一種豆科植物根瘤固氮共生體固氮能力的快速評估方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豆科植物根瘤固氮共生體固氮能力的快速評估方法。
【背景技術】
[0002] 大氣中氮氣的比例占79%，但是所有的動植物W及大多數(shù)微生物都不能利用分子 態(tài)氮作為氮源，而所有的生命都需要氮。生物固氮是指微生物將氮還原為氨的過程。據(jù)聯(lián) 合國糧農組織（FAO) 1995年的粗略估計，全球每年由生物固氮作用固定的氮量接近2X 1〇6 噸，占全球植物需氮量的約3/4。根據(jù)固氮微生物與高等植物W及其他生物的關系，可W分 為H大類：自生固氮體系、共生固氮體系和聯(lián)合固氮體系。共生固氮是自然界最主要的固氮 體系，包括根瘤菌與豆科植物、弗蘭克氏菌與非豆科植物、固氮藍細菌與植物W及藍細菌與 真菌的共生體地衣等，其中根瘤菌與豆科植物的共生固氮最為突出。根瘤菌共生固氮是在 豆科植物根瘤共生組織中進行的生理過程，根瘤的固氮活性和固氮效率將直接決定了豆科 植物的生理特征。
[0003]豆科植物是我國重要的經濟作物。W大豆為例，大豆生長過程中，大豆植物與大豆 根瘤菌形成的固氮共生體是大豆氮源的主要攝取途徑，大豆根瘤固氮共生體固氮能力的強 弱直接影響著大豆的產量和品質，對大豆種植有著非常重要的指導意義。在此過程中，對大 豆根瘤固氮共生體中根瘤菌編碼的固氮酶活性的檢測，是評估其固氮能力的基礎指標。但 由于固氮酶本身不易提取且容易失活，另外受限于根瘤菌的生理特性，編碼固氮酶的相關 基因僅在共生狀態(tài)下進行表達，因此目前對于固氮效率的檢測多采用間接方法。
[0004]目前，1?同位素稀釋法是確定豆科植物和根瘤菌固氮共生體固氮能力的常用方 法，該方法檢測指標直接，但檢測周期長，并且需要提前施用同位素，所W不能用于田間檢 巧IJ，也不能做到實時檢測。因此，實際農業(yè)產生需要一種能夠快速低成本評估大豆根瘤固氮 共生體固氮能力的方法。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明提供一種豆科植物根瘤固氮共生體固氮效率的快速、實時評估豆科植物根 瘤固氮共生體系固氮能力的方法。
[0006] ni巧基因是根瘤菌固氮酶的結構基因，存在于nif基因簇，其編碼產物是固氮酶 的結構組分，nif基因是固氮的關鍵基因。
[0007] 本發(fā)明通過提取根瘤總RNA，再將mRNA逆轉錄成cDNA，英光定量PCR檢測利用 ni巧基因的表達豐度的檢測，可W分析不同環(huán)境中豆科植物根瘤固氮共生體中固氮酶基因 的轉錄效率，進而間接評估不同實驗或田間條件下的豆科植物與根瘤菌的共生固氮效率的 變化。
[000引
【發(fā)明內容】
包括：
[0009] -種豆科植物根瘤固氮共生體系固氮能力的快速評估方法，包括：
[0010] 一；植物-根瘤菌轉錄本信息共提取；（1)設定對照組和待測組，對照組和待測組 分別由一個或兩個W上樣本組成，分別提取各樣本根瘤總RNA; (2)用分光光度計分別檢測 各樣本中提取的總RNA，得到總RNA的濃度和質量；
[0011]二：固氮酶基因轉錄水平原位檢測；（1)分別將對各樣本的mRNA反轉錄成CDNA; (2)分別用英光定量PCR方法轉錄各樣本的固氮酶ni巧基因和參比基因16s，并用2AAEt方法計算待測組相對于對照組，固氮酶nifH基因的相對轉錄豐度；
[0012] H;W固氮酶基因ni巧的相對轉錄豐度來評估大豆根瘤固氮共生體的固氮能力。
[0013] 所述樣本取自一株或兩株W上相同品種豆科植物。同組樣本中，豆科植物處于相 同生長環(huán)境下；組間樣本中，豆科植物生長環(huán)境不同
