隧菌體的DNA)和陰性對照（不具有 cDNA)。在RT0_WT序列中，引入了所示的所有突變。
[0036] 圖2.示出了通過實(shí)時PCR對野生型RT(由HIV-1M組B亞型BH10度化0)和0組 (RT0_WT*，在圖中示為RT0)分離得到）W及突變體（其為本專利的目的RT0_3M* (3M)，RT0_ 64789_31*(3曲和^0_了69556_31*66))^及參照突變體（其攜帶31變化特征^及1(65尺 和V75I〇(65R/V75I/K358R/A359G/S360A，KV)) -起估計的逆轉(zhuǎn)錄效率。（ACTB)表示肌動蛋 白信使RNA的擴(kuò)增，而（GAPDH)表示甘油醒3-憐酸脫氨酶的信使RNA的擴(kuò)增。實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)的溫度恰好在各柱狀體的上方顯示。
[0037]圖 3.示出了與RT0_WT* (0_WT)相比，突變體RTRT0_3M* (3M)，RT0_5M* 巧M)，RT0_ T69SSG_3M*(SG)和RT0_E478Q_3M*(3曲的錯配末端（G:T，G:G和G:A)的延伸效率。
[00測發(fā)明詳述
[0039] 逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶（RT)為有用的酶，例如其用于由信使RNA獲得互補(bǔ)DNA，當(dāng) 該DNA在擴(kuò)增時，可W克隆于載體中。理想的是用于該目的的RT具有較高的熱穩(wěn)定性，因?yàn)?在運(yùn)種條件下，RNA中的二級結(jié)構(gòu)的水平被降低，并且運(yùn)改良了擴(kuò)增過程。但是，RT為缺乏 校正核酸外切酶活性的酶，因此具有相對高的錯誤率；因此，對于用于所述目的的RT而言， 理想的是復(fù)制保真度提高。 W40] 由HIV-1M組B亞型（例如BH10或HXB。的RT與0組的RT之間存在序列同源性 開始，本發(fā)明根據(jù)保存在theProteinDataBank(作為文件IRTD(www.pdb.org))中的晶 體學(xué)結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了與模板-引物復(fù)合物結(jié)合的0組RT的分子模型。該結(jié)構(gòu)為唯一一個可 利用的，其中HIV-U在毒株HXB2的情況下）的RT顯示與雙鏈DNA(模板-引物）化及靠 近的核巧酸（在運(yùn)種情況下為dlT巧形成了Ξ元復(fù)合物。此外，運(yùn)是完整的結(jié)構(gòu)并具有良 好分辨率。由基于序列同源性的分子模式開始，在模板-引物與2種酶的相互作用中識別 了重要的位置。該信息用于設(shè)計對核酸具有較高的親和性的0組RT(RTO)的變體。因此， 通過定點(diǎn)誘變，本發(fā)明人得到HIV-1 0組RT的4種新的變體，命名為RT0_3M，RT0_5M，RT0_ T69SSG_3M,RT0_E478Q_3M，它們分別包含突變K358R/A359G/S360A,T355A/Q357M/K358R/ A359G/S360A,T69SSG/K358R/A359G/S360A和K358R/A359G/S360A/E478Q。
[0041] 根據(jù)與在W02010130864中所述的相似的程序，運(yùn)些酶可W在大腸桿菌中表達(dá)，并 純化用于隨后的表征。觀察到與0組的"野生型"RT(RT0_WT)相比，所述的4種酶在通過 RT-PCR的RNA擴(kuò)增反應(yīng)（定量（圖1)檢測和定性（圖2)檢測）中，在超過75°C的溫度下 都具有較高的DNA聚合酶活性。使用運(yùn)些酶實(shí)施的保真度檢測證明它們保持了相對于RT0_ WT的復(fù)制保真度（表2和3,圖3)。
[0042] 本發(fā)明設(shè)及由人類免疫缺陷病毒1型0組化IV-1)分離得到的且在一個或多個位 置具有修飾的RT，該RT比WT酶具有更高的熱穩(wěn)定性，從而保持了復(fù)制保真度；W及本發(fā)明 設(shè)及該RT實(shí)施模板核酸的逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)