一種新的檸檬苦素類化合物及其制備方法和治療前列腺癌的醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從黃皮的干燥葉中分離得到的一種具有治療 前列腺癌作用的檸檬苦素類化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃皮Clausenalansium(Lour. )Skeels屬蕓香科黃皮屬（Clausena)植物，別名黃 批、黃彈、黃皮子、黃彈子、黃檀子、黃壇子等。黃皮是原產(chǎn)于我國熱帶以及亞熱帶地區(qū)的一 種特產(chǎn)果樹，在我國至少已有1500年的栽培歷史。國內(nèi)主要分布于廣東、廣西、福建、臺灣、 云南、海南等地。在國外，印度、越南、泰國、斯里蘭卡、馬來西亞等東南亞國家以及美國的佛 羅里達(dá)州等地均有栽種。
[0003] 黃皮具有很高的藥用價值，黃皮的果、葉、根、種子均能入藥。黃皮的果實(shí)有行氣、 消食、化痰之功效，主治食積脹滿，脘腹疼痛，疝痛，痰飲，咳喘。根、葉及種子也可治腹痛、胃 痛、感冒發(fā)熱等癥。20世紀(jì)80年代，從黃皮葉片中分離得到黃皮酰胺類化合物，并發(fā)現(xiàn)該類 化合物具有較大的藥理活性。此后，對黃皮活性成分的分離以及藥理作用的研究在醫(yī)藥界 得到廣泛的關(guān)注。近年來，也有黃皮提取物對一些植物病原菌、農(nóng)業(yè)害蟲及雜草具有較高生 物活性的報道。
[0004] 黃皮化學(xué)成分結(jié)構(gòu)多樣，含有生物堿類、香豆素類、揮發(fā)油類、黃酮類等多種化學(xué) 成分，黃皮酰胺類化合物是黃皮中具有較強(qiáng)生理活性的一類重要生物堿。黃皮中的肉桂酰 胺類生物堿結(jié)構(gòu)較簡單，為苯丙烯酰胺類衍生物。咔唑類生物堿在黃皮中普遍存在。黃皮 含有的揮發(fā)油是多種類型成分的混合物，但其大多數(shù)屬于萜類化合物及其衍生物，少數(shù)為 脂肪族和芳香族化合物。黃皮中含有的黃酮是一類重要的天然抗氧化劑生理活性物質(zhì)，它 具有多種功能，如抗腫瘤作用；對血管的防護(hù)作用；較強(qiáng)的抗氧化活性和抗真菌活性等。
[0005] 現(xiàn)代研究表明黃皮具有明顯的降血糖、保肝、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡等多方面的藥理 作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種從黃皮的干燥葉中分離得到的一種具有治療前列腺癌 作用的檸檬苦素類化合物及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0009]
[0010] 所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將黃皮的干燥葉粉碎， 用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽 和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟（a) 中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用75%乙醇洗脫10 個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟（b)中75% 乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟（c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體 積比為25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟⑷中組分 2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫， 收集8~10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)。
[0011] 進(jìn)一步地，步驟（a)中，用80%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0012] 進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0013] -種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物（I)和藥學(xué)上可接受的 載體。
[0014] 所述的化合物（I)在制備治療前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 所述的藥物組合物在制備治療前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0017] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、 對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0018] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【附圖說明】
[0019] 圖1為化合物（I)結(jié)構(gòu)式；
[0020] 圖2為化合物（I)理論E⑶值與實(shí)驗(yàn)E⑶值比較；
[0021] 圖3為不同濃度化合物（I)作用72h后PC3和DU145存活率；
[0022] 圖4為10.Omg/L化合物（I)作用不同時間后PC3和DU145存活率。