一種活性多肽及其在植物根部發(fā)育中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種活性多肽及其在植物根部發(fā)育中的應(yīng)用。具體地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一種新的分離的多肽及其前體，所述多肽從N’端到C’端依次為：Y、I、Y、T、N。本發(fā)明還提供了所述多肽的衍生物及其前體。所述的活性小肽具有種屬特異性，并參與植物根部的發(fā)育，能促進(jìn)擬南芥根部的增長(zhǎng)，增加側(cè)根的形成，對(duì)豆科植物根瘤的形成具有促進(jìn)作用。
【專利說(shuō)明】一種活性多肽及其在植物根部發(fā)育中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生理學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種活性多肽及其在植物根部發(fā)育中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]根是植物在長(zhǎng)期適應(yīng)陸地生活過(guò)程中發(fā)展起來(lái)的器官，擔(dān)負(fù)著吸收水分和溶質(zhì)以及使植物固著在基質(zhì)上的作用?？諝庵写嬖谥罅康姆肿討B(tài)的氮?dú)?，它們約占空氣成分的80%。據(jù)估計(jì)，在整個(gè)大氣層中，約有4X1015t的分子態(tài)氮。然而，絕大多數(shù)的植物只能從土壤中吸收結(jié)合態(tài)氮，用來(lái)合成自身的含氮化合物(如蛋白質(zhì)等)。土壤中的含氮化合物，不是土壤本身固有的，而是在生物生命活動(dòng)過(guò)程中逐漸積累起來(lái)的，其中很大一部分來(lái)自微生物的生物固氮。據(jù)估計(jì),地球表面上每年生物固氮的總量約為10t，其中豆科植物體內(nèi)根瘤菌的固氮量約為55t，占生物固氮總量的55%左右。根瘤是在植物根系上生長(zhǎng)的一種特殊的瘤，是寄生組織中建成共生的固氮細(xì)菌形成的，植物的根瘤可以合成自身的含氮化合物，如蛋白質(zhì)等。
[0003]根瘤的形成過(guò)程大致為:聚集在根毛頂端的根瘤菌分泌一種纖維素酶，這種酶將根毛細(xì)胞壁溶解掉，根瘤菌從根毛尖端侵入根的內(nèi)部，產(chǎn)生感染絲，根瘤菌不斷地進(jìn)入根毛，并且大量繁殖，在根瘤菌侵入的刺激下，根細(xì)胞分泌一種纖維素，將感染絲包圍起來(lái)，形成一條分枝或不分枝的纖維素鞘，叫做侵入線，侵入線不斷地延伸，直到根的內(nèi)皮層，根的內(nèi)皮層處的薄壁細(xì)胞，受到根瘤菌分泌物的刺激，產(chǎn)生大量的皮層細(xì)胞，從而使該處的組織膨大,最后形成根瘤。
[0004]根瘤菌的固氮作用是在常溫、常壓下進(jìn)行的。根瘤固氮具有固氮效率高、無(wú)污染、成本低、收益高等優(yōu)點(diǎn)。根瘤菌的固氮能力，不僅取決于土壤條件和農(nóng)業(yè)措施，也取決于植物品種，人工培養(yǎng)的一些根瘤菌品系的固氮能力往往比野生品系的固氮能力高幾倍。
[0005]本領(lǐng)域目前還沒(méi)有找到一種可以直接應(yīng)用的影響植物根部發(fā)育特別是影響植物根瘤形成的基因或活性物質(zhì)。因此迫切需要進(jìn)行影響農(nóng)業(yè)植物尤其是豆科植物的根部發(fā)育的研究及開(kāi)發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的就是提供一種新的植物磺酸化肽及其在植物根部發(fā)育中的應(yīng)用。
[0007]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的活性多肽，所述的活性多肽任選自下組:
[0008](I)從N，端到C，端依次為Y、1、Y、T、N的多肽；
[0009](2)上述(I)中多肽的衍生物；
[0010](3)上述(I)中多肽或⑵中多肽的衍生物的前體。
[0011]在另一優(yōu)選例中，所述的活性多肽來(lái)源于植物，較佳地來(lái)源于豆科植物。
[0012]在另一優(yōu)選例中，(2)中所述的衍生物為磺酸化衍生物。[0013]在另一優(yōu)選例中，所述多肽的磺酸化位點(diǎn)為酪氨酸殘基(Y);較佳地，所述多肽的2個(gè)酪氨酸殘基都被磺酸化。 [0014]在本發(fā)明的第二方面，提供了編碼第一方面所述活性多肽的多核苷酸。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸為如SEQ ID N0.: 11_20任一所示的多核苷酸。
[0016]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種含有本發(fā)明第二方面所述多核苷酸的載體。
[0017]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明的第三方面所述的載體，或其基因組中整合有本發(fā)明的第二方面所述的多核苷酸。
[0018]在本發(fā)明的第五方面，提供了第一方面所述活性多肽，或第二方面所述多核苷酸的用途，所述用途選自下組的一種或多種:
[0019](a)用于調(diào)節(jié)植物側(cè)根數(shù)目；
[0020](b)用于調(diào)節(jié)植物根的長(zhǎng)度；
[0021](c)用于調(diào)節(jié)豆科植物根瘤的形成。
[0022]在本發(fā)明的第六方面，提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括步驟:
[0023]將編碼第一方面所述活性多肽的多核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞中，培養(yǎng)所述植物細(xì)胞，再生成植物。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸為序列如SEQ ID N0.:11_20任一所不的多核苷酸。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的植物為豆科植物，較佳地任選自:大豆、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、百脈根、木豆、豌豆、蠶豆、紅豆、綠豆、田菁等。
[0026]在本發(fā)明的第七方面，提供了一種制備第一方面所述活性多肽的方法，所述方法任選任自下組:
[0027](I)培養(yǎng)第四方面所述的宿主細(xì)胞，收集獲得第一方面所述的活性多肽；
[0028](2)人工化學(xué)合成第一方面所述的活性多肽；
[0029](3)從含有第一方面所述活性多肽的植物組織或器官中提取所述的活性多肽。
[0030]在另一優(yōu)選例中，(3)中所述的植物為豆科植物,較佳地任選自:大豆、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、百脈根、木豆、豌豆、蠶豆、紅豆、綠豆、田菁等。
[0031]在另一優(yōu)選例中，(3)中所述的植物器官為根或根瘤。
[0032]在本發(fā)明的第八方面，提供了一種改良植物性狀的方法，所述的植物性狀選自下組:
[0033](a)增加植物側(cè)根數(shù)目；
[0034](b)增加植物根的長(zhǎng)度；
[0035](C)促進(jìn)豆科植物根瘤的形成，
[0036]包括步驟:提高所述植物中第一方面所述活性多肽或其或其編碼基因的表達(dá)水平。
[0037]在另一優(yōu)選例中，所述植物中第一方面所述活性多肽的表達(dá)水平提高10%以上，較佳地提高30%以上，更佳地提高50%以上，更佳地提高70%以上，更佳地提高90%以上，最佳地提高100%以上。
[0038]在本發(fā)明的第九方面，提供了一種方法，所述的方法任選自下組:
[0039](a)增加植物側(cè)根數(shù)目的方法；[0040](b)增加植物根的長(zhǎng)度的方法；
[0041](c)促進(jìn)豆科植物根瘤的形成的方法，
[0042]包括步驟:向所述的植物施用本發(fā)明第一方面所述的活性多肽。
[0043]在另一優(yōu)選例中，所述活性多肽的施用濃度為0.1-1000 μ Μ，較佳地10 μ Μ。
[0044]在另一優(yōu)選例中，將第一方面所述的活性多肽與所述的植物(優(yōu)選植物根部)接觸。
[0045]在另一優(yōu)選例中，(a)或(b)中所述的植物為:擬南芥、水稻、或煙草。
[0046]在另一優(yōu)選例中，(C)中所述的豆科植物為大豆、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、百脈根、木
豆、豌豆、蠶豆、紅豆、綠豆、田菁等。
[0047]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0048]下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明范圍。
[0049]圖1顯示NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)編碼基因的組成和結(jié)構(gòu)。
`[0050]圖2顯示大豆、蒺藜苜蓿和百脈根中NGF小肽(￥603)1￥(503)了幻編碼基因的表達(dá)結(jié)果；其中，圖2A顯示大豆中NGF編碼基因在根毛、根系和根瘤中表達(dá)，其中在根瘤中表達(dá)量最高；圖2B顯示在蒺藜苜蓿中，NGF編碼基因在根瘤中特異表達(dá)；圖2C顯示百脈根中NGF編碼基因在根系、葉和根瘤中表達(dá)，其中在根瘤中表達(dá)量最高；圖2D顯示，百脈根中NGF編碼基因在根系中的表達(dá)受根瘤菌誘導(dǎo)。
[0051]圖3顯示蒺藜苜蓿中NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)編碼基因擾亂后的結(jié)瘤測(cè)試結(jié)
果O
[0052]圖4顯示NG F小肽(Y(S03) IY(S03)TN)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。
[0053]圖5顯示了在擬南芥(A)、大豆根瘤(B)、百脈根根瘤(C)、紫花苜蓿根瘤(D)、煙草(E)、水稻(F)中NGF的含量，G為化學(xué)合成的NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)。
[0054]圖6顯示苜蓿不同組織(A，蒺藜苜蓿的花器官；B，蒺藜苜蓿的葉子；C，紫花苜蓿的葉子；D，紫花苜蓿根瘤；E，蒺藜苜蓿的果莢；F，紫花苜蓿的根系；G，紫花苜蓿的莖)的NGF小肽(Y (S03) IY (S03) TN)含量的分析結(jié)果。
[0055]圖7顯示NG小肽(Y(S03) IY(S03) TN) F對(duì)擬南芥根系生長(zhǎng)的影響結(jié)果。
[0056]圖8顯示NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)對(duì)百脈根和蒺藜苜蓿結(jié)瘤的影響。