[0014] 具體而言包括如下步驟：
[0015] (1)設定對照組及待測組，分別取對照組及待測組內各個樣本的新鮮根瘤 50-200mg，在液氮中研磨成細粉狀，立即加入RNA提取液l-2ml，繼續(xù)研磨成勻漿；
[0016] (2)將勻漿l-2ml轉移到離必管中，加入200-400U1氯仿，混勻；
[0017] (3)加入50-100ulRNase-free(1地2〇 及50-200U1氯仿，混勻，離必5-20分鐘， 4°C，12,000Xg-16,000X邑；
[0018] (4)將600u^800ul上清液轉移到RNase-化ee離必管中，加入等體積的異丙醇，混 勻，離必 5-20 分鐘，12, 000Xg-16, 000Xg，棄上清；
[0019] (5)加入l-2ml70-80%己醇，混勻，6000Xg-8000Xg離必4-7分鐘，倒出液體，留 沉淀；
[0020] (6)加入 30-lOOulRNase-freed地2〇,混勻；
[0021] (7)分光光度計分別測定各樣本的RNA濃度和質量，并用RNase-化ee(1地2〇將各 樣本稀釋成同樣濃度；（第一，檢測RNA質量是否可W進行后續(xù)實驗，第二，確定RNA濃度方 便后續(xù)反轉錄實驗統(tǒng)一RNA質量）
[002引 做獲得的RNA進行反轉錄，將mRNA逆轉錄成cDNA;
[002引 （9)采用英光定量PCR(Real-timePCR)，WCDNA為模板分別擴增個樣本的固氮酶 基因ni巧和參比基因16s;
[0024] (10)根據(jù)Real-timePCR得到的Ct值，用2AAEt方法計算分析待測組相對于對 照組，固氮酶基因ni巧的相對轉錄豐度；
[002引 （11)Wni巧基因的相對轉錄豐度來評價固氮能力，當相對轉錄豐度為1時，表 明待測組相對于對照組，固氮能力相同；當相對轉錄豐度低于1時，表明待測組相對于對照 組，固氮能力低；當相對豐度大于1時，表明待測組相對于對照組，固氮能力高。
[0026] 步驟（1)中，取新鮮根瘤lOOmg，RNA提取液為TrizolA+,加入量為Iml;步驟（2) 中，將勻漿Iml轉移到化aseLockGel管，加入400ul氯仿，混勻。
[0027] 步驟（2)和步驟（3)中，所述混勻后，將勻漿分別冰上放置5-20和3-7分鐘，氯仿 加入量分別為400ul和200ul。
[002引步驟做和步驟（4)中，所述離必為4。12, 000Xg,離必15分鐘。
[0029] 步驟巧）中75 %己醇加入量為1ml，所述離必為4。7500Xg,離必5分鐘。
[0030] 步驟化）中室溫放置2-3分鐘后，加入30ulRNase-freed地2〇。
[0031]步驟（8)中逆轉錄反應體系為30ul反應體系，由下列成分組成：
[0032] 成分 用豐 5PrIftierScript#Buffer(forRealTlrae) 6ul PrimerScrlPU臣RT' MixlI.. 5uI Random6niers(IOOuM) '2.Oul RNA鶴板 15OOng (加、陵積報據(jù)最終濃度嫉算）RNase-freeddH20 樸盤 3OuI
[0033]PCR擴增條件為；37°c，45min-60min;85°C，5s〇
[0034] 步驟（9)中英光定量PCR方法采用相對定量方法，內參基因選擇16S，目標基因為 固氮酶結構基因ni巧；反應體系為25ul反應體系，由下列成分組成：