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0024] 實(shí)施例1 :化合物（I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0025] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0026] 制備方法：（a)黃皮的干燥葉（10kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提取（25LX3次）， 合并提取液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次）和水飽 和的正丁醇（3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（398g)和正丁醇 萃取物；(b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個 柱體積，再用75 %乙醇洗脫10個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫 物浸膏（163g) ;(c)步驟（b)中75 %乙醇洗脫浸膏用200-300目正相硅膠分離，依次用體 積比為85:1 (10個柱體積）、45:1 (9個柱體積）、20:1 (8個柱體積）、10:1 (8個柱體積）和 1:1 (5個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；(d)步驟（c)中組分3 (49g) 用200-300目正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1 (8個柱體積）、20:1 (10個柱體 積）和10:1 (5個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟（d)中組分 2 (31g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠0DS-C18分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶 液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)(44mg)。
[0027] 結(jié)構(gòu)確證：HR-ES頂S顯示[M+Na]+為m/z499. 3302,結(jié)合核磁特征可得分子式為 C30H4604,不飽和度為 8。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δH(ppm，DMS0-d6,400MHz) :H-1 (1. 04,ddd，J= 13. 4,12. 2,4· 2)，H-1(L59，m)，H-2(L51，m)，H-2(L56，m)，Η-3(3· 14，dd，J= 11. 2,4· 2)， H-5 (1. 22,m)，H-6 (2. 05,m)，H-6 (1. 88,dddd，J= 17. 8,12. 0, 3. 3, 2. 4)，H-7 (5. 18,dd，J =6. 4, 2. 9)，H-9 (2. 13,m)，H-ll(1. 48,m)，H-ll(1. 48,m)，H-12 (1. 61，m)，H-12 (1. 69,m)， H-15(l. 46,m)，H-15(l. 47,m)，H-16(l. 59,m)，H-16(l. 75,m)，H-17(2. 36,m)，H-18(0. 81， s)，H-19 (0· 77,s)，H-20 (2. 60,ddd，J= 12. 0,9. 0, 5. 8)，H-22 (2. 09,m)，H-22 (2. 29,m)， H-23(4.51，ddd，J= 10. 1，6·l，L8)，H-24(3. 18，d，J= 1.8)，H-26(1. 19，s)，H-27(1.25， s)，H-28(0.91，s)，H-29(0.84,s)，H-30(1.01，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δε(ρρπι，DMS0-d6， 125MHz) :36. 8 (CH2a_C)，27. 2 (CH2, 2-C)，78. 7 (CH，3-C)，38. 6 (C，4-C)，50. 3 (CH，5-C)， 23. 7 (CH2, 6-C)，117. 9 (CH，7-C)，144. 6 (C，8-C)，48. 4 (CH，9-C)，34. 6 (C，10-C)，17. 3 (CH2， 11-C)，30. 8(CH2,12-C)，43. 3(C，13-C)，50. 2(C，14-C)，33. 5(CH2,15-C)，23. 6(CH2,16-C)， 46. 5 (CH，17-C)，23. 1 (CH3, 18-C)，12. 7 (CH3, 19-C)，39. 9 (CH，20-C)，177. 7 (C，21-C)， 29. 2 (CH2, 22-C)，77. 0 (CH，23-C)，75. 6 (CH，24-C)，72. 1 (C，25-C)，26. 1 (CH3, 26-C)， 26. 2 (CH3, 27-C)，27. 2 (CH3, 28-C)，14. 3 (CH3, 29-C)，27. 1 (CH3, 30-C);碳原子標(biāo)記參見圖 1。13CNMR譜顯示有30個碳原子，包括七個甲基，八個亞甲基，八個次甲基（兩個含氧，一 個烯烴），七個季碳（一個酯羰基碳，一個烯烴碳，一個含氧季碳）。核磁數(shù)據(jù)表明該化合 物含有3-羥基和21-內(nèi)酯功能團(tuán)。HMBC譜中Η3-28(δΗ0. 91)和氏-29(5肌84)與含氧 次甲基碳（SC78. 7,C-3)，以及Η-20 (δΗ2. 60)與酯羰基（δC177. 7,C-21)的相關(guān)性驗(yàn)證 了上述推論。紅外波譜在1765cm1處出現(xiàn)強(qiáng)的吸收帶，證實(shí)了γ-內(nèi)酯環(huán)的存在，且排除 6或7元內(nèi)酯部分的可能性，因?yàn)樗鼈兊奈詹〝?shù)比1750cm1低。Η-3(δΗ3. 14,dd，J= 11.2,4. 2Hz)信號的分裂模式表明C-3-OH是β構(gòu)型。Η-7(δΗ5. 18，dd，J= 6. 4,2. 9Hz)， C-7(δC117. 9)和C-8(δC144. 6)的化學(xué)位移表明C-7和C-8之間存在雙鍵。此外，兩個 含氧碳信號[δC75. 6 (CH，24-C)和 72. 1 (C，25-C)]和氫質(zhì)子信號[δH3. 18 (d，J= 1. 8Hz， H-24)]的相關(guān)性表明該化合物含有一個24, 25-環(huán)氧基團(tuán)。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY 譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通 過E⑶試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致（圖2)。
[0028] 實(shí)施例2 :化合物（I)藥理作用試驗(yàn)
[0029] 一、材料和儀器
[0030] 前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3 (ArCC-CRL-1435)、前列腺癌細(xì)胞株DU145 (ATCC-HTB-81)?；?合物（I)自制，HPLC歸一化純度大于98%，用二甲基亞礬（DMS0)配制成濃度為1.0g/L 的儲存液備用。CCK-8試劑盒為