[0057]圖9顯示NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)對(duì)擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)目的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0058]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，具體地，發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)一種新的活性多肽，所述多肽從N’端到C’端依次為Y (Tyr)、I (lie)、Y (Tyr), T (Thr),N (Gln);本發(fā)明還包括所述多肽的衍生物及其前體；所述的活性多肽具有種屬特異性，并參與植物根部的發(fā)育，能促進(jìn)擬南芥根部的增長(zhǎng)，增加側(cè)根的形成，對(duì)豆科植物根瘤的形成具有促進(jìn)作用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0059]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的小肽”，“本發(fā)明的活性多肽”，或“本發(fā)明的多肽”可以互換使用，都是指N’端到C’端依次為Y、1、Y、T、N的小肽，其中，所述的Y為Tyr，I為He，T 為 Thr，N 為 Gin。
[0060]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的多肽衍生物”或“本發(fā)明的小肽衍生物”可以互換使用，都是指本發(fā)明的具有YIYTN結(jié)構(gòu)的多肽的衍生物；較佳地為磺酸化衍生物；磺酸化位點(diǎn)優(yōu)選酪氨酸殘基；更優(yōu)選地，小肽中的所有酪氨酸殘基都被磺酸化。
[0061]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“NGF小肽”是指結(jié)構(gòu)為(Y(S03)IY(S03)TN)的磺酸化小肽。
[0062]本發(fā)明還包括上述多肽(或其衍生物)的前體。
[0063]例如:在部分種屬中，NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)前體的氨基酸序列見(jiàn)下:
[0064]>GmNGFlab
[0065]MRLSKPTLLL FLVFIFTTVQ GQAVTNERVV GSESVVSFEL RRSGGCEKQG FEYREGNGGL 60
[0066]EDTVLENEDY IYTNSLP77
[0067](SEQ ID N0.:1)
[0068]>GmNGF2
[0069]MRLSKPALLL FLVF IFTVVQ GQAVTNERVV CSKSSTTVRR SGGCEKQGFE YKEGNGGLED 60
[0070]TVLENEDYIY TNFLP75
[0071](SEQ ID N0.:2)
[0072]>LjNGF
[0073]MKLLKPALFL CLVSIFIVVY VVQREAVTNE QVAGGASQSS VTVKRSGCEK QGFECKEGSG 60
[0074]GSQDTVLENE DYIYTNSLP79
[0075](SEQ ID N0.:3)
[0076]>MtNGFl
[0077]MRLSKPTLIL FVFFIFTVTC VVQMEAVINE RVVDAGSGSS SVNVVRRGEC EKQGVECKQV 60
[0078]NGGNEDNDLE SEDYIYTNSV LP82
[0079](SEQ ID N0.:4)
[0080]>PsNGF
[0081]RVVKGGGSGS NSTTVVVRRG ECEKQGVECE KENGENEETD LENEDYIYTN SVLP54
[0082](SEQ ID N0.:5)
[0083]>CcNGFl
[0084]MRLSKPALLL FRRGGCEKQG VECKEGNGGL EDTVLENEDY IYTNSLP47
[0085](SEQ ID N0.:6)
[0086]>CgNGF
[0087]GRAQSKYHEV FETRFFLFLV FCYLTFVSEG KSDTTESFVG SGGASANEGR AECGQGDVEC 60
[0088]KEGSRGSADN LFENEDYIYT NSLP 84
[0089](SEQ ID N0.:7)
[0090]>QpNGF
[0091]NEFSRLAFLL TLAFIYYLIF VAQGKADTNE LLVGSAGTSV NEGRAECSKD AVECKEGNGG 60
[0092]SEENAYENED YIYTNSLP 78[0093](SEQ ID N0.:8)
[0094]>VvNGF
[0095]MRFSGPYMFL FLAFFFYLVF AIQGKEDTNG VTRRKVLSAE KEMEEQKSVF ESEDYIYTNS 60
[0096]LP62 [0097](SEQ ID N0.:9)
[0098]>CsNGF
[0099]MQGRAECGKE QNVECKKRSD QEDDVFEDED YIYTNSLP38
[0100](SEQ ID N0.:10)
[0101]其中，Gm表不 Glycine max (大豆)，Lj 表不 Lotus japonicus (百脈根)，Mt 表不Medicago truncatula (蔡藜苜猜)，Ps 表不 Pisum sativum (豌豆)，Ce 表不 Cajanus cajan(木豆)，Cg 表示 Casuarina glauca (木麻黃)，Qp 表示 Quercus petraea (無(wú)?；?，Vv 表不 Vitis vinifera (葡萄)，Cs 表不 Cannabis sativa (大麻)。
[0102]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和蛋白是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或蛋白如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的?！胺蛛x的多肽”是指所述的小肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它肽、脂類、糖類或其它物質(zhì)。