[0035] 成分 屬疊 SYBR^ Fremix Ex TaqM 12. Syl Primer F ( l.Opniol/ aU I.uI P I: I打]e r R U 0 pmo! / U .0 1 ii I ClMA模據(jù)猶釋M裕加U!.l 淑恥0 9, 5ul
[0036]Real-timePCR擴增條件為；94°C變性 5min，94°C變性 30sec，58°C退火Imin，72°C 延伸Imin，共40個循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。
[0037] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0038] 1)操作步驟簡單、方便，全部操作分析過程可在一個工作日內完成；
[0039] 2)通過修改RNA提取過程中各類試劑的添加量，提取得到的植物-根瘤總RNA質 量較高，可W從圖1中看出，RNA濃度達到lOOOng/ulW上，A260/A280在1.8-2. 0之間。
[0040] 3)通過調整整合RNA提取W16S基因的轉錄豐度為參比對照，通過計算基因轉 錄豐度的比率，反轉錄及實時英光定量PCR方法可W準確穩(wěn)定的評估，最終可W達到檢測 ni巧基因的轉錄水平來指示根瘤固氮豆科植物共生體固氮能力效率的變化，從圖3和圖4 中可W看出，本發(fā)明針對ni巧基因轉錄變化的檢測分析結果和同位素稀釋法檢測分析的 共生固氮酶活性變化的結果表現(xiàn)一致。
[0041] 4)本方法適合用于田間快速、實時評估±壤環(huán)境干預下（農藥或污染物等）豆科 植物根瘤固氮共生體固氮能力的變化。
【附圖說明】
[0042] 圖1為分光光度計檢測總RNA的結果圖；
[004引圖2是英光定量PCR的擴增曲線（左）和烙解曲線（右）圖；
[0044] 圖3是氯嚼礙隆脅迫處理下固氮酶基因ni巧的表達效率變化圖；
[0045] 圖4是用穩(wěn)定同位素1?稀釋法檢測的氯嚼礙隆脅迫處理下共生根瘤固氮酶活性 的變化。
【具體實施方式】
[0046] 本發(fā)明所述參數(shù)組合是經過實驗設計優(yōu)化而得，與現(xiàn)有提取方法相比，可W用較 少的根瘤樣本巧Omg即可），W相對較短的時間，提取出質量較高的RNA樣本。W下實施例 用于進一步說明本發(fā)明，但發(fā)明不限于實施例。
[0047] 實施例1 ;
[0048] 本實驗原位檢測根瘤菌固氮酶基因的表達效率，并評估固氮能力的方法按W下步 驟進行：
[0049] 對照組；無菌歴石盆栽實驗；
[0050] 待測組；與對照組相同的無菌歴石盆栽實驗，分別加入氯嚼礙隆除草劑A)正常田 間用量（20ug/kg)、B)5倍田間用量（100ug/kg)、C)25倍田間用量巧OOug/kg)。
[0051] 每組包括3個樣本，每個樣本取自3株大豆植株。
[0052] 每個樣本取大豆根瘤lOOmg，用自來水沖洗干凈后，立即放入液氮制冷；研鉢和 梓于12rC滅菌20min，烘干，研磨前用液氮預冷；研磨成細粉狀時，立即加入RNA提取液 TrizolA+lml，繼續(xù)研磨成勻漿
[0053] (1)將Iml勻漿轉移到離必管中（離必管用前12,OOOXg離必30s)，冰上放置15 分鐘后，加入200--400U1，如300ul氯仿，上下顛倒混勻；
[0054] 似加入75ulRNase-freed地2〇及IOOul氯仿，顛倒混勻，冰上放置5分鐘后， 4°C，12, 000Xg離必5-20分鐘，如15分鐘，；
[00巧](3)將700ul上清液轉移到新的RNase-化ee離必管中，加入等體積的異丙醇，上下 顛倒混勻，冰上放置20-30分鐘，離必5-20分鐘，如15分鐘，