[0103]本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用常規(guī)方法，如標(biāo)準(zhǔn)的小肽純化技術(shù)純化。基本上純的小肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶，其純度能用氨基酸序列分析。
[0104]本發(fā)明的活性多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主。
[0105]修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))的形式包括:體內(nèi)或體外的化學(xué)衍生形式如乙?；?、羧基化、糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。
[0106]活性多肽的編碼序列
[0107]本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明活性多肽的多核苷酸，所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0108]術(shù)語(yǔ)“編碼本發(fā)明活性多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽或其衍生物的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列(如信號(hào)肽序列)的多核苷酸。
[0109]本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。
[0110]本發(fā)明的核苷酸序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段?？梢酝耆ㄟ^(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明的小肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外,還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明的小肽序列中。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開(kāi)的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。
[0111]在部分種屬中，編碼NGF小肽(Y (S03) IY (S03) TN)的CDS序列如下:
[0112]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的活性多肽，其特征在于，所述的活性多肽任選自下組:(1)從N’ 端到 C，端依次為 Y (Tyr), I (He)、Y (Tyr), T (Thr), N (Gln)的多肽； (2)上述(I)中多肽的衍生物； (3)上述(I)中多肽或(2)中多肽的衍生物的前體。
2.如權(quán)利要求1所述的活性多肽，其特征在于，(2)中所述的衍生物為磺酸化衍生物。
3.編碼權(quán)利要求1所述活性多肽的多核苷酸。
4.一種含有權(quán)利要求3所述多核苷酸的載體。
5.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求4所述的載體，或其基因組中整合有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
6.權(quán)利要求1所述活性多肽，或權(quán)利要求3所述多核苷酸的用途，其特征在于，所述用途選自下組的一種或多種: (a)用于調(diào)節(jié)植物側(cè)根數(shù)目； (b)用于調(diào)節(jié)植物根的長(zhǎng)度； (C)用于調(diào)節(jié)豆科植物根瘤的形成。
7.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，包括步驟: 將編碼權(quán)利要求1所述活性多肽的多核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞中，培養(yǎng)所述植物細(xì)胞，再生成植物。
8.一種制備權(quán)利要求1所述活性多肽的方法，其特征在于，所述方法任選任自下組: (1)培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，收集獲得權(quán)利要求1所述的活性多肽； (2)人工化學(xué)合成權(quán)利要求1所述的活性多肽； (3)從含有權(quán)利要求1所述活性多肽的植物組織或器官中提取所述的活性多肽。
9.一種改良植物性狀的方法，所述的植物性狀選自下組: (a)增加植物側(cè)根數(shù)目； (b)增加植物根的長(zhǎng)度； (C)促進(jìn)豆科植物根瘤的形成， 其特征在于，包括步驟:提高所述植物中權(quán)利要求1所述活性多肽或其或其編碼基因的表達(dá)水平。
10.一種方法，所述的方法任選自下組: (a)增加植物側(cè)根數(shù)目的方法； (b)增加植物根的長(zhǎng)度的方法； (C)促進(jìn)豆科植物根瘤的形成的方法， 其特征在于，包括步驟:向所述的植物施用權(quán)利要求1所述的活性多肽。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103570805SQ201210279537
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月7日
【發(fā)明者】羅利, 李曉琳, 徐霽 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院